La apocinina mejora el daño de los testículos inducido por el glutamato monosódico por la alteración de la barrera hematotesticular y los parámetros de estrés oxidativoⅠ

Abstracto:

Antecedentes: este estudio tuvo como objetivo investigar los efectos de la apocinina (APO) en los niveles hormonales, la barrera hematotesticular y los biomarcadores oxidativos en la degeneración testicular inducida por glutamato monosódico (MSG). Métodos: Se distribuyeron aleatoriamente ratas macho Sprague Dawley (150-200 g; n=32) en cuatro grupos: control, APO, MSG y MSG más APO. A los grupos MSG y MSG más APO se les administró MSG (120 mg/kg) durante 28 días.

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Además, los grupos APO y MSG más APO recibieron APO (25 mg/kg) durante los últimos cinco días del experimento. Todas las administraciones fueron por sonda oral. Finalmente, se realizaron análisis bioquímicos basados ​​en la determinación de testosterona, hormona estimulante del folículo (FSH), hormona luteinizante (LH), malondialdehído (MDA), glutatión (GSH) y superóxido dismutasa (SOD), así como luz y transmisión. Se evaluaron exámenes microscópicos electrónicos, evaluación de parámetros espermáticos, ZO-1, ocludina, NOX-2 e inmunohistoquímica TUNEL.

Resultados: el MSG aumentó tanto el nivel de estrés oxidativo como la apoptosis, disminuyó la proliferación celular y provocó la degeneración de la morfología testicular, incluida la barrera hematotesticular. La administración de apocinina revirtió todos los parámetros morfológicos y bioquímicos deteriorados en el grupo MSG más APO. Conclusiones: se considera que la apocinina previene la degeneración testicular al mantener la integridad de la barrera hematotesticular con niveles hormonales y oxidantes/antioxidantes equilibrados.

Palabras clave: glutamato monosódico; apocinina; NOX-2; barrera hematotesticular; ultraestructura

1. Introducción

El ácido L-glutámico ampliamente utilizado, como aditivo, se encuentra naturalmente en una variedad de alimentos y es la fuente del potenciador del sabor, el glutamato monosódico (MSG) [1]. Muchos alimentos procesados ​​contienen glutamato monosódico como aditivo, con una ingesta diaria promedio en las naciones industrializadas europeas de 0.3 a 1.0 g. [2]. Aunque las organizaciones de seguridad alimentaria consideran seguro el consumo de MSG, todavía se cuestiona en varios estudios preclínicos y clínicos, especialmente su exposición a largo plazo. Entre las funciones fisiológicas del glutamato se encuentra su propiedad de neurotransmisor en el sistema nervioso central, como precursor de metabolitos como el glutatión [1].

Se ha demostrado que el consumo a largo plazo de glutamato monosódico tiene efectos negativos en el sistema reproductivo masculino. Los estudios han demostrado que el consumo a largo plazo de MSG disminuye el conteo de espermatozoides en los hombres y afecta la estructura morfológica de los espermatozoides y los testículos [3]. La mayoría de las investigaciones citadas anteriormente se centraron principalmente en la toxicidad del glutamato monosódico en ratas en dosis de 2000 a 8000 mg/kg de peso corporal, lo que es extremadamente improbable para los seres humanos a este nivel [4].

Conversión alométrica por Shin et al. [5] demostraron que esta dosis era equivalente a 120 mg/kg de peso corporal en ratas. Hay una cantidad significativa de receptores de glutamato en los órganos reproductivos y el esperma, lo que los hace susceptibles al daño por excitación debido al exceso de glutamato en el cuerpo. Esto hace que el sistema reproductivo sea un objetivo frecuente del daño inducido por el glutamato. Además, se sabe que la toxicidad del glutamato daña directamente el eje hipotalámico-pituitario-gonadal, lo que lleva a un desequilibrio homeostático en la reproducción [6].

El MSG ha resultado en daño oxidativo (aumento de la peroxidación de lípidos y disminución de las actividades de las enzimas antioxidantes) y cambios espermatogénicos manifestados por un bajo recuento de espermatozoides y anomalías morfológicas [3]. Por lo tanto, estudiamos los efectos del consumo oral de MSG en ratas cuando ingirieron una dosis moderada extrapolada directamente de la ingesta diaria en humanos. Este efecto de la dosis de MSG en la morfología testicular de rata también se observó en estudios experimentales [3,7].

La sobreproducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) desencadena el estrés oxidativo y la apoptosis. Debido a sus estructuras reactivas, los radicales libres pueden interactuar con los lípidos, los ácidos nucleicos y las proteínas y tener efectos nocivos en el cuerpo [8]. Se sabe que el estrés oxidativo, inducido por ROS, juega un papel importante en la infertilidad masculina [9]. Los estudios han demostrado que la NADPH oxidasa (NOX) es una de las principales fuentes de ROS [10]. El exceso de ROS y el estrés oxidativo en el sistema reproductivo masculino provocan cambios negativos en la concentración, motilidad y morfología de los espermatozoides. Los espermatozoides degenerados y los parámetros deteriorados del semen conducen a la infertilidad [11]. ROS causa infertilidad masculina debido al daño en el ADN de los espermatozoides [12]. El estrés oxidativo compromete la integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides e induce una capacitación temprana.

Como resultado, la capacidad de fertilización de los espermatozoides disminuye y se produce la infertilidad [13]. Se sabe que la apocinina (APO), extraída de las raíces de la planta Apocynum cannabinum, es eficaz como inhibidor de NOX [14]. El efecto antiinflamatorio de la APO se ha demostrado en muchos estudios experimentales [15]. La activación de NOX ocurre a través de la migración de componentes citosólicos a la membrana celular [16,17]. APO actúa como un inhibidor selectivo de la producción de ROS al actuar sobre la actividad de NOX en los neutrófilos humanos activos.

Sin embargo, la APO no afecta la fagocitosis ni otros mecanismos de muerte intracelular [18,19]. Las isoformas de NOX se expresan en varias células y tienen diferentes funciones fisiológicas. NOX-2 es una isoforma de NOX, que está presente en eosinófilos, macrófagos y neutrófilos [20]. Las células espermatogénicas están conectadas y las células de Sertoli. Esta relación dinámica está regulada por uniones estrechas y uniones comunicantes [21]. Las uniones estrechas entre las células de Sertoli son importantes para la formación y el funcionamiento de la barrera hematotesticular (BTB).

La estructura de la BTB incluye uniones estrechas, desmosomas, especializaciones ectoplasmáticas basales y uniones comunicantes. Las uniones estrechas de origen epitelial son especializaciones de membranas multimoleculares que contienen múltiples proteínas integrales de membrana, como zonula occludens-1 (ZO-1) y ocludina [21]. Las ocludinas son una de las moléculas que contribuyen a la formación de uniones estrechas. Las proteínas Zonula occludens como zonula occludens-1 (ZO-1), ZO-2 y ZO-3 son proteínas importantes involucradas en esta estructura. La ocludina, ZO-1 y ZO-3 interactúan con el citoesqueleto de actina. La proteína ZO-3 está asociada con los dominios citoplasmáticos de ZO-1 y ocludina [22].

El estrés oxidativo ocurre cuando no hay suficientes antioxidantes contra los radicales libres. Una disminución en la actividad de las enzimas antioxidantes, como los niveles de superóxido dismutasa (SOD) y glutatión (GSH), conduce a un aumento del daño oxidativo [23]. El malondialdehído (MDA), un parámetro del daño de la membrana celular, indica la densidad del ataque de los radicales de oxígeno en las células reactivas y el metabolismo de los radicales libres in vivo. La disminución de SOD y el aumento de MDA desencadenan estrés oxidativo y causan daño celular, lo que resulta en la muerte celular [24]. Los estudios indicaron NOX-2 como la fuente de ROS [20,25]. APO, un potente inhibidor de NOX-2 [26], podría ser eficaz en la inhibición de NOX-2 para prevenir el daño tisular debido al estrés oxidativo.

La administración de APO podría tener un efecto curativo sobre los parámetros de estrés oxidativo y daño histopatológico. Este estudio tuvo como objetivo evaluar los efectos del MSG sobre el daño del tejido testicular, la proliferación celular, la apoptosis y el estrés oxidativo indicado por la expresión de NOX-2 y sobre la barrera hematotesticular. Además, el estudio tuvo como objetivo investigar si la apocinina puede mejorar los efectos sobre todos estos parámetros.

2. Materiales y métodos

2.1. Diseño experimental

Este estudio experimental fue aprobado por el Comité de Ética de Animales Experimentales de la Universidad Acibadem Mehmet Ali Aydinlar (ACU-HADYEK, Número de aprobación: HDK2020/39). En este estudio, ratas albinas macho Sprague Dawley de 8-semanas de edad (n=32) se mantuvieron en jaulas con una temperatura de 22 ± 2 ◦C y una luz/oscuridad estándar (12:12 h) ciclo. Las ratas fueron alimentadas con alimento estándar para animales ad libitum durante 28 días del período experimental. Esta investigación se llevó a cabo según las pautas y regulaciones de ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). En este estudio, ratas macho Sprague Dawley (n=8 en cada grupo) se dividieron aleatoriamente en 4 grupos de control, APO, MSG y MSG más APO. Se administró agua destilada (1 ml) al grupo de control de ratas por sonda oral durante 28 días. A los grupos MSG y MSG más APO se les administró 120 mg/kg de MSG por sonda oral durante 28 días consecutivos [4]. A los grupos APO y MSG más APO se les administró 25 mg/kg de APO por sonda oral en los últimos 5 días del experimento [27]. Los pesos de las ratas de los grupos experimentales se analizaron semanalmente. Después de la anestesia con isoflurano, las ratas se sacrificaron. Se utilizaron muestras de sangre, así como muestras de tejido testicular y del epidídimo, para evaluaciones bioquímicas y microscópicas.

2.2. Medición de las concentraciones séricas de testosterona, FSH y LH

Las concentraciones séricas de testosterona, hormona estimulante del folículo (FSH) y hormona luteinizante (LH) se midieron mediante el uso de kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Testosterona de rata (n.º de catálogo: EA0023Ra, kit ELISA Bioassay Technology Laboratory), Rat FSH (n.º de catálogo: EA0015Ra, Bioassay Technology Laboratory, Shanghái, China) y Rat LH ELISA (n.º de catálogo: EA0013Ra, Bioassay Technology Laboratory) se utilizaron para análisis de niveles hormonales según procedimiento del kit. Los resultados de testosterona se dieron como nmol/L y FSH y LH se dieron como mIU/L

2.3. Medición de los niveles testiculares de MDA, GSH y SOD

Los niveles de MDA se determinaron utilizando un kit comercial (E-BC-K025-M, Elabscience, Houston, TX, EE. UU.). El MDA, uno de los productos de degradación de la peroxidación lipídica, reacciona con el ácido tiobarbitúrico (TBA) para formar un complejo rosa con un máximo de absorción de 532 nm. Los niveles de MDA en el tejido se calcularon en nmol/g. El análisis de GSH en tejido testicular se realizó de acuerdo con el método de Beutler [28]. El principio del método se basa en el hecho de que el GSH en el tubo de análisis reacciona con el ácido 5,50 -ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) para dar un color amarillento. La intensidad de la luz de este color se leyó en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 410 nm. Los homogeneizados de tejido se centrifugaron y se añadió una solución de TCA al 10 por ciento al sobrenadante obtenido, se mezcló y se centrifugó de nuevo para precipitar las proteínas. Los sobrenadantes de colores brillantes se usaron para el análisis de GSH. La intensidad del color formado en las muestras mantenidas a temperatura ambiente durante 5 min se leyó a 410 nm en el espectrofotómetro y los niveles de GSH en µmol/g en el tejido se determinaron mediante la curva estándar de glutatión. La actividad de SOD se determinó utilizando el kit de determinación de SOD Sigma (E-BC-K019-M, Elabscience, Houston, TX, EE. UU.). Los valores de absorbancia se leyeron a 450 nm después de incubar la actividad SOD con una solución de trabajo enzimático. Los niveles de SOD en el tejido se calcularon en UI/g

2.4. Conteo de espermatozoides, motilidad y morfología

Muestras de tejido del epidídimo de ratas se colocaron en una solución de sales equilibradas de Earle con una solución de tampón Hepes y se procesaron para el análisis del recuento, la motilidad y la morfología de los espermatozoides según un estudio previo [27]. Brevemente, se transfirieron muestras de tejido de epidídimo de ratas a una solución de sales equilibradas de Earle con solución de tampón Hepes añadida después de la disección. Se utilizó un método de gradiente de densidad de rutina para evaluar los espermatozoides. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se diluyó con un medio de lavado de espermatozoides (SAGE, Newcastle upon Tyne, Reino Unido) y se centrifugó. Luego, el sedimento se diluyó con un medio de preparación de esperma (SAGE, Reino Unido). El sedimento de 10 µm se usó para contar los espermatozoides en una cámara de recuento Macler (Sefi cut out Medical Instruments, Haifa, Israel) con un fotomicroscopio para contarlos. Para la evaluación morfológica, se prepararon frotis y luego se tiñeron con el kit Diff-Quick (Medion Diagnostics, Grafelfing, Munich, Alemania). En cada portaobjetos, se examinaron 100 espermatozoides con un aumento de 100x con un fotomicroscopio (Zeiss A1 Axio Scope, Oberkochen, Alemania) para evaluar la morfología de los espermatozoides.

2.5. Procesamiento de tejidos para microscopía óptica

Los tejidos testiculares se fijaron con la solución de Bouin para exámenes histológicos de rutina. Para los exámenes inmunohistoquímicos, los tejidos testiculares se fijaron con una solución de paraformaldehído (PFA) al 4 por ciento. Después de la fijación, los tejidos se sometieron de forma rutinaria a un procedimiento de inclusión en parafina [29]. Se aplicó tinción de hematoxilina y eosina (H&E) a las secciones para la evaluación histológica de rutina. Se aplicó una reacción de ácido peryódico de Schiff (PAS) para revelar la estructura de las membranas basales de los túbulos seminíferos. Los túbulos seminíferos en secciones testiculares teñidas con H&E se calificaron en función de los parámetros de calificación histopatológica de Johnsen modificados [30,31]. Además, se midieron los espesores epiteliales de 100 túbulos seminíferos en todas las secciones usando el programa Image J (software Image J, Institutos Nacionales de Salud).

2.6. Desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP Nick End Labeling (TUNEL) Inmunoquímica

Se aplicó el método de marcaje terminal de desoxinucleotidil transferasa dUTP nick end (TUNEL) a secciones de tejido testicular de acuerdo con el manual de instrucciones del kit proporcionado por el fabricante (ApopTag Plus, In Situ Apoptosis Detection Kit, S7101, Merck Millipore, Darmstadt, Alemania). En resumen, después de la desparafinización y rehidratación, las secciones se lavaron en PBS y luego se calentaron en un horno de microondas en un tampón de citrato. Después de enfriar, se goteó proteinasa K (20 µg/mL) sobre las secciones de tejido. Las secciones se lavaron en agua destilada y se empaparon en una solución preparada con peróxido de hidrógeno al 3 por ciento. Después de lavar en PBS, se colocó un tampón estabilizador de 10 µL sobre las secciones durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, se gotearon 10 µL de enzima Tdt y las secciones se incubaron durante 1 h a 37 ◦C. El tampón de parada de lavado se goteó durante 10 min a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, se gotearon 13 µL de anti-digoxigenina sobre las secciones. Después de incubar a temperatura ambiente durante 30 min, las secciones se lavaron 4 veces durante 2 min en PBS. Luego, se gotearon 13 µl de solución de 3,3'-diaminobencidina (DAB). Luego, las secciones se agitaron con agua destilada. Para la tinción de contraste, las secciones se empaparon en solución de hematoxilina Mayer (JT Baker, Center Valley, PA, EE. UU.). Después del lavado en agua destilada, las secciones se montaron con italiano. Se tomaron imágenes de las secciones con un microscopio óptico (Zeiss A1 Axio Scope, Oberkochen, Alemania). El índice apoptótico se estimó dividiendo el número total de túbulos testiculares por el número de túbulos seminíferos con 3 o más células TUNEL positivas [32].

2.7. Inmunohistoquímica del antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA)

Las secciones se sometieron a inmunohistoquímica PCNA para determinar el número de células proliferativas y el índice de proliferación. Después de la desparafinización y la rehidratación, las secciones se procesaron para inmunohistoquímica PCNA como se describe en un estudio anterior [32]. En resumen, las secciones se almacenaron en una solución de peróxido de hidrógeno al 3 por ciento (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) durante 20 min. Las secciones se calentaron en un horno de microondas a 200 W en tampón de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (Sigma-Aldrich, EE. UU.) durante 20 min. Después de lavar con PBS 3 veces, las secciones se sumergieron en una solución bloqueadora de suero de cabra al 5 por ciento (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) durante 10 min. Luego, se aplicó el anticuerpo anti-PCNA primario de conejo (n.º de catálogo: SY12-07, Novus Biologicals, Littleton, CO, EE. UU.) (1:50). Las secciones se mantuvieron en una cámara húmeda a 4 ◦C durante la noche y se lavaron 3 veces con PBS durante 5 min cada vez. El anticuerpo secundario anti-conejo de cabra marcado con biotina (n.º de catálogo: A16100, Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) (1:500) se dejó caer sobre las secciones y se mantuvo a 37 ◦C durante 30 min. Se instiló estreptavidina peroxidasa (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) en las secciones y se dejó durante 10 min. Después de lavar 3 veces con PBS, las secciones se sumergieron en cromógeno 3,30 -diaminobencidina (DAB) (1 ml de sustrato DAB más 30 µl de cromógeno DAB) durante 5 min. Después de lavar con agua destilada, las secciones se tiñeron con solución de hematoxilina de Mayer para la tinción de contraste. A continuación, las secciones se montaron con gelatina de glicerol de Kaiser (Nº de catálogo: 1.09242, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania). Las secciones se examinaron con un microscopio óptico (A1 Axio Scope, Oberkochen, Zeiss, Alemania). Para determinar el índice de proliferación, el número de células positivas para PCNA en 20 túbulos en cada sección se dividió por el número total de células [32].

2.8. Inmunohistoquímica de ZO-1 y Ocludina

Las secciones de tejido fijadas con PFA al 4 por ciento se desparafinizaron y rehidrataron con soluciones de alcohol. Luego, las secciones se sumergieron en una solución de peróxido de hidrógeno al 3 por ciento (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) durante 20 minutos para bloquear las enzimas endógenas. Después de lavar con PBS, las secciones se calentaron en un microondas a 200 W en un tampón EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Las secciones se enfriaron durante 30 min a temperatura ambiente y se almacenaron 3 veces durante 5 min cada una en PBS seguido de 10 min en suero de cabra tamponado al 10 por ciento (Invitrogen, EE. UU.). Las secciones se trataron con anti-ZO de conejo-1 (Nº de catálogo: 61-7300, Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) y anti-ocludina de conejo (1:100) (Nº de catálogo: {{18} }, Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) anticuerpos (durante la noche, a más 4 ◦C). Después de lavar 3 veces en PBS durante 5 min, se dejó caer sobre las secciones un anticuerpo secundario anticonejo marcado con biotina (Nº de catálogo: 65-6140, Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) (1:1000). Después de remojar en PBS 3 veces y 5 min, se aplicó estreptavidina-peroxidasa (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) a las secciones. Después de lavar en PBS, se dejó caer AEC Single/Plus Chromogen (Abcam, Cambridge, Reino Unido), y las secciones se agitaron con agua destilada y se montaron con gelatina de glicerol de Kaiser (n.º de catálogo: 1.09242, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania). Se tomaron imágenes de las secciones utilizando un microscopio óptico (A1 Axio Scope, Oberkochen, Zeiss, Alemania). La intensidad de inmunorreactividad tanto de ZO-1 como de ocludina se calculó usando el programa Image J (software 1.44, Institutos Nacionales de Salud).

2.9. Análisis de inmunofluorescencia de ZO-1, ocludina y NOX-2

Las secciones se mantuvieron en peróxido de hidrógeno al 3 por ciento y se lavaron con PBS. Luego, las secciones se incubaron con conejo anti-ZO-1(1:100) ZO-1(n.º de catálogo: 61-7300, Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.), conejo anti ocludina (1 :100) (n.º de catálogo: 71-1500, Invitrogen, EE. UU.), y anticuerpos primarios de conejo anti-NOX-2 (1:100) (n.º de catálogo: NBP2-41291, Novus, BioTechne, Minnesota, Estados Unidos). Los portaobjetos se lavaron con PBS y luego se incubaron con AF 488 (n.º de catálogo: ab150077, Abcam, EE. UU.) anticuerpo secundario anticonejo de cabra marcado (1:1000). Después de lavar las secciones con PBS por última vez, se montaron con una solución de 406-diamino-2-fenil ídolo (DAPI) (n.º de catálogo: ab104139, Abcam, Boston, MA, EE. UU.). Se tomaron imágenes de las secciones con un microscopio de fluorescencia (microscopio Zeiss Axio Scope.A1 con accesorio de fluorescencia cámara Zeiss AxioCam MRc 5). La intensidad de la fluorescencia en las secciones fotografiadas se calculó utilizando el programa Image J (software Image J, Institutos Nacionales de Salud).

2.10. Procesamiento de tejidos para microscopía electrónica de transmisión

Las muestras de tejido testicular se fijaron con una solución tamponada de glutaraldehído al 2,5 por ciento (en 0,1 M PBS, pH 7,2) y se procesaron para la preparación microscópica electrónica de transmisión de rutina de acuerdo con el protocolo publicado anteriormente [32]. Las secciones se analizaron bajo un microscopio electrónico de transmisión (TALOS L 120 C, Thermo Scientific Fisher, Eindhoven, Países Bajos).

2.11. Análisis estadístico

Los datos se analizaron con ANOVA unidireccional y pruebas de comparación múltiple de Tukey con p < 0.05 consideradas significativas. El análisis estadístico se realizó utilizando Graph Pad Prism 8.0 (San Diego, CA, EE. UU.).

¿Cómo aumenta Cistanche la testosterona?

Cistanche es una hierba que se usa tradicionalmente en la medicina china para aumentar la energía, la libido y la vitalidad en general. Se cree que Cistanche puede aumentar los niveles de testosterona al inhibir la actividad de una enzima llamada aromatasa, que convierte la testosterona en estrógeno. También se ha descubierto que Cistanche aumenta la producción de hormona luteinizante (LH) en el cuerpo. LH juega un papel crucial en la regulación de la producción de testosterona en los testículos. Al aumentar los niveles de LH, Cistanche puede aumentar indirectamente la producción de testosterona. Además, Cistanche también contiene varios fitoquímicos como el equinacósido y el acteósido, que poseen propiedades antioxidantes. Estos compuestos pueden ayudar a proteger los testículos y otros órganos reproductivos del daño oxidativo, mejorando así su función y aumentando la producción de testosterona. En general, los mecanismos exactos por los cuales Cistanche aumenta los niveles de testosterona no se comprenden completamente, pero es probable que sea una interacción entre la inhibición de la aromatasa, el aumento de la producción de LH y el suministro de apoyo antioxidante al sistema reproductivo.

Continuará...

Merve Acikel-Elmas 1,*, Salva Asma Algilani 1, Begum Sahin 1, Ozlem Bingol Ozakpinar 2, Mert Gecim 2, Kutay Koroglu 3 y Serap Arbak 1

1 Departamento de Histología y Embriología, Escuela de Medicina, Universidad Acibadem Mehmet Ali Aydinlar, Icerenkoy Mah., Kayisdagi Cad. No. 32, Atasehir, Estambul 34752, Turquía

2 Departamento de Bioquímica, Facultad de Farmacia, Universidad de Marmara, Basibuyuk Yolu, 4/A, Basibuyuk, Estambul 34854, Turquía

3 Departamento de Histología y Embriología, Facultad de Medicina, Universidad de Marmara, Basibuyuk Yolu No. 9 D:2, Maltepe, Estambul 34854, Turquía