Componentes químicos de las hojas de Cistanche Ⅱ

3. Discusión

Se han llevado a cabo numerosas investigaciones fitoquímicas para identificar compuestos biológicamente activos en las hojas de caqui. Hasta el momento, se ha informado de un número considerable de triterpenoides y flavonoides, incluidos derivados de kaempferol y quercetina, deD. kaki[1]. En este estudio, obtuvimos 27 compuestos, incluidos dieciséisflavonoides, una ionona, dos cumarinas, siete triterpenoides y una acetofenona. De estos, compuesto1 se encontró que era un nuevo flflavonoide y compuesto2 primero fue aislado deD. kaki. Además, kaempferol-3-O- -200 -feruloil glucósido (3) solo se informó como un producto hidrolizado de 3-O- -(2-O-feruloil)-glucosil-7,40 -di-O- -glucosil kaempferol (3), aislado deAllium tuberosum[35]. Compuesto3 no solo se obtuvo directamente de una fuente natural por primera vez, sino que tampoco se ha informado enD. kakipreviamente. Además, el kaempferol-3-O- -200 -galoil galactósido (11) ha sido reportado previamente en muchas fuentes, incluyendoD. kaki, pero solo el1Se han informado H NMR y MS debido a la falta de investigación detallada. Por lo tanto, la13Los datos de C NMR se informaron por primera vez aquí.

Hasta ahora, ha habido pocos estudios que demostraran las capacidades antioxidantes de extractos o fracciones de hojas de caqui [37,38]. La mayoría de los estudios utilizaron métodos de ensayo rápidos como los ensayos DPPH o ABTS. En particular, en el artículo anterior, 200µg/ml de fracción rica en flavonoides mostró una inhibición del radical DPPH del 68,73 por ciento. Aparte de este resultado, sin embargo, esta fracción también mostró anión superóxidobarrido radical, captación de radicales hidroxilo y actividades quelantes de metales [38]. Aunque no evaluamos estos ensayos, se llevó a cabo un aislamiento guiado por bioensayo porque el extracto de etanol y la fracción de acetato de etilo en el presente estudio mostraron una actividad de eliminación de radicales DPPH comparable. Además, a pesar de los resultados anteriores, solo se han realizado unos pocos estudios para identificar compuestos biológicamente activos. Algunos secoiridoides y lignanos mostraron actividades de eliminación de radicales [39]. En el caso de los flavonoides, ha habido varios informes de quercetina, kaempferol y sus glucósidos tienen propiedades antioxidantes [40]. Se han informado las propiedades antioxidantes del glucósido de kaempferol asignado y del glucósido de quercetina asignado obtenido de otras fuentes.41]. Hasta el momento, no ha habido informes de que cada uno de estos compuestosderivado de las hojas de caqui tiene efectos antioxidantes, excepto que una mezcla de estos compuestos exhibió un efecto antioxidante [21]. 

Adicionalmente, hasta el momento, se ha llevado a cabo la determinación simultánea de solo unos pocos triterpenoides o flavonoides para el análisis cuantitativo de estos compuestos [42,43]. Sin embargo, el presente estudio sugiere un método para la determinación simultánea de la mayoría de los componentes en las hojas de caqui.

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4.1. Material vegetal

las hojas deDiospyros kakiThunb. (Ebenaceae) se adquirieron en un local coreanomercado de hierbas en Yeongcheon en marzo de 2018. Las hojas se cosecharon en el área de la cuenca rodeada de montañas a una altitud de 800–1200 m en Gyeongsangbuk-do en agosto de 2017. La cantidad promedio de precipitación anual en esta área fue de 1050 mm,de los cuales, la mitad cayó entre junio y agosto. La temperatura media anual fue de unos12.5 ◦C y la humedad relativa promedio fue de 69 por ciento. La temperatura al momento de la cosecha fueaproximadamente 37–40◦C. Las hojas obtenidas se secaron a aproximadamente 45◦C en una plantasecadora. Se ha depositado un espécimen comprobante (DIKA1-2018) en el Laboratorio de Ciencias NaturalesMedicina de Producto, Facultad de Farmacia, Universidad Kyung Hee, República de Corea.

4.2. Procedimientos Experimentales Generales

gel de sílice (ODS-A 12 nm S-150µm, YMC, Tokio, Japón). La cromatografía flash fue porformado utilizando un CombiFlash (Teledyne Isco, Lincoln, NE, EE. UU.) con cartuchos preempaquetados,RediSep-sílice (12 g, 24 g y 40 g) y RediSep-C18 (13 g, 26 g, 43 g y 130 g). preparaHPLC tive se realizó utilizando el sistema de purificación Gilson (Gilson, Middleton, WI,USA) con una columna YMC Pack ODS-A (250× 20.0 milímetros, 5,0µm, YMC, Tokio, Japón), una esferacolumna ODS-M80 (250× 20.0 milímetros, 4,0µm, YMC, Tokio, Japón) y un Luna C18(2)columna (250× 21,2 mm, 10,0µm, Phenomenex, Torrance, CA, EE. UU.). El análisis de HPLC fuerealizado en un sistema HPLC Youngin YL9100 que comprende una dispersión de luz evaporativadetector (Youngin, Anyang, Corea) con columna Luna C18(2) (150× 4,6 mm, 5.0µm, Phenomenex, Torrance, CA, EE. UU.). El cribado HPLC-ABTS en línea se realizó elun sistema HPLC Agilent 1200 con una columna YMC Pack ODS-A (150× 4,6 mm, 5.0µm). Todos los solventes usados ​​para las separaciones cromatográficas fueron destilados.

4.3. Extracción y Aislamiento

El material vegetal seco (15.0 kg) se extrajo con 216 L de etanol (EtOH) en unbaño maría a 60◦C durante 4 h, y el solvente se evaporó para obtener extracto de EtOH (1.2 kg,rendimiento del 8 por ciento). El extracto se suspendió en H2O (2,1 L) y se reparte con acetato de etilo(EtOAc, 4,9 L× 3) para dar EtOAc- (321,9 g, rendimiento 2,15 por ciento) y H2Capas solubles en O (748.0 g,rendimiento 4.99 por ciento), respectivamente. La capa soluble en EtOAc (321,9 g) se sometió a gel de sílicecolumna (φ 10.5 × 35.0 cm) conn- mezclas de exano:EtOAc:metanol (MeOH) (de 8:1,8:0,2a {{0}}:0:1v/v/v) para producir nueve fracciones (E1~E9).

La fracción E5 (14,2 g) se cromatografió sobre una columna Diaion HP-20 (φ 5.0 × 29.0 cm) con acetona: H2Gradiente O (7:3 a 1:0) para obtener siete fracciones (E5-1~E5-7). La fracción E5-1 fuesometido a una columna de gel de sílice conn-hexano:EtOAc: MeOH=7:2,7:0,3 a 0:0:1 para producir 4 fracciones(E{{0}}~E5-1-4). E5-1-1 (13,2 mg) y E5-1-2 (7,0 mg) se combinaron y purificaron mediante preparación(prep)-HPLC utilizando una columna YMC Pack ODS-A (H2O:MeOH=27:23,7 ml/min) para obtenercompuestos19 (8,3 mg, tR 26.0 min) y20 (2,5 mg, tR 24.0 min).

La fracción E8 (75,19 g) se fraccionó en solubles en acetona (AS) e insolubles en acetona.(AIS) fracciones. La fracción AS (44,07 g) se cromatografió sobre una columna Diaion HP-20(φ 6.5 × 12,5 cm) con acetona: H2O mezclas (3:7 a 1:0) para producir 12 fracciones (AS1~AS12).La fracción AS2 (2,5 g) se separó mediante una columna Sephadex LH-20 (φ 4.7 × 51.0 cm) conMeOH para dar nueve fracciones (AS2-1~AS2-9). La fracción AS2-2 (196,3 mg) se separó porcromatografía flash (FC) utilizando un cartucho RediSep-C18 (26 g, acetonitrilo: H2O, 0: 1 a7:1) para producir compuesto17 (28,6 miligramos). La fracción AS3 (3,1 g) se separó en 11 fraccionesutilizando una columna Sephadex LH-20 (φ 4.7 × 51.0 cm) con MeOH (AS3-1~AS3-11).

FracciónAS{{0}} (0,7 g) se separó mediante FC con RediSep-C18 (130 g, MeOH:H2O, 1:9 a 3:2) para darcompuestos4 (51,8 miligramos),5 (21,7 mg, tR 42,5 min), y6 (20,2 mg, tR 47.0 min). La fracción AS4 (8,8 g) se sometió a una columna de gel de sílice (φ 5.2 × 21.0 cm) con MC:MeOH:H2Mezclas de O (de 8:1.8:0.2 a 7:2.7:0.3) para aislar Compuestos7 (5.0 miligramos),8 (5,1 miligramos),9 (20,0 mg), 10 (306.6 miligramos), y12 (20,1 miligramos). La fracción AS5 se sometió a una columna de gel de sílice (φ 5.2 × 24,5cm)con CH2cl2:MeOH:H2O mezclas (8:1.8:0.2 a 7:2.7:0.3) para generar seis fracciones (AS5-1~AS5-6) para producir compuestos11 (3.0 mg) y13 (7,4 miligramos). Se separó la fracción AS10en siete fracciones utilizando una columna Sephadex LH-20 (φ 3.5 × 50,5 cm) con MeOH (AS10-1~AS10-7). La fracción AS10-4 fue separada por FC con un RediSep-C18 (43 g, MeOH:H2O,

0:1 a 3:2) cartucho para purificar compuestos1 (5,3 miligramos),2 (21,4 miligramos),14 (15,9 miligramos), y15 (40.4 mg). La fracción AS12 se separó en cinco fracciones utilizando una columna Sephadex LH-20 (φ 3.5 × 50,5 cm) con MeOH (AS12-1~AS12-5). Compuesto16 (20,1 mg) se obtuvo porrecristalización con MeOH a partir de la fracción AS12-5.

La fracción Als (31,1 g) se cromatografió en columna de gel de sílice con mezclas de hexano EtOAc:MeOH (8:1,8:0,2 a 0:0:1) como fase móvil para producir 20 fracciones (AIS1-AIS2{{20}}) La fracción AlS5 se sometió a una columna de gel de sílice con mezclas de n-hexano:EtOAc:MeOH (8:1,8: {{30}}.2 a 0:0:1) para proporcionar el compuesto 23 (224,7 g). La fracción AIS6 se separó mediante FC con un cartucho RediSep-C18 (43 g, MeOH:HO, 0:1 a 9:1) para dar el compuesto 25 (25,6 mg) La fracción AIS7 se sometió a una columna de gel de sílice con n -hexano:EtOAc: mezclas de MeOH (8:1,8:0,2 a {{60}}:0:1) para obtener los compuestos 24 (10 0,0 mg) y 27 (214,1 mg). La fracción AIS10 se sometió a una columna de gel de sílice con mezclas de n-hexano:EtOAc:MeOH (7:2,7:0,3 a 0:0:1) para aislar los compuestos 18 (5,0 mg) y 23 (16,7 mg). La fracción AIS11 se separó en 11 subfracciones (AIS11-1-AIS11-11) mediante FC con un cartucho RediSep-C18 (130 g, MeOH:HO, 1:1 a 4:1). El compuesto 22 (37,8 mg) se obtuvo a partir de la fracción AS11-4 mediante HPLC preparativa con una columna de esfera. La fracción AIS12 se sometió a una columna de gel de sílice (0 5,2 x 28,0 cm) con mezclas de HCl:acetona (de 4:1 a 3:2) para producir el compuesto 21 (188,0 mg). Finalmente, la fracción AIS16 se separó utilizando una columna Lichroprep RP-18 (1,99 g, MeOH:H2O, 3:2 a 13:7) para obtener el compuesto 3 (2,3 mg).

4.3.1. canferol-3-O- -D-200 -cumaroilgalactósido (1

) Polvo amarillento; pf 244.5◦C; [ ] 22 D -59.1◦ (c 0.1, MeOH); ultravioleta (MeOH)λmáximo(registroε) 207 nm (3,98), 315 nm (3,92); IR (ATR)νmáximo3458, 2922, 1650, 1588, 1364, 1260, 1175, 1076, 834cm−1 ; 1Mano13Datos de C NMR, consulte la tabla1; HRMS (modo positivo)m/z 595.1447 [M más H]más(calculado para C30H27O13, 595.1452). 

4.3.2. canferol-3-O- -D-200 -feruloilglucósido (3) 

polvo amarillento; pf 225.2◦C; [ ] 22 D -119.6◦ (c 0.1, MeOH); ultravioleta (MeOH)λmáximo(registroε) 210 nm (4,17), 327 nm (3,94); IR (ATR)νmáximo3369, 1652, 1599, 1512, 1360, 1264, 1177, 1076, 841cm−1 ; 1Mano13Datos de C NMR, consulte la tabla1; HRMS (modo negativo)m/z 623.1375 [M − H]− (calculado para C31H27O14, 623.1401).

4.3.3. kaempferol-3-0--D-2-galoilgalactósido (11)

polvo amarillo; RMN H (500 MHz, DMSO-) RMN 6 H 8.06 (2H, d,J= 9.0 Hz, H{ {8}}H-6'), 7.02 (2H, S, H-3, H-'), 6,87 (2H, d, I=9 0,5 H, H-, H-5, 6,39 (1H, S, H-8), 6,16 (1H s, H-6), 5,78 (1H, d, {{33 }},0 Hz, H-1 por ciento),5,27 (1H, t, =9,5 Hz H-2" RMN 13C (125 MHzDMSO-6) {{45 }}.1 (C-4), 165.4 (C-7), 165.4 (C-1), 161.2 (C-5), 160.1 (C{{59} }, 156,3 (C-2), 156,3 (C-9), 145,5 (C-4"), 145,5 (C-6", 138,4 (C{{74} }/), 132,5 (C-3), 131,0 (C-2'), 131,0 (C-6), 120,7 (C1), 119,8 (C-2') , 115,2 (C-3'), 115,2 (C-5, 108,9 (C-3), 108,9 (C-7), 103,8 (C-10) , 98,8 (C-6)98,8 (C-1 por ciento), 93,7 (C-8), 76,0 (C-5), 72,7 (C-3) , 71,1 (C-2 por ciento), 68,2 (C-4"), 60,1 (C-6").

4.4. Análisis cuantitativo de nueve compuestos en las hojas de caqui

El análisis de HPLC se realizó en un sistema Waters HPLC que comprende 1525 bombas y 2996 detectores de matriz de fotodiodos (Waters, Milford, MA, EE. UU.). La longitud de onda UV se fijó en 260 nm. Se utilizó una columna PhenomenexLuna C18(2) (150 x 4,6 mm, 5,0 um, Phenomenex, Torrance, EE. UU.), y el volumen de inyección fue de 10 ul. La temperatura de la columna se fijó en 25 grados. La fase móvil consistió en ácido trifluoroacético al 0,02 % (TFA, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, EE. UU.) en agua (A) y acetonitrilo (B) con un caudal de 0,7 ml/min. Las condiciones del gradiente fueron las siguientes: 0-30 min, 15-20 por ciento B; 30-45 min, 20-35 por ciento B: 45-70 min35-100 por ciento; 70-80 min, 100 por ciento . El extracto de EtOH (10 mg) se disolvió en 10 ug/mL de solución estándar interna (1 mL). Se llevó a cabo una validación del método simple para asegurar la relevancia del método desarrollado y los resultados cualitativos. Se analizaron cinco soluciones diferentes de cada compuesto para hacer cada curva de calibración. La precisión y la exactitud intradía e interdiaria se confirmaron mediante tres repeticiones en un solo día y tres días consecutivos. Todas las muestras se filtraron a través de filtros de membrana de 0,2 um.

4.5. Análisis DPPH y HPLC-ABTS en línea

La capacidad de las muestras para eliminar los radicales DPPH se evaluó en base a un artículo anterior. Brevemente, se mezcló DPPH ({{0}}.1 mM) en metanol (100 uL) con varias concentraciones de muestras (100 uL) durante 1 h en la oscuridad. La absorbancia se registró a 517 nm. El análisis HPLC-ABTS en línea se realizó en base al informe anterior con modificaciones. Una solución mixta que contenía ABTS (0,08 mM) con persulfato de potasio (0,12 mM) se transformó en un reactivo ABTS. El reactivo se almacenó a 4 C durante 12 h para estabilizar los radicales. Todas las muestras fueron analizadas por un sistema Agilent HPLC. Las condiciones de gradiente fueron las mismas que las utilizadas para el análisis cuantitativo. El eluato se envió a una función y se hizo reaccionar con el reactivo ABTS en un serpentín de reacción a 40 grados. El cromatograma se visualizó a 254 nm (pico positivo), así como a 734 nm (pico negativo), para registrar una disminución de los radicales aBIS.

5. Conclusiones En conclusión, este estudio presenta una investigación fitoquímica basada en el aislamiento guiado por bioensayo. Como resultado, un nuevo flavonoide, kaempferol-3-0-BD-2"-cumaroylgalactoside(1), y un nuevo compuesto natural, kaempferol-3-0--D-2"-feruloylglucoside (2 ), se aislaron junto con 25 compuestos previamente conocidos, incluidos catorce flavonoides, una ionona, dos cumarinas, siete triterpenoides y una acetofenona. Se evaluaron los efectos antioxidantes de todos los compuestos, y de estos, se encontró que nueve flavonoides poseían actividades. Se realizó un análisis cuantitativo simultáneo para confirmar que las hojas de caqui tienen efectos antioxidantes debido a estos compuestos.

Materiales complementarios:Los siguientes están disponibles en línea enhttps://www.mdpi.com/article/10 .3390/plants10102032/s1, Figuras S1–S9: Los espectros 1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC y ROESY NMR, UV, IR y HRMS del compuesto 1, Figuras S10–S18: Los espectros 1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC, ROESY NMR , UV, IR y HRMS del compuesto 3, Figuras S19–S20: Los espectros de RMN 1H y 13C del compuesto 11, Tabla S1: El análisis cuantitativo de los otros 18 compuestos.

Contribuciones de autor:JK y J.-EP hicieron contribuciones iguales a este estudio; conceptualización, H.-CK y D.-SJ; metodología y validación, JK, J.-EP, J.-SL, J.-HL y HH; software,JK y J.-SL; validación, JK y HH; análisis formal, JK y J.-EP; investigación, JK, J.-EP,J.-SL, J.-HL, HH, S.-HJ, H.-CK y D.-SJ; recursos, H.-CK y D.-SJ; curación de datos, JK, J.-EP y J.-SL; redacción—preparación del borrador original, JK, J.-EP y J.-SL; redacción—revisión y edición, H.-CK y D.-SJ; visualización, JK y J.-SL; supervisión, H.-CK y D.-SJ; proyectoadministración, H.-CK y D.-SJ; adquisición de fondos, S.-HJ, H.-CK y D.-SJ Todos los autores tienenleído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Conflictos de intereses:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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