Hojas de olivo (Olea Europaea L) Extracto de nanopartículas lipídicas cargadas: optimización de los parámetros de procesamiento mediante diseño estadístico de Box-Behnken, caracterización in vitro y evaluación de la actividad antioxidante y antimicrobiana Parte 2

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2.5.6 Evaluación de la estabilidad

La estabilidad de la formulación optimizada (F9) se examinó según las directrices del Consejo Internacional de Armonización (ICH). La dispersión de SLN se tomó en tres viales de vidrio separados (10 ml en cada uno). Entre los tres viales, uno se almacenó en el refrigerador (4 grados ± 2 grados), el segundo a temperatura ambiente (25 ± 2 grados/60 ± 5 por ciento de HR) y el último se almacenó en una cámara de estabilidad (Termo Scientific, Suecia) a 40±2 grados/75±5 grados por ciento de HR. En un punto de tiempo específico, a saber, 1, 3, 6 meses, las muestras se tomaron y se examinaron para ciertos parámetros como el tamaño de partícula, la eficiencia de atrapamiento, el potencial zeta y PDI, etc., que se determinaron y compararon estadísticamente con datos de tiempo cero (inicial) . 2.5.7 Actividad antioxidante

Uno de los métodos más útiles para la detección del potencial antioxidante es el método de radicales libres 2,2-difenil-1-picril-hidrazil-hidrato (DPPH)2. La actividad de captación de radicales (es decir, el análisis de su capacidad de captación de radicales libres DPPH) de los OLP-SLN se evaluó espectrofotométricamente a 517 nm. La actividad antioxidante de OLP, así como de OPL-SLN, se determinó con la ayuda del método (DPPH). Se preparó una solución de DPPH ({{10}},1 mM) en etanol. Los OLP-SLN (equivalentes a 0,2 mg/mL de OLP) se dispersaron en tampón de fosfato y se dejaron durante 24 h para liberar el fármaco. También se preparó una concentración equivalente de OLP (0,2 mg/mL) y SLN en blanco en el mismo medio. En este estudio, el ácido ascórbico de concentración 0,2 mg/mL se tomó como estándar y la solución de DPPH se usó como control.cistancheSe mezclaron 3300 μL de DPPH en cada solución de OLP-SLN (500 μL), SLN en blanco y solución de OLP (500 μL). Cada mezcla de reacción se mantuvo en un baño de agua con agitador a 37 ± 0,5 grados durante 30 min en condiciones protegidas de la luz. Finalmente, la absorbancia de cada muestra se determinó mediante un espectrofotómetro UV-visible (Shimadzu 1800, Japón) a 517 nm utilizando etanol como blanco. Cada experimento se evaluó tres veces y los valores se presentan como media ± DE. El valor de la actividad antioxidante en forma de porcentaje de actividad eliminadora de DPPH se determinó mediante la siguiente fórmula (ecuación 2):

2.5.8 Estudio antimicrobiano

El estudio antimicrobiano de SLN cargados con OLP (lote optimizado F9) se realizó utilizando el método de difusión en pozos de agar. Se usaron cepas bacterianas como Staphylococcus aureus (Gram's positivo) y Pseudomonas aeruginoza (Gram's negativo) para la evaluación". mL) de cada bacteria se colocó individualmente en cada placa de agar nutritivo estéril con la ayuda de hisopos estériles incubados a 37 ± 0,5 grados durante 1 h.beneficios de la cistancheSe produjeron cuatro pozos de alrededor de 8 mm de diámetro cada uno en cada placa con la ayuda de un sacacorchos estéril. Aquí, SLN en blanco, control positivo (extracto puro), mezcla física (extracto OLP más blanco) y SLN y preparación optimizada de OLP-SLN (100 μL) se usaron para el estudio antimicrobiano y se colocaron en cada pocillo. . Las placas se incubaron a una temperatura de 37±0,5 grados. En puntos de tiempo predeterminados (6, 12, 24 h), las placas se retiraron y las zonas de inhibición alrededor de las paredes se midieron en mm con la ayuda de un calibrador.

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3. Resultados y discusión

3.1 Cribado preliminar y optimización previa de variables de forma latente

The highest solubility of OLP was found to be in compri-to 888 ATO as depicted in Fig.1. The descending order of OLP solubility/100 gm in different lipid was compritol 188 ATO(36.93±4.92mg)>Precirol ATO 5(29.37±3.01 mg)>GMS(23.84±2.73mg)>palmitic acid(21.41±2.81 mg)>ácido esteárico (16,25 ± 1,65 mg). Compritol 888 ATO se había utilizado como lípido para la preparación de SLN de base oral para la preparación de SLN.

Según los resultados del estudio de selección preliminar, se seleccionaron tween 80 y compritol 888 ATO como surfactante y lípido, respectivamente. Otros parámetros como la relación entre el fármaco y los lípidos (1:3-1:6), la concentración de surfactante (porcentaje, 1,5-4,5 por ciento) y la velocidad de homogeneización (rpm, 3000-6000 rpm), el tiempo de homogeneización (2 h), el tiempo de sonicación (10 min) se decidieron realizando los experimentos preliminares. Factores como la proporción de fármaco a lípidos (A), la concentración de surfactante (B) y la homogeneización (C) se optimizaron nuevamente mediante el uso de la metodología de superficie de respuesta (RSM) junto con 3-factores y 3-niveles BBD , y su influencia se detectó en factores dependientes, como el tamaño de partícula (Y1), la eficiencia de atrapamiento (Y2) y el PDI (Y3).

3.2 Preparación de SLN y optimización de SLNS cargados con OLP

Los valores de los parámetros preoptimizados como se describe

anteriores se ajustaron a BBD de diseño experto. BBD exploró la composición del total de diecisiete formulaciones con 5 puntos centrales. Se desarrollaron todas las formulaciones y se examinaron los valores de los parámetros dependientes, como el tamaño de partícula, la eficiencia de atrapamiento y el PDI, y se ajustaron a BBD para obtener el resultado final. Se generaron ecuaciones polinómicas y gráficos 3D que muestran la influencia de los factores independientes sobre los factores dependientes. El signo positivo de la ecuación polinomial exploró un efecto positivo y el signo negativo indicó un efecto negativo sobre las variables dependientes. El valor del análisis de regresión de variables dependientes reales y pronosticadas y el Análisis de datos de varianza de los modelos se presentan en las Tablas 1, 2 y 3 respectivamente. El modelo cuadrático se consideró el modelo mejor ajustado para todas las respuestas ya que en este caso se observó el valor más alto del coeficiente de regresión.

3.3 Efecto de ciertos parámetros sobre el tamaño de partícula (Y1)

La siguiente ecuación polinomial se obtuvo del BBD que indica el efecto de diferentes factores independientes sobre el tamaño de partícula (Y1):

La ecuación anterior mostró que compritol 888 ATO mostró un efecto positivo sobre el tamaño de partícula mientras que tween 80 y la homogeneización mostraron una influencia negativa sobre el tamaño de partícula.

Aquí, las variables A, B, C, AB, BC y B" tuvieron un efecto significativo en el tamaño de partícula.colesterol cistancheAt a 95% confidence interval, the lack of fit was insignificant(p>0.05) mientras que se encontró que los parámetros restantes eran significativos (p<0.0001)with adequate="" precision（="">4）（Tabla 3）.Basado en el R²

(0.9996), el modelo cuadrático fue considerado como el modelo mejor ajustado con señal adecuada (Tabla 4).

Se encontró que el tamaño de partícula de diferentes lotes estaba en el rango de 112.35-277.46 nm. Si otras variables se mantenían constantes, el tamaño de partícula aumentaba al mejorar la proporción de fármaco a lípido (Tabla 1, lote F1 237.05 nm y F2 259.57 nm). Esto podría deberse a la agregación de las partículas debido a la cantidad insuficiente de tensioactivo para dispersar las partículas. Por otro lado, el surfactante (1.5-4.5 por ciento) mostró un efecto negativo en el tamaño de partícula (Tabla 1, lote F1 237.05 nm y F3 112.35 nm ). Esto podría deberse a una disminución de la tensión interfacial entre la fase acuosa y la lipídica que evita la agregación de partículas). La velocidad de homogeneización mostró un impacto negativo (Tabla 1, lote F5 187.46 nm y F7 134.27 nm) en el tamaño de partícula debido a la generación de una gran fuerza que rompe las partículas y, por lo tanto, reduce la tamaño de partícula. La ecuación 3 indicó que el efecto del tensioactivo (valor del coeficiente -40.87) exhibió un efecto más destacado sobre el tamaño de las partículas en comparación con la velocidad de homogeneización (valor del coeficiente -24.97).efectos secundarios de la cistanche deserticolaLa Figura 2 exploró la influencia de varios parámetros independientes sobre el tamaño de las partículas.

Cistanche puede antienvejecimiento

3.4 Efecto de ciertos parámetros en la eficiencia de atrapamiento (Y2)

La siguiente ecuación de polímero se obtuvo de BBD que muestra la influencia de diferentes parámetros independientes en la eficiencia de atrapamiento:

Aquí, las variables A, B, C, AB, AC, BC, A y B² tuvieron una influencia significativa en la eficiencia de atrapamiento. En un intervalo de confianza del 95 por ciento, la falta de ajuste fue insignificante (p<0.05)while the="" remaining="" parameters="" were="" found="" to="" be=""><0.0001)with adequate="" precision(="">4)(Tabla 3). El modelo cuadrático（R²=0.9991）fue considerado como el modelo mejor ajustado con una señal adecuada (Tabla 4).

A partir de la ecuación 4 anterior, se observa que el lípido (compritol 888ATO) mostró un efecto positivo mientras que los dos parámetros restantes mostraron una influencia negativa en la eficiencia de atrapamiento. El tensioactivo (valor del coeficiente -7.23) tuvo un efecto más destacado en comparación con la velocidad de homogeneización (valor del coeficiente -5.76). El efecto positivo de los lípidos sobre la eficiencia de atrapamiento (Tabla 1, lote F1 y F2) se debió a la disponibilidad de más lípidos para el alojamiento de los fármacos disponibles. Se observó un efecto variable sobre la eficiencia de atrapamiento. En la etapa inicial, al aumentar el surfactante, el valor de la eficiencia de atrapamiento aumentó, pero al aumentar aún más el surfactante, disminuyó debido a la fuga del fármaco en el ambiente externo (Tabla 1, lote F1 y F3). La velocidad de homogeneización mostró un efecto negativo en la eficiencia de atrapamiento debido a una mayor fuerza de corte que podría ser responsable de la expulsión del fármaco (Tabla 1, lote F5 y F7). La Figura 3 exploró el efecto de varios parámetros independientes en

3.5 Influencia de parámetros independientes en PDI(Y3)

Siguiente ecuación polinomial que muestra la influencia de varios parámetros en el PDI:

Here,variables like A,B, C,AB,AC,BC,A2,and C°had a significant effect on the PDI. At a 95% confidence interval, the lack of fit was insignificant(p>0.05) mientras que se encontró que los parámetros restantes eran significativos (p<0.0001)with adequate="" precision(="">4)(Tabla 3). El modelo cuadrático (R=0.9991) se consideró como el modelo mejor ajustado con una señal adecuada (Tabla 4).

A partir de la ecuación 5, se establece que los tres parámetros independientes, como la proporción de lípidos del fármaco, el tensioactivo y la velocidad de homogeneización, tuvieron un efecto positivo en el PDI. El efecto dominante se debió a la velocidad de homogeneización (valor del coeficiente 0.048) seguido de los lípidos (valor del coeficiente 0.046) y el menor fue el tensioactivo (valor del coeficiente 0,014). Debido a la homogeneización, la energía cinética del sistema se volvió algo alta, lo que provocó la colisión y agregación de nanopartículas lipídicas (Tabla 1, Lote F9 y F11). Una alta concentración de surfactante produjo más partículas pequeñas que forman un puente con partículas grandes y, por lo tanto, producen falta de uniformidad que mejora la PDI. El aumento de la concentración de lípidos a un nivel constante de tensioactivo provocó la coagulación de las partículas, lo que resultó en una distribución no uniforme del tamaño de las partículas. La Figura 4 explora la influencia de varias variables independientes en el PDI). En base a tres características, es decir, tamaño de partícula, eficacia de atrapamiento y PDI, el lote F9 se consideró una formulación optimizada con un valor de tamaño de partícula, eficiencia de atrapamiento y PDI de 277,46 nm, 80,48 por ciento y 0,275 respectivamente.

3.6 Caracterización de OLP-SLN

3.6.1 Evaluación del tamaño de partícula, PDI y potencial zeta

Se encontró que el valor del tamaño de partícula, PDI y potencial zeta del lote optimizado (F9) era 277.46 nm, 0.282, (Fig. 5A) y -23.18 mV respectivamente. El pequeño valor de PDI(<0.5)indicates the="" uniform="" or="" mono="" distribution="" of="" particles="" without="" any="" aggregation="" in="" the="" developed="" slns="" dispersion.="" a="" similar="" finding="" was="" observed="" by="" yasir="" et="" al.="">dosis de cistanche redditdurante la producción de SLN cargados con buspirona para la administración de la nariz al cerebro. Tanto el tamaño de las partículas como la carga superficial son importantes en el caso de la administración de fármacos mediante nanopartículas. Se cree que las partículas de tamaño inferior a 500 nm escapan del mecanismo de fagocitosis inducido por los macrófagos. El potencial zeta en forma de carga superficial negativa (alrededor de -20 mV) es deseable para la estabilidad adecuada de la nanoformulación. El valor observado del potencial zeta fue -23.18 mV, lo que indica una buena estabilidad física

de la dispersión de los SLN. Un papel importante de las nanopartículas de superficie negativa es su atracción por las proteínas cargadas positivamente de los tejidos dañados y ayudan a regular el proceso de oxidación". La formulación optimizada desarrollada

(F9) cumplía con ambos criterios de tamaño de partícula y cargas superficiales.

3.6.2 Estudio morfológico

El lote optimizado de OLP-SLN desarrollados (F9) indica la forma aproximadamente esférica observada por el estudio TEM (Fig. 5B).

3.6.3 Eficiencia de atrapamiento (porcentaje)

Se encontró que la eficiencia de atrapamiento de los lotes desarrollados de SLN OPL estaba en el rango de 50.17-86.46 por ciento con 80.48 por ciento de formulación optimizada (F9), lo que indica una buena capacidad de atrapamiento de fármacos de los SLN desarrollados. 3.6.4 Estudio de calorimetría diferencial de barrido (DSC) Las propiedades como la cristalinidad y el comportamiento térmico de los OLP-SLN desarrollados son propiedades importantes que aseguran su aplicación en la administración de fármacos. El termograma DSC de OLP (fármaco), lípidos (compritol 888 ATO) y formulación optimizada (F9) se representa en la Fig. 6. El espectro térmico de OPL mostró un pico endotérmico corto y amplio a 65,23 grados pero subió a 100,96 la licenciatura . El compritol 88ATO mostró un pico endotérmico a 70,5 grados que se parece a su punto de fusión. El pico característico de OLP estuvo ausente en el termograma de formulación optimizada (F9). Aquí, solo se observó un pico comparativamente amplio alrededor de 67,81 grados, lo que significa el atrapamiento de OLP en la matriz lipídica que conduce a la formación de OLP-SLN4.

3.6.5 Liberación de fármacos in vitro

Se encontró que la liberación de fármaco de la formulación optimizada de OLP-SLN (F9) era del 95,29 ± 8,13 por ciento, como se muestra en la Fig. 7. La liberación de la formulación optimizada exhibió un bi-

patrón fásico es decir. liberación rápida inicial (23,83 ± 4,51 en la primera hora) debido a la liberación del fármaco absorbido en la superficie y luego sostenida (95,29 ± 8,13 por ciento en 24 h) debido a la liberación del fármaco desde la matriz de SLN. La cinética de liberación de la formulación optimizada en forma de OLP se detectó colocando los datos de liberación del fármaco obtenidos en los diferentes modelos cinéticos como se representa gráficamente en la Fig. 8. Se encontró que el valor máximo de R²（0.9984） era para el modelo cinético de primer orden. Por lo tanto, la cinética de primer orden se consideró el modelo mejor ajustado. Se encontró que el mecanismo de liberación era del tipo de difusión Fickian con el valor del exponente de liberación (n) 0.441.

3.6.6 Evaluación de la estabilidad

Bajo las condiciones de almacenamiento adecuadas, se espera que cualquier forma de dosificación desarrollada sea estable hasta su duración de uso (fecha de vencimiento). Aquí, la formulación de OLP-SLN optimizada desarrollada (F9) se almacenó en ciertas condiciones de almacenamiento según la especificación proporcionada por las pautas de ICH. La formulación almacenada a 4±2 grados (refrigerador) y las condiciones de la habitación (25±2 grados/60±5 por ciento de HR) no fueron significativamente (p<0.05) differ="" from="" the="" initial="" data(zero="" time)in="" respect="" of="" particle="" size,="" pdi,="" surface="" charge(zeta="" potential)="" and="" entrapment="" efficiency.="" a="" significant=""><0.05)in zeta="" potential(-19.27="" mv)and="" entrapment="" efficiency="" (73.29%)and="" a="" significant=""><0.05)in particle="" size(388.37="" nm)was="" observed="" in="" the="" formulation="" stored="" at="" 40±2℃/75±5%="" rh.it="" might="" be="" due="" to="" the="" partial="" loss="" of="" surfactant="" covering(hence="" zeta="" potential="" reduced)which="" leads="" to="" aggregation="" of="" particles(hence="" particle="" size="" increased)and="" leakage="" of="" a="" drug="" in="" the="" external="" environment="" (hence="" entrapment="" efficiency="">

3.6.7 Actividad antioxidante

La principal acción de la OLP es prevenir la peroxidación limpiando los radicales libres y contribuyendo a paliar las lesiones provocadas por el estrés oxidativo. Como se muestra en la Fig. 9, la OLP libre mostró un 48,38 ± 5,28 5 por ciento de antioxidante, lo que es significativamente (p<0.01)less than="" the="" anti-oxidant="" activity="" (67.93±7.37%)of="" optimized="" formulation(f9).="" this="" could="" be="" due="" to="" the="" nano-size="" of="" the="" lipid="" particles="" which="" offered="" a="" higher="" surface="" area="" for="" the="" chemical="" quenching="" and="" also="" protect="" the="" olp="" in="" the="" external="" environment.="" no="" absorbance="" was="" found="" for="" the="" blank="" slns="" and="" hence="" blank="" slns="" did="" not="" exhibit="" any="" radical="" scavenging="" activity.="" similar="" findings="" were="" reported="" previously".="" the="" value="" of="" anti-oxidation="" activity="" for="" ascorbic="" acid="" was="" supposed="" to="" be="" 69.42±5.38%="" which="" was="" not="" significantly=""><0.05)from the="" optimized="" formulation(f9).="" 3,6.8="" anti-microbial="">

El estudio mostró el potencial antimicrobiano de la formulación de SLN desarrollada de OLP (F9) contra bacterias como Staphylococcus aureus (Gram's positivo) y Pseudomonas aeruginosa (Gram's negativo) como se muestra en la Fig. 10. El resultado mostró que no había zona de inhibición. para la formulación en blanco ya que estaba libre del extracto OLP.

La máxima zona de inhibición para el control positivo y la mezcla física (extracto OLP más SLN en blanco) se observó dentro de las primeras 6 horas. Después de esta duración (primeras 6 h), no hubo cambio en la zona de inhibición del control positivo y la mezcla física. El valor de la zona de inhibición para control positivo frente a Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus fue de 7,5±1,25 mm y 8±1,30 mm respectivamente. De manera similar, el valor de la zona de inhibición para la mezcla física (extracto OLP más SLN en blanco) contra Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus resultó ser de 8,25 ± 1,9 mm y 8,60 ± 2,1 mm, respectivamente. Por otro lado, los SLN cargados con OLP exhibieron el efecto antimicrobiano durante más tiempo (hasta 24 h) en comparación con OLP libre y la mezcla física. Esto se debe a la liberación sostenida de OLP de la formulación de SLN. El efecto antimicrobiano de los SLN cargados con OLP contra bacterias grampositivas

y las bacterias gramnegativas se observaron hasta por 24 h. El efecto antimicrobiano de los OLP-SLN fue significativamente (p<0.001)more than="" that="" of="" olp="" extract="" and="" physical="" mixture="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus.="" the="" value="" of="" the="" zone="" of="" inhibition="" of="" opl-slns="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus="" was="" observed="" at="" 14.75±2.25="" mm="" and="" 16.30±2.1="" mm="" in="" 24="" h="" respectively.="" moreover,="" study="" findings="" indicated="" that="" all="" formulations="" containing="" olp="" extract="" exhibited="" better="" anti-microbial="" efficiency="" towards="" gram-positive="" staphylococcus="" aureus="" as="" compared="" to="" gram-negative="" pseudomonas="" aeruginosa,4".="" to="" the="" best="" of="" our="" knowledge,="" the="" previous="" report="" showed="" that="" the="" major="" constituents="" for="" antimicrobial="" activity="" present="" in="" the="" olive="" extract="" are="" cyclotrisiloxane="" hexamethyl(36.98%),="" cyclo-tetrasiloxane="" octamethyl(15.18%),="" and="" cyclopentasilox-ane="">

4. Conclusión

En este estudio, el polvo de extracto de hojas de olivo, que era menos estable en condiciones ambientales normales, se convirtió con éxito en una formulación estable de SLN. La formulación optimizada exhibió un tamaño de partícula prometedor, eficiencia de atrapamiento y cargas superficiales. La formulación optimizada exhibió un patrón de liberación sostenida del fármaco hasta 24 h después de la cinética de liberación del fármaco de primer orden y el mecanismo de liberación del fármaco del tipo de difusión de Fickian. Se realizó el estudio de estabilidad y la formulación optimizada (F9) fue estable en las condiciones de almacenamiento indicadas. La formulación de OLP exhibió una propiedad antioxidante prometedora, tal como lo justifica el método de ensayo DPPH. La actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus) y Gram negativas (Pseudomonas aeruginosa). Finalmente, se concluyó que los SLN podrían ser los portadores prometedores para la entrega de polvo de extracto de hoja de olivo.

Este artículo está extraído de J. Oleo Sci. 70, (10) 1403-1416 (2021)