Autofluorescencia como biomarcador no invasivo de senescencia y productos finales de glicación avanzada en Caenorhabditis Elegans

Para evaluar la utilidad de la autofluorescencia como biomarcador no invasivo de senescencia en Caenorhabditis elegans, medimos la autofluorescencia de nematodos individuales mediante espectrofluorimetría. La fluorescencia de cada gusano aumentó con la edad. Los animales con menor intensidad de fluorescencia exhibieron una mayor esperanza de vida. Cuando las proteínas extraídas de los gusanos se incubaron con azúcares, la intensidad de la fluorescencia y la concentración de productos finales de glicación avanzada (AGE) aumentaron con el tiempo. La ribosa mejoró estos cambios no solo in vitro sino también in vivo. El bloqueador de la glicación rifampicina suprimió este aumento de la fluorescencia. La espectrometría de masas de alta resolución reveló que las vitelogeninas se acumulaban en gusanos viejos y las vitelogeninas glicosiladas emitían una fluorescencia seis veces mayor que las vitelogeninas vírgenes.El aumento de la fluorescencia con el envejecimiento se origina a partir de sustancias glicosiladas.y por lo tanto podría servir como un biomarcador no invasivo útil de AGE.Cistanchepuede servir como un nuevo modelo para buscar factores anti-AGEy estudiar la relación entre AGEs y senescencia.

CistancLas hierbas para los factores anti-AGE

INTRODUCCIÓN

La esperanza de vida media en los seres humanos se ha ampliado drásticamente en los países desarrollados durante el último medio siglo. Sin embargo,el daño progresivo con el envejecimiento causa efectos perjudiciales en las funciones fisiológicas, conocido comosenectud, yenfermedades relacionadas con la senescenciatambién están aumentando enproporción con la longevidad. Extensión de la"lapso de la salud" ahora es necesario en lugar de extender la vida útil solo. Se desean intervenciones que retarden la senescencia y amplíen la duración de la salud. Brener et al. introducidoCaenorhabditis elegans, que es un pequeño nematodo del suelo de vida libre que se alimenta de bacterias, para su uso enestudios de genética molecular de la diferenciación y el desarrollo.

Posteriormente, el gusano se ha utilizado ampliamente como sistema experimental para estudios biológicos, incluida la investigación sobre la senescencia, debido a este animal.'s simplicidad, transparencia, facilidad de cultivo, corta vida útil e idoneidad para el análisis genético2. En el gusano, la senescencia puede examinarse mediante la atenuación de la capacidad locomotora, la resistencia al estrés, la capacidad cognitiva y el bombeo faríngeo, y mediante la acumulación del denominado pigmento de edad lipofuscina.3–5 .

Una variedad de productos químicos, incluidos los antioxidantes y varios medicamentos, son candidatos para prevenir la senescencia6,7. Además, dado que informamos que la duración de la salud y la vida útil de los nematodos podría extenderse al alimentarse de bacterias probióticas8,9, varios laboratorios también han demostrado los efectos de longevidad de las bacterias beneficiosas10–12. Los efectos de la longevidad se han examinado mediante curvas de supervivencia, pero tales estudios en gusanos requieren más de 3 semanas, a pesar de la vida relativamente corta de los gusanos.C. elegans. Para evaluar los efectos de las intervenciones contra la senescencia, se desean indicadores de senescencia convenientes y no invasivos para rastrear la influencia en gusanos individuales y (en última instancia) en humanos como objetivo final.

La lipofuscina, un denominado pigmento de la edad, se ha utilizado ampliamente como indicador de la senescencia. Sin embargo, la relación exacta entre la autofluorescencia, la senescencia y la vida útil del gusano sigue sin estar clara. Gerstbrein et al. informó que los pigmentos de la edad son indicadores válidos de la vida útil de los nematodos13, mientras que Coburn et al. informó que la fluorescencia azul (longitudes de onda de excitación/emisión centradas en 340/430 nm) sirve como marcador de muerte durante varias horas antes y después de la muerte enC. elegans14. Se ha sugerido que los aumentos en la autofluorescencia azul a lo largo del tiempo observados en poblaciones de adultos mayoresC. eleganspodría reflejar no la tasa de envejecimiento o el estado de salud de la población per se, sino la fracción de individuos muertos o casi muertos en la muestra15.

Los productos finales de glicación avanzada (AGE) han atraído la atención científica16 porque se forman en grandes cantidades en casos de diabetes, pero también durante el envejecimiento fisiológico, y conducen al estrés oxidativo. Los AGE son compuestos complejos formados por reacciones no enzimáticas entre azúcares reductores y grupos amino en proteínas, lípidos o ácidos nucleicos; Las bases de Schiff y los productos de Amadori luego se forman a través de reacciones de Maillard, produciendo AGE. El contenido de AGE es alto en pacientes con diabetes, artritis reumatoide, Alzheimer'enfermedad de s, y otras enfermedades17–19. En pacientes con diabetes, la acumulación de AGE se correlaciona bien con la gravedad de la enfermedad microvascular y aumenta con la edad. Sin embargo, queda por dilucidar si los AGE representan una causa de la patogenia o son solo productos secundarios. Los AGE también se consideran como posibles causas de la senescencia.20,21, como se sugiere a partir de los resultados de unC. elegansmodelo de toxicidad del azúcar22,23.

Se ha desarrollado un método sistemático de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) mediante el empleo de anticuerpos con especificidad para varios compuestos de AGE.24–26. Sin embargo, también se requieren métodos no invasivos que permitan estimaciones aproximadas de los niveles de AGE. Dado que se informa que varios AGEFloridafluorescentes y sus asociadosFloridaintensidad de fluorescencia muestra un signifífino puede correlacionarse con los niveles medidos por ELISA27, examinamos si esteFloridaLa fluorescencia podría emplearse como un marcador alternativo para rastrear el estado de los AGE y la senescencia en unC. elegansmodelo.

Para verificar si lo observadofluorescenciasimplemente refleja la muertefluorescenciareportado por Coburn et al., los gusanos fueron examinados rastreando elFloridafluorescencia de gusanos individuales mientrascronometrando la muerte de los respectivos animales. Además, elefectos de los inhibidores de la formación de AGE enfluorescenciay la acumulación de AGE también se investigaron para validar la utilidad deC. eleganscomo animal modelo para la investigación de AGE.

RESULTADOS

Autofluorescencia de proteínas extraídas como biomarcador de envejecimiento y AGEs en gusanos

La espectrofotometría de fluorescencia de las proteínas extraídas indicó que la excitación a 325–365 nm hizo 17-gusanos de un díaFloridauoresce con la emisión más alta en el 400–Intervalo de 430 nm (pico 420 nm) (Fig.1a). El azulFloridaLa fluorescencia fue comparativamente más baja durante la edad adulta joven (3-días a 5-días) pero aumentó con el tiempo (en animales de 7-días) (Fig.1b). La lipofuscina, un llamado pigmento de la edad, emiteFloridafluorescencia (excitación a 530–560 nm, emisión a 585–645nm)15; en nuestro estudio anterior, este marcador se detectó en gusanos de edad avanzada (más de 13-días)9. 

Desde el autoFloridauorescencia encontrada en el presente estudio apareció en una etapa anterior y aumentó con el tiempo, auto azulFloridaSe esperaba que la fluorescencia fuera un mejor biomarcador para rastrear la senescencia. Dado que se sabe que varios compuestos de AGE son autofluorescentes27, examinamos la relación entre los contenidos de AGE y el azulFloridafluorescencia por transferencia Western en la que un anticuerpo contra Nε- Se utilizó (carboximetil) lisina (CML), un AGE representativo. La transferencia mostró que una banda sobresaliente se amplificó con el tiempo (Fig.1c y la Fig. 1 complementaria). De hecho, la cuantificación de la región indicó un aumento de AGE (Fig.1d), aunque CML no es automáticoFloridafluorescente

Para determinar si el autoFloridala fluorescencia indicaba indirectamente unaaumento de AGE formados por la reacción de Maillard, proteínasextraídos de homogeneizados de gusanos se incubaron asépticamente durante un máximo de 4 semanas con azúcares reductores como glucosa, ribosa y fructosa. ElFloridaLa fluorescencia de las proteínas aumentó con el tiempo en presencia de azúcares, mientras que no hubo un aumento marcado enFloridafluorescencia en reacciones realizadas sin azúcares (Fig.2a). Las proteínas del gusano se convirtieronFloridafluorescente a través de la glicación incluso in vitro. Entre las reacciones realizadas con cada uno de los tres azúcares, aquellas con ribosa produjeron la mayorFloridafluorescencia, seguida por los otros dos azúcares. EsteFiEl hallazgo podría explicarse por un informe de Bunn y Higgins en el que la reactividad de cada monosacárido con grupos amino para formar enlaces de base de Schiff depende de la medida en que existe en la estructura abierta (carbonilo) en lugar de en un anillo ( hemiacetal o hemiketal), y las tasas de reactividad aumentaron en el orden de ribosa (10.0), fructosa (4,5) y glucosa (0,6) (×10−3 milímetro−1 h−1 ), respectivamente28.

Fig. 1 Espectrofotometría de fluorescencia y AGE de muestras de proteína de lombriz. unGráficos de matriz de emisión de excitación (EEM) de autofluorescencia de gusanos lisados ​​a 3-días y 17-días. ElFloridalos niveles de fluorescencia en la longitud de onda de emisión en los gráficos EEM se muestran como mapas de calor de colores. Se lisaron cien gusanos (N2 de tipo salvaje) de 3-días y 17-días en 3 µl de tampón de lisis y 4 µl de SDS al 15 por ciento. Las proteínas se liberaron mediante ciclos de congelación y descongelación y los espectros fotoluminiscentes se recogieron con unFloridaespectrofotómetro de fluorescencia (Hitachi FL-4500). Las propiedades de fluorescencia de los nematodos lisados ​​​​se analizaron utilizando EEMFloridaespectroscopia de fluorescencia. Excitación a 325–365 nm hizo 17-gusanos de un díaFloridauoresce con las emisiones más altas en los 400–Trayectorias correspondientes a intervalos de 430 nm como una serie deFloridaintensidades de fluorescencia, mientras que 3-gusanos jóvenes de un día noFloridafluorescente Análisis multivariante (excitación de longitud de onda única con emisión de longitud de onda múltiple y exploración sincrónicaFloridauorometry) produjo gráficos EEM que consisten en excitación de un solo escaneo.b niveles de autoFloridafluorescencia (ex 340/em 360–600) por muestras de proteína de lombriz extraídas de animales de cada grupo de edad (3–13 días). Los gusanos (N2 de tipo salvaje) se recogieron en tubos, se lavaroncincoveces, y lisado en cada tubo. A continuación, las muestras se molieron utilizando un molinillo inalámbrico Mini (Funakoshi, Tokio, Japón) para liberar la proteína. Los contenidos de proteína se midieron cuantitativamente como se describe en los Métodos. AFloridase determinó el espectro de fluorescencia para cada 30-µL de muestra (que contenía 1,5μg de proteína total) utilizando un lector de microplacas de rejilla multimodo modelo SH-9000Lab (Corona Electric, Ibaraki, Japón). Cada medición se realizó tres veces.c Análisis de transferencia Western de la LMC de AGE en muestras extraídas de poblaciones de gusanos (N2 de tipo salvaje) de diferentes edades. Se muestra una fotografía representativa de tres experimentos reproducibles. Las transferencias se derivaron de diferentes partes del mismo gel (que se muestran en la Fig. 1 complementaria) y se procesaron en paralelo.d Cuantificaciónde AGEs en western blots usando densitometría. Las bandas rodeadas por marcos rectangulares en la Fig.1c se cuantificaron y los datos de tres experimentos reproducibles se muestran como media ± SE.

respectivamente.

Evaluar directamente si los aumentos enFloridaLa fluorescencia en presencia de azúcares se debió a la formación de AGE, se usó ELISA para detectar el compuesto CML de AGE representativo. La CML aumentó en estas reacciones, y el nivel en las muestras incubadas con ribosa fue casi siete veces mayor que en los controles incubados sin azúcares durante 4 semanas (Fig.2b). En comparación con la ribosa, las cantidades de CML producidas con glucosa o fructosa fueron bajas, similares a las de CML en el control; estehallazgoes concordante con un informe anterior29.

Autofluorescencia como biomarcador de envejecimiento y AGEs in vivo

A continuación probamos si elFloridaLa fluorescencia podría detectarse no solo a partir de proteínas extraídas sino también en gusanos vivos. Cuando se leyó la autofluorescencia de gusanos individuales en una película de envoltura de plástico estirada en 384-placas de pocillos con un lector de microplacas de rejilla multimodo, los resultados de la espectrofotometría fueron similares a los de las proteínas extraídas (Fig.3a). La intensidad individual del azul.FloridaLa fluorescencia aumenta con el tiempo (Fig.3b y la Fig. 2 complementaria), mientras que no hay rojoFloridala fluorescencia se detectó con este método. Desde azulFloridaSe ha informado anteriormente que la fluorescencia (340/430 o 350/460 nm) está asociada con la muerte14,15, el análisis se realizó excluyendo los datos obtenidos dentro de los 2 días anteriores a un animal'muerte Sin embargo, el azulFloridafluorescencia de los gusanos aún aumentó con el tiempo: el aumento deFloridapor lo tanto, la fluorescencia debe ser parcialmente independiente de la muerteFloridafluorescencia Para probar si la autofluorescencia podría ser un biomarcador de senescencia, examinamos cuántos días podían sobrevivir los gusanos después de medir la autofluorescencia en gusanos de 13-días. La esperanza de vida de cada gusano estaba inversamente relacionada con la intensidad de la autofluorescencia (Fig.3c).

ElFloridaLa intensidad de la fluorescencia también fue elevada en los gusanos cultivados con ribosa (Fig.4a); la vida útil de estos gusanos fue signifíficantly más corto que el de los gusanos de control (Fig.4b). Por el contrario, los gusanos que crecieron en un medio que contenía rifampicina, un bloqueador de AGE, emitieron menosFloridafluorescencia en comparación con los gusanos de control cultivados sin rifampicina (Fig.4C); el efecto pro-longevidad de la rifampicina se ha informado previamente30. Además,DAF-2, un mutante pro-longevidad representativo, también presentó menos autofluorescencia en comparación con el tipo salvaje (Fig.4d), mientras que elFloridala intensidad de fluorescencia del tipo salvaje aumentó con el envejecimiento.

una porción de laFloridaSe espera que la fluorescencia se derive de compuestos producidos en asociación con la muerte de animales. El azulFloridala fluorescencia podría ser el marcador de muerte que Coburn et al. observado enC. elegansdurante varias horas antes y después de la muerte; la luz azul vendría del ácido antranílico que se forma inmediatamente después de que mueren los gusanos14. Según se informa, la muerteFloridaLa fluorescencia es emitida por la forma glicosilada del ácido antranílico producido por la vía de la quinurenina.14. kyu-1en consecuencia, se esperaba que los gusanos mutantes, que carecen de la quinureninasa, no emitieran la muerteFloridafluorescencia Sin embargo, incluso en presencia de esta mutación, los gusanos envejecidos todavía parecían emitir másfluorescenciaque los gusanos más jóvenes (Fig.5a), y los gusanos cultivados en medio de crecimiento de nematodos (NGM) suplementado con ribosa exhibieron signifífiligeramente más altoFloridafluorescencia que los cultivados en ausencia de ribosa suplementaria o con sorbitol como azúcar de control (Fig.5b). La vida útil de los gusanos mantenidos con ribosa fue obviamente más corta que la de los demás (Fig.5c), lo que sugiere efectos a favor del envejecimiento de los AGE en gusanos.

Identificación de los materiales autofluorescentesIdentificar sustancias queFloridaen los animales envejecidos, se realizó un ensayo LC MALDI en las proteínas extraídas. Las seis proteínas más abundantes encontradas en cada muestra se enumeran en la Tabla1; en particular, las vitelogeninas y los factores de elongación se enriquecieron entre los principales-45FloridaProteínas fluorescentes en gusanos más viejos. Además, utilizando MS de alta resolución y el entorno computacional Mascot, buscamos proteínas que fueran más abundantes en gusanos de 15-días que en gusanos de 3-días e identificamos 180 proteínas (Tablas complementarias 1–3). Aunque las vitelogeninas nuevamente se enriquecieron (presentes en niveles seis veces más altos en los gusanos más viejos que en los adultos jóvenes), los niveles de factores de elongación fueron similares en los dos grupos (Fig. 3 complementaria). Para verificar si estas proteínas podían glicosilarse para formar AGE autofluorescentes, el factor de elongación purificado y la vitelogenina se incubaron con ribosa in vitro. La fluorescencia emitida por las vitelogeninas glicosiladas exhibió espectros similares a los obtenidos con extractos crudos recuperados de los gusanos de 17-días (Fig.6a). Aunque se sabe que la riboflavinaFloridauoresce, encontramos que la longitud de onda de emisión de la riboflavina era distinta dela de los extractos de lombrices. La fluorescencia FL de la vitelogenina glicosilada y el factor de elongación fueron seis y tres veces (respectivamente) las de las proteínas no glicosiladas a los 23 días in vitro (Fig.6b).

Los AGE detectados por Western Blot con anticuerpos anti-CML también aumentaron con el tiempo de gusanos de 3-días a 13-días in vivo (Fig.1C). Por Western Blot simultáneo con anticuerpos anti-vitelogenina, encontramos que las señales anti-CML eran bandas del mismo tamaño que las vitelogeninas (Fig.6C). Aunque las vitelogeninas YP170 e YP115 se acumularon con la edad durante este período, la intensidad de las señales de AGE aumentó más que el aumento en la cantidad de vitelogenina YP170 (Fig.6d). La microscopía de fluorescencia reveló que los gusanos de 13-días (Fig.7d–f, columnas 2 y 3) signi emitidofífiluz azul ligeramente más intensa que 3-adultos jóvenes de un día (Fig.7a–c, columnas 2 y 3; Higo.7gramo); las gónadas también se veían más brillantes (Fig.7d–f, columnas 1 y 2). CML es un AGE representativo, aunque CML en sí mismo no es fluorescente. Se sabe que la pentosidina, otro AGE, es fluorescente. Sin embargo, la inmunotinción sin anticuerpos anti-CML ni anti-pentosidina proporcionó diferencias destacadas entre gusanos viejos y jóvenes (datos no mostrados). Sin embargo, la anti-CML mostró una propagación difusa a través de los tejidos, mientras que la anti-pentosidina apenas mostró esto.