Las vías dependientes e independientes del receptor de hidrocarburo arilo median los efectos antienvejecimiento de la curcumina

Por favor contactaroscar.xiao@wecistanche.compara más información

Resumen:El receptor de hidrocarburo de arilo (AhR) es un factor de transcripción activado por ligando cuya actividad puede ser modulada por polifenoles, como la curcumina. AhR y la curcumina tienen efectos conservados evolutivamente sobre el envejecimiento. Aquí, investigamos si el AhR media los efectos antienvejecimiento de la curcumina en todas las especies y cómo lo hace. Usando una combinación de análisis in vivo, in vitro e in silico, demostramos que la curcumina tiene efectos dependientes o independientes de AhR de una manera específica del contexto. Descubrimos que en Caenorhabditis elegans, AhR media la extensión de la vida útil inducida por la curcumina, muy probablemente a través de un mecanismo inhibidor independiente del ligando relacionado con su actividad antioxidante. La curcumina también mostró actividades antienvejecimiento independientes de AhR, como la protección contra las proteínas propensas a la agregación y el estrés oxidativo en C.elegans y la promoción de la capacidad migratoria de las células endoteliales primarias humanas. Estos efectos independientes de AhR están mediados en gran medida por la vía Nrf2/SKN-1.

Por favor haga clic aquí para saber más

Palabras clave:receptor de hidrocarburo de arilo; curcumina; estrés oxidativo; Caenorhabditis elegans; ratones; células endoteliales; en vivo; in vitro; en silico

1. Introducción

El receptor de hidrocarburo de arilo (AhR) es un factor de transcripción activado por ligando ubicuo identificado como determinante de la respuesta toxicológica a la 23,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) en mamíferos [1]. Las vías de señalización de AhR han sido bien descritas en células de mamíferos. Brevemente, AhR sin ligando se localiza en el citoplasma y se estabiliza mediante diversos cofactores, como la proteína de choque térmico 90-kDa (Hsp90), la proteína que interactúa con AHR (AIP) y la chaperona p23. La unión a ligandos exógenos (p. ej., TCDD) o endógenos (p. ej., quinurenina) promueve la translocación de este complejo al núcleo, donde AhR se disocia de sus cofactores y se ensambla en un heterodímero con el translocador nuclear AHR (ARNT). El complejo AHR/ARNT resultante se une a los elementos sensibles a xenobióticos (XRE) de una batería de genes de desintoxicación de fase I y II sensibles, lo que eventualmente lleva a la degradación de los ligandos [2]. Además de su papel en la respuesta xenobiótica, el AhR funciona en una variedad de procesos fisiopatológicos, que van desde la inmunidad [3,4], la inflamación [5,6], el metabolismo de los lípidos y la glucosa [7,8] hasta el cardiovascular, hepático y otras enfermedades de órganos [9-12], han sido descubiertas en las últimas décadas. La creciente evidencia también apunta a roles dispares y aparentemente contradictorios de AhR en el proceso de envejecimiento, que, no obstante, podrían reconciliarse, teniendo en cuenta los efectos específicos del tejido, la dosis y la especie [13].cistanche genghis khanSe ha descrito un papel negativo para AhR en el envejecimiento y las características asociadas con la edad en todas las especies [14,15]. En comparación con Caenorhabditis elegans de tipo salvaje, la cepa mutante AhR, ahr-1(ju145), tiene una vida útil y una salud prolongadas; en ratones, la deficiencia de AhR mejora la función de los vasos y aumenta la actividad de la óxido nítrico sintasa y, por lo tanto, la biodisponibilidad de NO; y, finalmente, se encontró una correlación positiva entre la expresión de AhR y la rigidez de los vasos en sujetos humanos de mediana y avanzada edad [14]. Además, en un estudio epidemiológico en una población china, la expresión de AhR se relacionó con la incidencia de enfermedad arterial coronaria [16].

Cistanche puede antienvejecimiento

Cabe destacar que muchos compuestos que afectan el envejecimiento o las enfermedades relacionadas con la edad [17-19] pueden modular la actividad de AhR [20-22]. Si bien la activación de AhR por xenobióticos conduce a diferentes tipos de cáncer en mamíferos [23,24], se demostró que los factores dietéticos y ambientales tienen efectos dependientes de AhR opuestos en el período de salud de C.elegans [25]. Entre los moduladores dietéticos de AhR, los polifenoles como la curcumina se han estudiado en gran medida por sus efectos favorables a la salud. La curcumina es un pigmento amarillo de Curcuma longa, con numerosas propiedades beneficiosas conservadas evolutivamente, que incluyen actividades antioxidantes, antiinflamatorias y antienvejecimiento [26]. La curcumina previene la agregación de proteínas y aumenta la longevidad en C.elegans y Drosophila a través de la modulación de la homeostasis de las proteínas [27-29].prolongación de la vida de la cistancheAdemás, cuando se administró a un modelo de ratón transgénico con enfermedad de Alzheimer, redujo significativamente la carga total de beta-amiloide (A) [30]. En ratones viejos, la curcumina restableció la biodisponibilidad del NO, lo que redujo el estrés oxidativo y mejoró la disfunción endotelial y la rigidez arterial evaluada por la velocidad de la onda del pulso aórtico (PWV), una de las mediciones clínicas o marcadores más importantes de la rigidez de las grandes arterias elásticas [31]. Varios estudios en humanos también mostraron un efecto protector de la curcumina sobre la salud cardiovascular [32]. Sin embargo, el modo de acción de la curcumina aún no está claro en gran medida y, lo que es más importante, no se ha investigado si sus efectos beneficiosos para la salud están mediados por AhR [33,34].

Los organismos modelo, como el nematodo C.elegans, han sido fundamentales para identificar los determinantes genéticos y ambientales del envejecimiento. Esto se debe a sus muchas propiedades ventajosas, que incluyen su fácil manejo en el laboratorio, su corta vida útil y la producción de una gran cantidad de progenies por autofecundación. El genoma de C.elegans está completamente secuenciado, y la mayoría de sus genes y vías se conservan evolutivamente. La secuencia proteica de AhR se conserva durante la evolución y en C.elegans, los ortólogos de AhR y ARNT están codificados por el AhR relacionado (ahr-1) y ahr-1 asociado (aha{{4 }})genes, respectivamente [35]. Las proteínas correspondientes, AHR-1 y AHA-1, comparten alrededor del 40 por ciento de su identidad de secuencia con las de los mamíferos y forman un heterodímero (también con las contrapartes de los mamíferos), que puede unirse a los XRE del objetivo. genes in vitro [36].cistanche nueva zelandaAHR-1 se expresa principalmente en tipos de células neuronales, como las neuronas GABAérgicas [37l, y desempeña un papel clave en el control del desarrollo neuronal [38]. A diferencia del AhR de los vertebrados, el AHR-1 no se une al TCDD ni a otros xenobióticos relacionados [35,39]; sin embargo, comparte características comunes con el AhR de los mamíferos en la regulación de los procesos neuronales, el desarrollo y la fertilidad [37,38,{ {8}}], lo que finalmente sugiere que el AhR ancestral no estuvo directamente involucrado en el control de genes para la degradación de ligandos tóxicos [44,45]. Por lo tanto, reconocimos a C.elegans como un sistema modelo único y poderoso para identificar y estudiar las funciones ancestrales del AhR posiblemente no relacionadas con su respuesta xenobiótica.

En este estudio, investigamos el papel de AhR en los efectos antienvejecimiento de la curcumina en todas las especies. A través de una combinación de análisis in vivo, in vitro e in silico, descubrimos que la curcumina muestra diferentes efectos antienvejecimiento beneficiosos a través de mecanismos no acoplados dependientes e independientes de ahr-1-. Descubrimos que los animales agotados de C.elegans ahr-1-son longevos pero más sensibles al estrés oxidativo. Si bien la curcumina no extendió más la vida útil de los mutantes ahr-1 de C.elegans, promovió su resistencia al estrés oxidativo. La curcumina también promovió la respuesta antioxidante y la capacidad migratoria de las células endoteliales primarias (EC) humanas independientemente de AhR, un efecto que se basó principalmente en Nrf2/SKN-1 en todas las especies. SKN-1 es el ortólogo de C.elegans del factor de transcripción redox humano Nrt2 (factor nuclear eritroide 2-factor relacionado 2), que desempeña un papel conservado evolutivamente en la homeostasis celular y del organismo y en la respuesta al estrés oxidativo [ 46,47] Al combinar los resultados de un ensayo de indicador celular y el modelado in silico del dominio de unión al ligando (LBD) AHR-1, mostramos que la curcumina probablemente suprimió la actividad AHR-1 en un ligando- forma independiente de la vinculación. En particular, y de acuerdo con los datos de C.elegans y EC, la curcumina y los prooxidantes mostraron efectos opuestos en la actividad de AHR-1, lo que implica que la curcumina puede modular la actividad de AHR-1 a través de su capacidad antioxidante ya sea directamente o indirectamente a través de la regulación de Nrf2/SKN-1 u otras proteínas reguladoras redox.

2. Materiales y métodos

2.1. c.elegan1s

2.1.1. Cepas y cultivo de C. elegans

Utilizamos las siguientes cepas de C.elegans: N2 [wild-type], CZ2485 [ahr-1(jul45)], NV38b [alhr-1(ju145);unc-54p:Q40 :YFP], NV38wt [unc-54p::Q40:YFP] (cepa original AM141 [48]), NV42a [unc-54p::alphasymuclein::YFP, ahr-1 (jul45)], NV42wt [unc-54p::alfasinucleína::YFPI (cepa original NL5901 [49]), NV35a [ahr-1(ju145);(pAF15)gst-4 p::GFP::NLS], NV35wt (pAF15)st-4p::GFP::NLS](cepa original CL2166). Para el mantenimiento, los gusanos se mantuvieron sincronizados por puesta de huevos a 20 grados en medios de crecimiento de nematodos (NGM) y alimentadas con E.coli OP50, según los métodos descritos en [25]. Para los experimentos, los gusanos se sincronizaron en placas suplementadas con E. coli HT115 (DE3) en placas suplementadas con IPTG 1 mM (Fisher Scientific, Geel, Bélgica).

2.1.2. Silenciamiento de genes por interferencia mediada por ARN (ARNi)

El silenciamiento génico se logró mediante la alimentación de plásmidos que expresan E. coli HT115 (DE3) con dsRNA contra genes específicos [50]. La alimentación con ARNi se aplicó continuamente desde el nacimiento hasta la muerte. Para el ensayo de resistencia a juglona con bacterias HT115(skn-1), se aplicó alimentación con ARNi de gusanos L4 durante 24 h antes de transferirlos a placas de juglona frescas.

2.1.3. Cepas de E. coli y crecimiento

Las bacterias se cultivaron en medio LB a 37 grados durante la noche. Cuando se utilizaron vectores portadores de E.coli, el medio LB se complementó con 0.01 por ciento de ampicilina y 0,0005 por ciento de tetraciclina. E.coli HT115(L4440), HT115(ugt{{8} }), HT115 (skn -1) y OP50 se obtuvieron de la biblioteca Ahringer C. elegans RNAi [51].

2.1.4.Vida útil

El análisis de la vida útil se inició a partir de una población sincronizada de gusanos, que se transfirió diariamente a placas NGM frescas durante el período fértil. Después de la fase fértil, los animales se transfirieron cada dos días. Los animales muertos, vivos y censurados fueron puntuados durante el proceso de transferencia. Los animales se contaron como muertos cuando no mostraron movimiento, ni respuesta a un estímulo manual con un alambre de platino, ni actividad de bombeo faríngeo. Se censuraron los animales con eclosión interna (bolsas), y vulva explotada, o que morían disecados en la pared. El número de animales muertos y censurados se utilizó para el análisis de supervivencia en OASIS[52] u OASIS 2[53]. Para el cálculo de la vida útil media y la curva de supervivencia en OASIS y OASIS 2, se utilizó el estimador de Kaplan-Meier y los valores de p se calcularon mediante la prueba de rango logarítmico entre poblaciones de animales agrupadas.

2.1.5. Movimiento/Salud

El movimiento se estableció como un parámetro para el envejecimiento saludable, y la fase del movimiento activo se conoce como lapso de salud. Se evaluó en las poblaciones utilizadas para el ensayo de vida útil. Se consideró que los animales que gateaban espontáneamente o después de un estímulo manual se movían, mientras que los animales muertos o los animales sin comportamiento de gateo se consideraron que no se movían. El análisis estadístico se realizó como se describe para la vida útil.

2.1.6. Tratamiento de curcumina de C. elegans

La curcumina (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) se disolvió en DMSO (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) en una concentración de 100 mM y se suministró al NGM después del autoclave. La concentración final de curcumina en el medio era 100 μM (0,1 por ciento de DMSO). Las placas de control contenían 0,1 por ciento de DMSO. Los gusanos fueron tratados continuamente a partir de los huevos.

2.1.7. Cuantificación de agregados PolyQ

Los agregados de PolyQ40 se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia (aumento de 100x) en gusanos de 10- días anestesiados con azida de sodio 15 mM (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania). Para evaluar la cantidad de agregados, las imágenes se unieron con el complemento de unión por pares de Fiji [54] para crear gusanos completos, y la cantidad de agregados se cuantificó en Fiji [55] con el complemento "Analyze Particles".

2.1.8. Cuantificación de agregados de x-sinucleína

Los agregados de sinucleína en los músculos de la cabeza de 7-gusanos de un día se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia (aumento de 400x) en gusanos anestesiados con azida de sodio 15 mM (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania, S2002 ). Las imágenes se segmentaron utilizando Plastik (versión 1.3.0) (Laboratorio de Anna Kreshuk en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Heidelberg, Alemania) (disponible en https://www.ilastik.org/, consultado el 10 de abril de 2018)[56] . Las imágenes segmentadas se usaron para analizar el número de agregados en Fiji [55] usando el complemento "Analyze Particles".

2.1.9.Análisis de términos de micromatrices y GO

Se recogieron muestras de cinco réplicas independientes con aproximadamente {{0}}días de edad por condición, y se extrajo el ARN y se cargó en un chip Affymetrix. Los datos sin procesar de microarrays en formato CEL se analizaron utilizando el software R (versión 3.4.2) (R Foundation, Viena, Austria) y Bioconductor (The Bioconductor Project, Bioconductor es de código abierto y desarrollo abierto) [57]. La corrección de fondo, la normalización y el cálculo de la expresión se realizaron con el paquete oligo58] y el método RMA. Para el control de calidad del arreglo se utilizó el paquete arrayQualityMetrics 3.34.0 [59]. Debido a las medidas de calidad, la muestra ahr-1C5 se excluyó de análisis posteriores. Los genes expresados ​​diferencialmente se identificaron usando el paquete limma y un modelo lineal y una estadística t moderada con FDR para probar las comparaciones múltiples [6{{20}}]. Se aplicó un valor de p de 0,1. Los genes expresados ​​diferencialmente se analizaron para determinar el enriquecimiento del término Gene Ontology utilizando Cytoscape (versión 3.6.0) (The Cytoscape Consortium, una organización independiente sin fines de lucro) [61] con el complemento ClueGo (versión 2.5.0) (Laboratory of Integrative Cancer Immunology, París, Francia)[62]. Se puede acceder a los datos de la micromatriz a través del número de acceso de Gene Expression Omnibus. GSE195769.

2.1.10.Cuantificación de ROS

Se detectaron MtROS en gusanos mutantes vivos wt y ahr-1 utilizando MitoSOX Red (Ther-moFisher Scientific, Dreieich, Alemania). Los nematodos se sincronizaron mediante la puesta de huevos en placas IPTG utilizando bacterias HT115 (L4440) como alimento. Luego, 48 h más tarde, 50 animales en la etapa L4 se transfirieron a placas MitoSOX Red 10 μM recién preparadas sembradas con HT115 (L4440) muerto por UV. Los gusanos se incubaron en la oscuridad a 20 grados. Después de 16 h de incubación, se trasladaron a nuevas placas NGM esparcidas con HT115 (L4440) vivo durante 1 h para eliminar el tinte residual de los intestinos. Para obtener imágenes, los nematodos se montaron en portaobjetos de agarosa al 2 por ciento, se anestesiaron añadiendo levamisol 10 mM y se fijaron con ProLongTM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Alemania). Las imágenes se adquirieron inmediatamente con un microscopio Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Inc., Colonia, Alemania) utilizando un objetivo de 40x y un filtro DsRed. Posteriormente, la región de la cabeza del gusano se seleccionó manualmente y la intensidad integrada se calculó utilizando el software de imágenes Fij 55.

2.1.11. Ensayo de tetrametilrodamina etil éster (TMRE)

Para evaluar el potencial de la membrana mitocondrial, los nematodos se sincronizaron mediante la puesta de huevos en placas IPTG sembradas con bacterias HT115 (L4440). El día del experimento, se disolvió TMRE (Invitrogen, Eugene, OR, EE. UU.) en DMSO a una concentración de 5 mM y luego se diluyó a 30 μM con HT115 inactivado por calor (L4440) (30 min, 65 grados). Se añadió un total de 150 μL de esta solución por placa y se dejó secar en la oscuridad durante aproximadamente 30 min. Sesenta gusanos sincrónicos adultos a los 1, 3 o 5 días de edad adulta se recogieron en las placas TMRE preparadas y se dejaron absorber durante 2 horas en la oscuridad a 20 grados centígrados. Después de la tinción, los gusanos se transfirieron a placas IPTG sembradas con HT115 (L4440) inactivado por calor y se incubaron durante 1 hora en la oscuridad a 20 grados, para eliminar el tinte residual de los intestinos.tamaño del pene cistanchePara la obtención de imágenes, se montaron 10 nematodos en portaobjetos de agarosa al 2 %, se anestesiaron añadiendo levamisol 10 mM y se fijaron con ProLongM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Alemania). Para cada ejecución experimental, se prepararon 5 portaobjetos por grupo. Las imágenes se adquirieron inmediatamente con un microscopio Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Colonia, Alemania) utilizando un objetivo de 2,5 aumentos y un filtro DsRed. La intensidad de fluorescencia se calculó utilizando Fiji [55].

2.1.12. Ensayo de motilidad y tasa de bombeo faríngeo

Los nematodos N2 y CZ2485 se sincronizaron mediante blanqueo [63] y los huevos se dejaron en tampón de huevos para incubar (NaCl 118 mM, KCl 48 mM, CaCl 2 mM, MgCl2 2 mM, Hepes 25 mM, pH 7,3) durante la noche, en agitación orbital. Las larvas L1 se colocaron en NGM suplementado con IPTG 1 mM y que contenía 0.1 por ciento de DMSO o 100 μM de curcumina. Las bacterias HT115（L4440） se utilizaron como alimento. Los gusanos adultos jóvenes se recolectaron con tampón M9, se centrifugaron (300 g × 3 min) y se lavaron dos veces para eliminar las bacterias. Los gusanos se incubaron con 0-1 mM H, O, (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania) (100 gusanos/100 μL), durante 2 h con agitación orbital. Los gusanos de control se incubaron solo con tampón M9. Después de 2 h, los gusanos se trasladaron a NGM complementado con IPTG 1 mM y que contenía DMSO al 0,1 por ciento o curcumina 100 μM y se sembraron con bacterias HT115 (L4440) como alimento. La tasa de bombeo faríngeo, puntuada contando el número de veces que el bulbo terminal de la faringe se contrajo en un intervalo de 1 min (bombeos/min), y el ensayo de motilidad, puntuado contando el número de sacudidas del cuerpo (curvas del cuerpo/min) en El tampón M9 durante un intervalo de 1 min, se puntuó desde 2 hasta 20 h más tarde.

2.1.13. Ensayo de sensibilidad Juglone aguda

Los nematodos N2 y CZ2485 se sincronizaron mediante la puesta de huevos en placas NGM con DMSO o 100 μM de curcumina. Las placas se complementaron con IPTG 1 mM y se sembraron con bacterias HT115(L4440) o HT115(ugt-45) ​​como alimento. Para evaluar el efecto de la piel-1 RNAi, los gusanos se sincronizaron mediante la puesta de huevos en DMSO o placas de curcumina sembradas con bacterias HT115 (L4440). Cuando los nematodos alcanzaron la etapa larval L4, se transfirieron durante 24 h a placas de DMSO o curcumina sembradas con bacterias HT115 (piel-1). Los gusanos adultos del día 1 (25 gusanos) se trasladaron a placas NGM frescas que contenían Juglone 200 μM (Merck, Darmstadt, Alemania) y se sembraron con 25 μL de cultivo de bacterias concentradas 10x durante la noche. La supervivencia del gusano bajo el estrés oxidativo inducido por juglona se verificó mediante movimientos provocados por el tacto cada hora, durante 6 h. Los animales se calificaron como muertos cuando no respondieron al tacto con un pico de alambre de platino. Se censuraron los nematodos disecados en la pared. Se calificó el número de animales muertos y censurados y se empleó la aplicación en línea para el análisis de supervivencia OASIS2 para el análisis de supervivencia [53].

2.1.14. Cuantificación del GST-4:Intensidad GFP

NV35wt y NV35a se sincronizaron mediante la puesta de huevos en placas NGM suplementadas con IPTG 1 mM y que contenían 0,1 por ciento de DMSO o 100 μM de curcumina. Las bacterias HT115（L4440）, HT115(ugt-45) y HT115(skin-7) se utilizaron como alimento. Para visualizar la fluorescencia de GFP, los gusanos adultos del día 1 se anestesiaron con solución de clorhidrato de levamisol 10 mM y se montaron en almohadillas de agarosa al 2 por ciento. Las imágenes se adquirieron inmediatamente con un microscopio Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Colonia, Alemania), aumento de 2,5x) y luego se analizaron con el software CellProfiler (el equipo del proyecto CellProfiler, Cimini Lab en el Broad Institute of MIT y Harvard, MA, EE.UU). Brevemente, las imágenes se procesaron utilizando una tubería para segmentar gusanos en cada imagen de microscopía de campo brillante y separarlos del fondo. Luego, se midió la intensidad de GFP integrada por gusano.

2.1.15.PCR semicuantitativa en tiempo real (qPCR) en C. elegans

Se recolectaron muestras de 3 réplicas independientes con gusanos de aproximadamente 1000 3-días por condición y se extrajo el ARN. Después del lavado y la elución, se cuantificó el contenido de ARN mediante espectrofotometría y se usaron 1-2 ug de ARN para la síntesis de ADNc (Omniscript RT Kit (Qiagen, Hilden, Alemania).polvo de cistancheLos pares de cebadores se enumeran en la Tabla S1. Para la qPCR en tiempo real, el ADNc se diluyó a 1:20 en TRIS 10 mM (pH 8,0). Para la reacción se utilizó el kit qPCR Green Core (Jena Biosciences, Jena, Alemania) o el kit GoTaq⑧ qPCR (Promega, Walldorf, Alemania). Las muestras se procesaron en un ciclador MyiQ2 (BioRad, Feldkirchen, Alemania) y la expresión de cada muestra se midió por duplicado en la misma placa multipocillo. La expresión se calculó en relación con los genes de referencia act-1 y CDC-42 utilizando el software iO5. Todos los datos recopilados se habilitaron para el estudio de genes de acuerdo con las instrucciones del usuario de BioRad, y la expresión se calculó utilizando la expresión normalizada (ddCr). Se agregó la eficiencia de cada reacción de par de cebadores para la correcta cuantificación de la expresión normalizada. La eficacia se evaluó con diluciones 1:20, 1:100, 1:500 y 1:2500 del ADNc. A partir de los valores de expresión normalizados, se calculó el cambio de veces en comparación con el tipo salvaje para cada réplica.

2.2. Células mamíferas

2.2.1.Cultivo de Células Cos7

Las células Cos7 (ATTC, #CRL-1651) se cultivaron a 37 grados y 5 por ciento de CO, en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco/ThermoScientific, Dreieich, Alemania) con 1 por ciento de piruvato, 1 por ciento de Glutamax y 1 0 por ciento de suero fetal bovino (FBS) (Gibco/ThermoScientific, Dreier-ich, Alemania) y penicilina adicional (10,000 unidades/ml)/estreptomicina (10,000 ug/ mL） Tan pronto como las células construyeron un césped celular confluente, se separaron de la base utilizando 0,05 por ciento de tripsina/EDTA (Thermo Scientific, Dreieich, Alemania).

2.2.2. Plásmidos de transfección

Utilizamos los siguientes plásmidos para la transfección de las células Cos7: pcDNA3, pcDNA3-Ahr-1-VP16,pcDNA3-AhA-1-VP16,pcDNA3-AhR -1(45 de julio)-VP16, p1A1-FL, Perl-TK. Los plásmidos están descritos por Larigot et al. (presentado junto con este estudio). El plásmido p1A1-FL lleva una luciferasa inducible por XRE, Perl-TK lleva una luciferasa de renilla y el pcDNA3-Ahr-1-VP16 y pcDNA3-AhA{{24 }}VP16 lleva secuencias para la expresión de C.elegans AHR-1 y AHA-1, respectivamente. Para este estudio, creamos pcDNA3-AhR-1(LBD)-VP16 mediante mutagénesis dirigida al sitio del plásmido pcDNA3-Ahr-1-VP16 con QuikChange II Site-Directed Kit de mutagénesis (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.). El siguiente par de cebadores se usó para crear una sustitución de L por A en L363 y una sustitución de H por Q en H365 de AHR-1:LBD-F5'-GAGAGCATCGGCGCGACCCAACGGCTGCTGAACGAG 3'andLBD-R5'-CTCGTTCAGCAGCCGTTGGGTCGCGCCGATGCTCTC-3 Se transformaron células XL1-Blue supercompetentes con el plásmido obtenido para la amplificación. La secuencia del plásmido se verificó mediante secuenciación de Sanger.

2.2.3.Transfección transitoria de células Cos7

24 h antes de la transfección, se sembraron 20000 células/pocillo en una placa de 48-pocillos en 400 uL de DMEM (más 10 por ciento de FBS más antibióticos) y se incubaron a 37 grados. Luego, las células se transfectaron con las siguientes concentraciones de plásmido utilizando lipofectamina 200 (Invitrogen, Eugene, OR, EE. UU.): p1A1-FL (244 ng/pocillo), Phil-TK (36 ng/pocillo), pcDNA3- AhA-1-VP16 (5 ng/pocillo) y pcDNA3-VP16 (10 ng/pocillo), pcDNA3-Ahr-1-VP16 (5 ng/pozo) o pcDNA 3-AhR-1(ju145)-VP16(5 ng/pocillo) según lo descrito por Larigot et al. (presentado junto con este estudio). Se usó Lipofectamine 2000 en una concentración de 1 uL/pocillo y se preincubó con los respectivos plásmidos en DMEM durante 20 min antes de su uso. Para la transfección transitoria, las células Cos7 se incubaron con la mezcla de lipofectamina/plásmido para 3hin DMEM (más 10 por ciento de FBS) sin antibióticos para evitar la toxicidad inducida por antibióticos. Luego, el medio de transfección se eliminó y se reemplazó por 400 μl/pocillo de DMEM (más FBS al 10 por ciento más antibióticos). Las células transfectadas se incubaron a 37 grados. En cada placa, 2 pocillos de células no se transfectaron y, por lo tanto, se usaron con fines de normalización. 2.2.4.Tratamiento de Células Cos7

Se prepararon soluciones madre a concentraciones 1000-veces más altas que la concentración de tratamiento deseada para todos los compuestos. Se disolvieron curcumina (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania), benzo(a)pireno (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania), leflunomida (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) y luteína (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) en DMSO ( Carl Roth, Karlsruhe, Alemania), mientras que el resveratrol (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) y la rotenona (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania) se disolvieron en etanol (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania). A las 24 h después de la transfección, el medio de cultivo celular de las células se reemplazó con un medio de cultivo celular que contenía una dilución 1:100 del compuesto respectivo. Las células se trataron durante 24 h antes de evaluar la actividad de luciferasa.

2.2.5.Ensayo de luciferasa (Actividad AhR)

La actividad transcripcional de AhR se evaluó midiendo la actividad de una luciferasa impulsada por XRE [64]. Para ello, se utilizó un Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Wall Dorf, Alemania). Después de un tratamiento de 24 h, las células Cos7 se lavaron dos veces con PBS y luego se lisaron durante 15 min a TA usando el tampón de lisis pasivo incluido en el kit Dual-Luciferase Reporter Assay. Se colocó un total de 20 μL de las células lisadas en una placa blanca 96-bien y se usó para las mediciones de luminiscencia. Los sustratos de luciferina (LARII) y vainilla (Stop&cGlo) se prepararon de acuerdo con la descripción del fabricante. Las muestras se cargaron en un luminómetro (EG&G Berthold microplate Luminometer LB 96V Microluminomat plus (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania), y los sustratos se conectaron al sistema de tubos del luminómetro. Primero, se agregaron 65 uL de LARII a cada pocillo. de la muestra y se midió la luminiscencia producida por la luciferasa de luciérnaga, luego se añadieron 65 μL de reactivo Stop&clo y se midió la luminiscencia producida por la luciferasa de Renilla Para evaluar la actividad de AhR a partir de las medidas de luminiscencia, realizamos el siguiente posprocesamiento pasos: Primero, la luminiscencia de las células no transfectadas se sustrajo de la luminiscencia de cada muestra para la corrección de fondo. En el siguiente paso, normalizamos la luminiscencia de la luciferasa a la luminiscencia de la renilla de la misma muestra para eliminar las diferencias en la tasa de transfección y la celda. número Se realizó otro paso de normalización a las células transfectadas con pcDNA-VP16 para cada grupo de tratamiento para eliminar AhR-indep efectos secundarios sobre la luciferasa impulsada por XRE.

Este artículo está extraído de Antioxidantes 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants