El ácido aristolóquico induce fibrosis renal y senescencia en ratones
Mar 23, 2022
Resumen:El riñón es uno de los órganos más susceptibles a las deficiencias relacionadas con la edad. Generalmente, el envejecimiento renal se acompaña de fifibrosis renal, que es la vía común final de la enfermedad crónica.enfermedades renales. El ácido aristolóquico (AA), un agente nefrotóxico, causa nefropatía AA (NAA), que se caracteriza por fifibrosis renal progresiva y deterioro funcional. Aunque la fifibrosis renal se asocia con el envejecimiento renal, aún no está claro si la AA induce el envejecimiento renal. El objetivo del presente estudio es investigar el uso potencial de AAN como modelo de envejecimiento renal. Aquí, examinamos los factores relacionados con la senescencia en modelos AAN mediante la administración crónica de AA a ratones C57BL/6. En comparación con los controles, el grupo AA demostró envejecimientoriñónfenotipos, como atrofia renal, deterioro funcional renal y fifibrosis tubulointersticial. Además, AA promovió la senescencia celular específicamente en elriñonesy aumento de la expresión de ARNm de p16 renal y actividad de galactosidasa asociada a la senescencia. Además, los ratones tratados con AA exhibieron anomalías mitocondriales tubulares proximales, así como acumulación de especies reactivas de oxígeno. Klotho, un gen antienvejecimiento, también disminuyó significativamente en elriñonesde ratones tratados con AA. En conjunto, los resultados del presente estudio indican que la AA altera los factores relacionados con la senescencia y que la fifibrosis renal está estrechamente relacionada con el envejecimiento renal.
Palabras clave:enfermedad renal crónica; fifibrosis renal; ácido aristolóquico; envejecimiento; senescencia celular
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IntroducciónCon el aumento continuo de la esperanza de vida de los seres humanos, más personas sufren deficiencias relacionadas con la edad.Riñonesse ven típicamente afectados por daño tisular relacionado con la edad, y la incidencia deenfermedad del riñonaumenta con la edad [1]. El envejecimiento renal acelera el envejecimiento general, lo que resulta en una vida más corta. Por lo tanto, es necesaria la investigación sobre el envejecimiento renal, aunque no se han desarrollado completamente los modelos animales apropiados. El envejecimiento renal se acompaña de varios cambios patológicos, que incluyen atrofia renal, glomeruloesclerosis y fifibrosis tubulointersticial [2]. La fifibrosis tubulointersticial renal es la vía común final en la mayoría de las formas de enfermedad renal progresiva, lo que sugiere que la fifibrosis renal está estrechamente asociada con la edad avanzada.riñón. En la investigación del envejecimiento, los ratones son una herramienta confiable debido a su proximidad genética a los humanos, la capacidad de manipular genéticamente su genoma y el hecho de que presentan fenotipos relacionados con el envejecimiento similares a los humanos durante su vida [3]. Las observaciones longitudinales con ratones consanguíneos son ideales como modelo de envejecimiento, aunque lleva mucho tiempo seguir a los ratones durante toda su vida útil. Además, existen varios modelos de envejecimiento en ratones modificados genéticamente. El ratón con deficiencia de Klotho es un modelo de envejecimiento prematuro que se utiliza en la investigación del envejecimiento. Sin embargo, en este modelo, la función renal no se ve afectada y varios órganos, además de los riñones, se ven afectados [4]. Por lo tanto, este modelo de ratón puede ser inapropiado para la investigación sobre el envejecimiento renal.La administración de ácido aristolóquico (AA) provoca un tipo específico de lesión renal conocida como nefropatía AA (NAA), que se caracteriza por una extensa fibrosis intersticial [5,6]. El AA es tóxico para el epitelio tubular renal porque promueve la formación de aductos de ADN en los tejidos renales [7]. Es poco probable que el AA afecte otros órganos además del sistema urinario y puede ser útil para la evaluación deriñón-Alteraciones específicas. Por lo tanto, AA se usa comúnmente para establecer modelos de fifibrosis renal en ratones [8,9]. Sin embargo, no está claro si las alteraciones inducidas por AA están relacionadas con el envejecimiento en elriñones. En este estudio, examinamos fenotipos relacionados con la edad y factores moleculares en AAN en ratones.
Resultados 2.1. La administración de AA indujo una pérdida de peso significativa, atrofia renal y una disminución de la función renalEl peso corporal inicial (BW) y la presión arterial sistólica (BP) fueron idénticos entre los grupos de control con vehículo y AA. El peso corporal en el grupo de control con vehículo aumentó constantemente durante 8 semanas. Sin embargo, la administración de AA inhibió el aumento de peso, y el grupo de AA tuvo un peso corporal significativamente más bajo a las 4 y 8 semanas después del inicio de la administración de AA (Figura 1A). No hubo diferencias significativas en la PA sistólica o la frecuencia cardíaca entre los grupos de control con vehículo y AA (Figura 1B,C). La relación peso del corazón/PC no mostró diferencias entre los grupos a las 8 semanas después del inicio de la administración de AA (Figura 1D), mientras que elriñónla relación peso/PC fue significativamente menor en el grupo de AA a las 8 semanas del inicio de la administración de AA (Figura 1E). A continuación examinamos la función renal en los grupos de control de vehículo y AA. Las concentraciones plasmáticas de creatinina y nitrógeno ureico (UN) fueron significativamente más altas en el grupo de AA que en el grupo de control con vehículo a las 8 semanas después del inicio de la administración de AA. Además, el tratamiento con AA redujo significativamente el aclaramiento de creatinina en comparación con el grupo de control con vehículo a las 8 semanas después del inicio de la administración de AA (Figura 1F-H).
2.2. La administración de AA indujo una fibrosis tubulointersticial manifiesta y una regulación al alza significativa de la expresión génica relacionada con la fibrosis en los riñonesEl examen histológico mediante tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS) reveló que el área glomerular se redujo significativamente en el grupo AA en comparación con el grupo de control con vehículo (Figura 2A). Se observó fifibrosis tubulointersticial extensa, evaluada mediante la tinción tricrómica de Masson (MT), en el grupo AA (Figura 2B), así como una regulación al alza de los niveles de ARNm de genes relacionados con la fifibrosis renal, colágeno I y III, y factor de crecimiento transformante ( TGF)- (Figura 2C-E).
2.3.La administración de AA aceleró la senescencia celular, la disfunción mitocondrial y la acumulación de especies de reacción Oxy/gen (ROS) en los riñonesPara evaluar la senescencia celular, examinamos la expresión de ARNm renal de p53, p21, p16 y glutaminasa (GLS). El grupo AA demostró niveles significativamente más altos de ARNm de estos genes relacionados con la senescencia en elriñones(Figura 3A-D). Además, la intensidad de tinción de -galactosidasa (SA- -gal) asociada a la senescencia en elriñonesfue aumentado en el grupo AA y casi ausente en el grupo control con vehículo (Figura 3E). En el grupo AA, la microscopía electrónica reveló la desaparición de las crestas mitocondriales, fragmentación mitocondrial, vacuolización citoplasmática y autolisosomas en las células tubulares proximales, concomitante con la regulación a la baja de BCL2/adenovirus E1B 19-kDa que interactúa con la proteína 3 (Bnip3), un gen relacionado con las mitocondrias (Figura 3FG). Expresión de ARNm renal de Nox2. un componente de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa, aumentó significativamente en el grupo AA en comparación con el grupo de control del vehículo (Figura 3H). Además, el análisis de transferencia Western reveló que el nivel renal de 4-hidroxi-2-nominal (4-HNE) aumentó significativamente en el grupo AA (Figura 3I). Estos resultados indicaron que la administración de AA indujo senescencia celular, disfunción mitocondrial y acumulación de ROS en elriñones
2.4. Expresión de proteína Klotho renal reducida de AAExaminamos la expresión renal de proteínas antienvejecimiento en los grupos de control de vehículo y AA. La expresión de Klotho se redujo significativamente en el grupo de AA en comparación con el grupo de control con vehículo (Figura 4A), mientras que las expresiones renales de nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT) y sirtuin1 (SIRT1) fueron similares entre los grupos (Figura 4B,C).
3. DiscusiónHasta donde sabemos, el presente estudio es el primero en centrarse en la evaluación de las alteraciones asociadas con el envejecimiento renal en AAN utilizando marcadores de senescencia, como p16 y actividad SA- -gal. El tratamiento con AA promovió la atrofia renal, la fibrosis tubulointersticial y el deterioro de la función renal, que se acompañaron de una regulación al alza del ARNm de p16 renal y tinción positiva para SA- -gal. Además, el grupo de AA demostró características de los mecanismos relacionados con el envejecimiento renal, como anomalías mitocondriales, aumento del estrés oxidativo y regulación a la baja del gen antienvejecimiento, Klotho. En conjunto, nuestras observaciones sugieren que la administración crónica de AA imita parcialmente el envejecimiento renal.
La senescencia celular es la detención permanente de la proliferación celular en respuesta a diversos factores estresantes, como el daño del ADN, y contribuye al envejecimiento y a las enfermedades relacionadas con el envejecimiento. La expresión de p16, un inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina, se correlaciona con el envejecimiento en varios órganos, incluidos los riñones. La restricción calórica aumenta la esperanza de vida al inhibir la expresión de pl6 [10]. Además, la eliminación de células senescentes que expresan p16-en ratones INK-ATTAC a través de la inyección de AP20187, un dimerizador de proteína de unión a FK506-[11], provoca la atenuación de los fenotipos de envejecimiento renal, como la esclerosis glomerular y la enfermedad renal. deterioro funcional. Por lo tanto, p16 es uno de los factores más importantes relacionados con el envejecimiento. Las células senescentes se pueden detectar mediante tinción con SA- -gal, que demuestra una mayor actividad de -galactosidasa a pH 6,0 [12], y es un biomarcador ampliamente utilizado de células senescentes y envejecidas. La expresión de ARNm renal de pl16 aumenta en ratas envejecidasriñonesy se acompaña de un aumento de la actividad de SA- -gal en el epitelio renal [13I. En el presente estudio, demostramos una mayor expresión de ARNm de p16 renal y tinción de SA- -gal, lo que indica que AA induce la senescencia renal. Recientemente se informó que GLS es esencial para la supervivencia de las células senescentes a través de la glutaminólisis mejorada y la neutralización del pH intracelular [14]. Se demostró que la inhibición de la glutaminólisis dependiente de GLS en ratones de edad avanzada elimina las células senescentes y mejora la disfunción orgánica relacionada con la edad. En el presente estudio, la regulación al alza del ARNm de GLS renal indicó acumulación renal de células senescentes en el grupo. Así, la administración crónica de AA provocó senescencia celular en los riñones.
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Además de la senescencia celular, la disfunción mitocondrial es un mecanismo esencial subyacente al daño tisular relacionado con la edad y se acompaña de la acumulación de ROS [15,16]. La disfunción mitocondrial impulsa y mantiene la senescencia celular [17] mientras que la senescencia celular contribuye directamente a la disfunción mitocondrial [18]. Bnip3, ubicado principalmente en la membrana mitocondrial externa, puede desempeñar un papel en la regulación de la mitofagia en células tubulares proximales renales cultivadas en respuesta al estrés oxidativo y la hipoxia. En ratones de edad avanzada, la restricción calórica aumenta la autofagia en las células tubulares, a través de la regulación positiva de Bnip3, y mejora la degeneración de la función renal inducida por la edad [19]. En el presente estudio, la microscopía electrónica reveló las características de las anomalías mitocondriales que pueden verse afectadas por la reducción de la expresión renal de Bnip3 o la senescencia celular. Las mitocondrias son la principal fuente intracelular de ROS. Para evaluar los efectos de las anomalías mitocondriales en las ROS renales, examinamos la acumulación renal de 4-HINE y demostramos la acumulación de ROS inducida por AA en elriñonesLas NADPH oxidasas son una fuente importante de ROS. Durante la fase aguda de AAN en ratones, la expresión de ARNm renal de Nox2 se elevó y la disponibilidad de óxido nítrico se redujo, lo que condujo a hipoxia e isquemia sostenidas [20. En rata envejecidariñones, la acumulación de ROS se acompaña de una mayor expresión de Nox2 [21]. Estos hallazgos sugieren que AA puede inducir fenotipos relacionados con la edad a través de la acumulación de ROS causada por la disfunción mitocondrial y la regulación positiva de las NADPH oxidasas.
La expresión del gen Klotho renal disminuyó en el grupo AA, mientras que la expresión de NAMPT y SIRT1 fue similar entre los grupos. Klotho es un gen antienvejecimiento que codifica una proteína transmembrana de un solo paso que actúa como supresor del envejecimiento. El proceso de envejecimiento en ratones con deficiencia de Klotho se parecía al de los humanos, incluida una vida útil más corta, infertilidad, arteriosclerosis, atrofia de la piel, osteoporosis y enfisema [22]. Los ratones Klotho mutantes hipomórficos también exhibieron un fenotipo de envejecimiento acelerado, que fue restaurado por la ablación de p16 [23]. Dado que Klotho es un factor importante en el envejecimiento, los ratones modificados genéticamente con Klotho se han utilizado ampliamente en la investigación sobre el envejecimiento. Sin embargo, los ratones modificados con el gen Klotho pueden ser inapropiados para la investigación sobre el envejecimiento renal debido a las deficiencias sistémicas asociadas con el envejecimiento de estos ratones y al hecho de que la función renal no está comprobada (es decir, los niveles de creatinina). Por el contrario, el modelo de ratón AAN se puede utilizar como un modelo de envejecimiento renal inducido por fármacos con fines de investigación, ya que tiene varias ventajas, como la relativa facilidad de implementación y la capacidad de estimar los efectos de las intervenciones en la disminución de la función renal. .
El presente estudio tuvo algunas limitaciones. Evaluamos el envejecimiento renal, centrándonos principalmente en la senescencia celular, la morfología mitocondrial y la expresión génica relacionada con el envejecimiento. Sin embargo, los mecanismos del envejecimiento son complejos y siguen siendo poco conocidos. Además, aunque la expresión del gen Klotho disminuyó en respuesta a AA, no pudimos demostrar una relación causal con los cambios patológicos en AAN. Se requieren más estudios para determinar las funciones de las diversas moléculas involucradas en el desarrollo de AAN. Sin embargo, el presente estudio proporciona nuevos conocimientos sobre el uso de Avan como modelo de envejecimiento renal. Es importante señalar que los cambios fenotípicos en elriñónestán fuertemente asociados con la esperanza de vida. Aunque elriñónse ve afectado fácilmente por los cambios asociados con el envejecimiento, la inhibición del envejecimiento renal puede alargar la vida útil general. Por lo tanto, la investigación adicional sobre el envejecimiento renal utilizando modelos de AAN puede conducir a una mayor longevidad en el futuro.
4. Materiales y Métodos4.1. animalesEste estudio se realizó de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el uso de animales de experimentación. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Estudios con Animales de la Universidad de la Ciudad de Yokohama (Número de aprobación: FA20-027) y se realizaron de conformidad con las pautas de ARRIVE. Se hicieron esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados y su sufrimiento. Los ratones se alojaron en un ambiente controlado bajo un ciclo de 12-h de luz/12-h de oscuridad a una temperatura de 25 grados C. Los ratones tenían libre acceso a comida y agua.
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Se compraron ratones macho C57BL/6 de ocho semanas de edad de Charles River Laboratories (Wilmington, MA, EE. -Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), que se disolvió en una pequeña cantidad de dimetilsulfóxido. Antes del presente estudio, llevamos a cabo un estudio preliminar utilizando varios protocolos. El primer protocolo incluía la administración de AA (3 mg/kg) a ratones C57BL/6 por vía intraperitoneal dos veces por semana durante 4 semanas sin tiempo de remodelación; en este protocolo, AA causó lesiones renales agudas manifiestas, como túbulos proximales dilatados con pérdida del borde en cepillo (Figura complementaria S1). En el segundo protocolo, a los ratones C57BL/6 se les administró AA (2,5 mg/kg) por vía intraperitoneal una vez a la semana durante 4 semanas, seguido de un tiempo de remodelación durante 4 semanas; la creatinina plasmática en estos ratones fue 0.19 ± {{20}}.080 mg/dL versus 0.18 ± 0.010 mg/dL (control de vehículo versus AA, respectivamente; media ± error estándar de la media (SEM), p=0.86, prueba t de Student no pareada, n=4 por grupo) y UN plasmático fue 31,3 ± 5,95 mg/dL versus 30,4 ± 3,87 mg/dl (control de vehículo frente a AA, respectivamente; media ± SEM, p=0, 90, prueba t de Student no apareada, n=4 por grupo). Por lo tanto, determinamos que este protocolo no era adecuado para un modelo de lesión renal porque AA no indujo una disminución significativa de la función renal. En el tercer protocolo, a los ratones C57BL/6 se les administró AA (3 mg/kg) por vía intraperitoneal dos veces por semana durante 10 semanas sin tiempo de remodelación; en estos ratones, la tasa de mortalidad en el grupo AA fue del 83 por ciento (n=6), mientras que ninguno de los ratones del grupo de control con vehículo murió (n=4). En este protocolo, no pudimos evaluar estadísticamente el fenotipo renal inducido por AA debido a la alta mortalidad. En el cuarto protocolo, a los ratones C57BL/6 se les administró AA (3 mg/kg) por vía intraperitoneal dos veces por semana durante 4 semanas, seguido de un tiempo de remodelación durante 4 semanas; En estos ratones se observaron lesiones renales crónicas, como fifibrosis tubulointersticial, y disminución de la función renal [9]. Por lo tanto, en base a los resultados de estas investigaciones preliminares, adoptamos el cuarto protocolo para llevar a cabo los experimentos del presente estudio.
4.2.Medición de PALa PA sistólica y la frecuencia cardíaca se midieron utilizando el método de manguito de cola descrito anteriormente (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokio, Japón) [24,25]. Todas las mediciones se realizaron entre 9:00 y 14:00. Se realizaron al menos 10 mediciones en cada ratón y se utilizó el valor medio para el análisis.
4.3. Análisis de PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real El ARN total se extrajo de los tejidos renales utilizando ISOGEN (Nippon Gene, Tokio, Japón), y el ADN complementario (ADNc) se sintetizó utilizando el sistema SuperScript IⅢFirst-Strand (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.). El análisis de PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real se realizó con el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.), y los productos de transcripción inversa se incubaron con TaqMan PCR Master Mix y un TaqMan personalizado. sonda (Applied Biosystems, Waltham, MA, EE. UU.), como se describió anteriormente [26]. Se utilizaron sondas TaqMan contra los siguientes genes: colágeno I (Mm00801666_g1), colágeno II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1), p53 (Mm00441964 g1), p21 ( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) y Nox2 (Mm00627011_m1). Los niveles de ARNm se normalizaron a los de ARN ribosomal 18S.
4.4. Análisis de Western Blot La expresión de proteínas se analizó mediante análisis de transferencia Western de los tejidos homogeneizados utilizando un método descrito previamente [27, 28]. Los extractos de proteínas totales se prepararon a partir de los tejidos utilizando un tampón de muestra que contenía dodecilsulfato de sodio. La concentración de proteína de cada muestra se midió utilizando el kit de ensayo de proteína compatible con detergente (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) y el NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), con albúmina de suero bovino como el estándar. Se fraccionaron cantidades iguales de extractos de proteína de las muestras de tejido en geles de poliacrilamida al 5-20 por ciento (ATTO Corp., Tokio, Japón). A continuación, las proteínas separadas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno utilizando el sistema de transferencia semiseco (ATTO Corp., Tokio, Japón). Las membranas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con solución salina tamponada con fosfato que contenía un 5 por ciento de leche descremada en polvo. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios contra Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, Reino Unido), NAMPT(sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1(07-131 1:1000, MilliporeSigma , Burlington, MA, EE. UU.), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Japón) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.). Las membranas se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios durante 60 min a temperatura ambiente. Los sitios para las reacciones anticuerpo-antígeno se visualizaron utilizando un sustrato de quimioluminiscencia mejorado (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.). Se utilizó GAPDH como control de carga. Las imágenes se analizaron cuantitativamente utilizando ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.).
4.5. Análisis histológico se realizó como se ha descrito anteriormente [29]. Se fijaron tejidos renales de ratones con paraformaldehído al 4 por ciento y posteriormente se incluyeron en parafina. Las secciones (4 um de espesor) se tiñeron con colorantes PAS y MT. Para evaluar el área glomerular, se midieron y promediaron 50 glomérulos por ratón. Todas las imágenes se adquirieron con el microscopio BZ-9000 (Keyence Corp., Osaka, Japón).
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4.6. Tinción SA- -al Los tejidos renales de los ratones se congelaron rápidamente y se montaron en un compuesto de temperatura de corte óptimo (Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokio, Japón). Las secciones (4 μm de espesor) se prepararon usando un criostato (HM550-VPD; Thermo Fisher Scientific) y se montó en portaobjetos de vidrio. La actividad de SA- -gal se midió usando un kit de detección de senescencia (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, EE. UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las muestras se observaron bajo un campo brillante con un aumento de ×100 utilizando el microscopio BZ-9000(Keyence Corp.. 4.7. Microscopía electrónicaEl análisis de microscopía electrónica se realizó como se describió previamente [30]. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano y perfundidos a través del arco aórtico derecho con solución salina fisiológica heparinizada (5 U/mL) y glutaraldehído al 2,5 por ciento en tampón de fosfato 0,1 mol/L a pH 7,4. Las muestras para microscopía electrónica de transmisión se sumergieron en tetróxido de osmio al 1 por ciento durante 2 h, se deshidrataron en serie en etanol y se incluyeron en una mezcla de Epon. Las secciones ultrafinas se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron utilizando el microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7500 operado a 80 kV (Hitachi, Ltd., Tokio, Japón). Las secciones se observaron con un aumento de × 5000 y se fotografiaron con una cámara de dispositivo de carga acoplada.
4.8.Análisis bioquímicoLas muestras de sangre se recogieron mediante punción cardíaca en estado alimentado. Las muestras de sangre completa se centrifugaron a 3000 rpm (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokio, Japón) durante 10 minutos a 4 grados para separar el plasma. Las muestras de plasma resultantes se almacenaron a -80 grados. Los niveles de creatinina plasmática, ONU y creatinina urinaria se midieron utilizando el autoanalizador Hitachi 7180 (Hitachi, Ltd., Tokio, Japón).
4.9. Análisis estadístico Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Los datos se presentan como media ± SEM. Se utilizó la prueba f de Student para datos no apareados para comparar las diferencias entre los grupos de control con vehículo y AA.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. ConclusionesCausas de administración de AAriñónsenescencia, junto con fibrosis tubulointersticial y atrofia renal. Los resultados sugieren que la fibrosis renal está estrechamente relacionada con el envejecimiento renal y que la AAN puede ser útil comoriñón-Modelo de envejecimiento específico.
