Las vesículas de la membrana externa bacteriana inducen un cambio transcripcional en Arabidopsis hacia la activación del sistema inmunológico que conduce a la supresión del crecimiento de patógenos en las plantas

Abstracto

Las bacterias gramnegativas forman ampollas esféricas en la periferia de su célula, que luego se disocian de la pared celular bacteriana para formar vesículas extracelulares. Se ha demostrado que estas estructuras a nanoescala, conocidas como vesículas de membrana externa (OMV), promueven infecciones y enfermedades y pueden inducir respuestas inmunes típicas tanto en mamíferos como en plantas huéspedes. Para comprender mejor el amplio cambio transcripcional que sufren las plantas después de la exposición a OMV, tratamos plántulas de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) con OMV purificadas de la bacteria patógena de plantas Gram-negativa Xanthomonas campestris pv. campestris y realizó análisis de secuencia de ARN en OMV y plantas tratadas de forma simulada a las 2, 6 y 24 h después del desafío. El cambio transcripcional más pronunciado se produjo en los dos primeros puntos de tiempo evaluados, como lo refleja el número de genes expresados ​​diferencialmente y el cambio promedio. Las OMV inducen un cambio transcripcional importante hacia la activación del sistema inmunológico, regulando positivamente una multitud de vías relacionadas con el sistema inmunológico, incluida una variedad de receptores inmunológicos. La comparación de la respuesta de Arabidopsis a las OMV y a los elicitores purificados reveló que las OMV inducen un conjunto similar de genes y vías como los elicitores únicos; sin embargo, se detectaron vías activadas por las OMV y no por otros inductores. El tratamiento previo de las plantas de Arabidopsis con OMV y posteriormente la infección con un patógeno bacteriano condujo a una reducción significativa en el crecimiento del patógeno. Las mutaciones en el receptor del factor de alargamiento de la planta (EFR), el receptor de flagelina (FLS2) o el correceptor de quinasa asociado a 1 insensible a brasinosteroides (BAK1) no afectaron significativamente el efecto de preparación inmune de las OMV. En conjunto, estos resultados muestran que las OMV inducen un amplio cambio transcripcional en Arabidopsis que conduce a la regulación positiva de múltiples vías inmunes, y que este cambio transcripcional puede facilitar la resistencia a la infección bacteriana.

PALABRAS CLAVE

Arabidopsis thaliana, infección bacteriana, vesículas extracelulares, OMV, vesículas de membrana externa, inmunidad vegetal, RNA-seq, Xanthomonas campestris pv. campestris

Beneficios de cistanche para hombres: fortalece el sistema inmunológico.

1. INTRODUCCIÓN

Las plantas se enfrentan constantemente a microbios dañinos que prosperan en sus tejidos y obstaculizan el crecimiento normal. Una respuesta de defensa eficaz depende en gran medida de una detección e identificación rápidas y precisas del microbio invasor. Para este propósito, las plantas utilizan amplios sistemas de vigilancia para monitorear la invasión de patógenos (Cook et al., 2015). Se especula que la primera línea del sistema de vigilancia de la planta, o la primera interfaz celular donde interactúan las plantas y los microbios, es el espacio intercelular, el apoplasto. Allí, el reconocimiento de microbios invasores está mediado por receptores de reconocimiento de patrones (PRR) expuestos extracelularmente y unidos a membranas (Boutrot & Zipfel, 2017; Couto & Zipfel, 2016). Los PRR reconocen determinantes microbianos que están ampliamente presentes y conservados entre muchos microbios y se conocen como patrones moleculares asociados a microbios o patógenos (MAMP) (Ranf et al., 2016). Dado que los microbios experimentan mutagénesis a un ritmo rápido, los receptores inmunes evolutivamente útiles se adaptan para detectar regiones altamente conservadas de componentes microbianos cruciales que no pueden descartarse o mutarse fácilmente debido a un grave costo de aptitud. Por ejemplo, la flagelina bacteriana es un elemento crucial en la fisiología de muchos microbios, incluidos los patógenos, y actualmente es uno de los MAMP mejor estudiados (Felix et al., 1999; Zipfel et al., 2004). La percepción de la flagelina, o el epítopo sintético flg22 (compuesto por 22 aminoácidos altamente conservados en el extremo N del componente básico del flagelina, flagelina), por parte del receptor inmunológico de la planta afín que detecta la flagelina 2 (FLS2), conduce a un cambio transcripcional importante. , seguida de una respuesta inmune eficaz que detiene la infección (Chinchilla et al., 2007; Gómez-Gómez & Boller, 2000). Muchos MAMP conocidos están asociados con la pared celular del microbio. Por ejemplo, quitina fúngica (Fesel & Zuccaro, 2016), peptidoglicano bacteriano (PG) (Erbs et al., 2008; Gust et al., 2007), lipopolisacáridos bacterianos (LPS) (Dow et al., 2000; Silipo et al. ., 2005), flagelina (Boutrot & Zipfel, 2017; Felix et al., 1999) y más. Sin embargo, no está del todo claro cómo estos componentes asociados a la pared celular interactúan con sus receptores inmunes afines en la planta. Si esto ocurre debido a la muerte celular y/o la degradación de la pared celular, o mediante la liberación activa de componentes como el flagelo, es un tema que necesita más investigación (Bahar, 2020).

Un ejemplo de la liberación activa de fragmentos de pared celular por parte de bacterias Gram negativas es el desprendimiento de vesículas extracelulares (EV) que forman ampollas y se desprenden de la membrana externa hacia el entorno circundante (Kulp & Kuehn 2010; Théry et al., 2018). ). Estas EV bacterianas se denominan comúnmente vesículas de membrana externa (OMV) y de ahora en adelante nos adheriremos a esta nomenclatura (Schwechheimer & Kuehn, 2015). El proceso de liberación de OMV ocurre continuamente y bajo diversas condiciones ambientales, incluso durante la colonización del huésped (Gurung et al., 2011; Ionescu et al., 2014; Jin et al., 2011). Además de las moléculas integrales de la membrana externa, como las proteínas de la membrana externa (OM), los LPS y los lípidos, las OMV encapsulan fluidos periplásmicos, que consisten en una amplia gama de moléculas como proteínas, enzimas que degradan la pared celular, polisacáridos y ácidos nucleicos (Kuehn & Kesty, 2005). Dado que las OMV se liberan durante la colonización del huésped y que su carga consiste en MAMP, es tentador especular que actúan como portadores de inductores inmunitarios que entregan las moléculas inductoras muy cerca de sus receptores inmunitarios afines (Bahar, 2020; Katsir & Bahar, 2017). De hecho, se ha demostrado que las OMV inducen el sistema inmunológico tanto de los mamíferos como de las plantas cuando se presentan a sus huéspedes (Bahar et al., 2016; Ellis & Kuehn, 2010; Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). Mientras que en las células de mamíferos tanto el LPS como los componentes proteicos de las OMV actúan como inductores inmunitarios (Ellis et al., 2010), en las plantas aún no está claro qué moléculas de OMV son los principales inductores inmunitarios.

Además de modular la respuesta inmune del huésped, también se demostró que las OMV portan factores de virulencia y participan en una multitud de procesos. Esto incluye la comunicación célula-célula (Deatheragea & Cooksona, 2012; Mashburn & Whiteley, 2005; Raposo & Stahl, 2019), la entrega de toxinas a las células diana (Ellis & Kuehn, 2010; Kadurugamuwa & Beveridge, 1996), la formación de biopelículas (escolarización). & Beveridge, 2006), extinción de compuestos antimicrobianos (Manning & Kuehn, 2011), respuesta al estrés (MacDonald & Kuehn, 2013), transferencia horizontal de genes (Fulsundar et al., 2014; Velimirov & Ranftler, 2018) y virulencia (Ellis & Kuehn, 2010; Kunsmann et al., 2015). Si bien la mayoría de estos ejemplos provienen de estudios de bacterias patógenas de mamíferos, estudios recientes con bacterias patógenas de plantas también respaldan que las OMV promueven la virulencia bacteriana y la colonización de plantas. Ionescu et al. (Ionescu et al., 2014) demostraron que la producción de OMV por el patógeno vegetal Xylella fastidiosa durante la colonización de los vasos del xilema inhibe la unión bacteriana a los elementos conductores de agua de la planta (el xilema), inclinando el equilibrio entre las formas sésiles y móviles de la planta. patógeno hacia la forma móvil. Se cree que esta forma promueve la dispersión celular en el xilema, lo que lleva a un deterioro más rápido de la planta (Ionescu et al., 2014). Otros dos estudios han demostrado que los factores de virulencia, como las lipasas/esterasa y xilanasa secretadas de tipo II, y los efectores secretados de tipo III, se secretan en asociación con las OMV (Chowdhury & Jagannadham, 2013; Sidhu et al., 2008; Solé et al. ., 2015) lo que sugiere que la OMV puede tener un papel importante en la virulencia bacteriana. La complejidad molecular de las OMV, junto con sus funciones duales y posiblemente opuestas en el huésped (inducir inmunidad y promover la virulencia), nos lleva a estudiar la respuesta transcripcional más amplia de las plantas de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) al desafío de OMV y a probar si este cambio transcripcional induciría resistencia o susceptibilidad a una infección bacteriana posterior.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Material vegetal y condiciones de crecimiento.

En este estudio se utilizaron la línea Col-0 de tipo salvaje de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), así como las siguientes líneas mutantes: bak- (Schlesinger et al., 2011) y falls ever (Nekrasov et al., 2009). Las semillas de Arabidopsis se esterilizaron en superficie y se sembraron en placas de agar Murashige y Skoog (MS) como se describe (Bahar et al., 2016). Las placas se mantuvieron en la oscuridad a 4 ◦ C durante 2 a 4 días y luego se trasladaron a 22 ◦ C para la germinación durante 5 a 8 días. Las plántulas germinadas de tamaño similar se transfirieron a 24-placas de pocillos (dos plántulas por pocillo) que contenían 1 ml de medio MS con 1% (p:v) de sacarosa (Duchefa Biochemie) y se cultivaron durante otros 8 a 10 días a las mismas condiciones antes de desafiar con el elicitor como se describe a continuación. Para los ensayos de cebado, se germinaron semillas de la línea Col-0 de tipo salvaje de Arabidopsis y de las líneas mutantes (falls ever y back-) como se describe anteriormente y luego se trasplantaron a macetas de 7 × 7 × 6 cm (1 plántula/maceta) que contenían una mezcla. suelo Green #7611 (Evenari, Ashdod, Israel) y se cultivó en un fotoperiodo de 9,5 h a 22–24˚C. Las plantas eran

2.2 Purificación de vesículas de membrana externa bacteriana.

Existencias de glicerol de Xanthomonas campestris pv. campestris(Xcc) 33913 se sembraron en placas de Nutrient Agar (Difco, NA, Becton, Dickinson y Company) y se cultivaron durante 2 a 5 días a 28˚C. Se recogieron colonias individuales y se usaron para inocular un iniciador de YEB (caldo de extracto de levadura) de 3- ml que contenía 1 0 ug/ml de hidrato de cefalexina (Cp, Sigma-Aldrich). Los iniciadores se cultivaron durante la noche a 28 ◦C con agitación de 185–200 rpm y luego se usaron para inocular 500 ml de medio PSB (caldo de peptona y sacarosa) con antibióticos (como se describe anteriormente) en matraces de 2-L. en una proporción de ~1:1000 (v:v). Los cultivos se cultivaron como se describió anteriormente hasta una DO600 de 0,6 a 0,8 y luego se centrifugaron las células bacterianas y se extrajeron las OMV del sobrenadante como se describe (Mordukhovich & Bahar, 2017). Luego, la preparación de OMV en bruto se sometió a centrifugación en gradiente Optiprep para obtener OMV purificadas, como se describe (Bahar et al., 2016; Mordukhovich & Bahar, 2017). Cada lote de OMV se purificó a partir de 1,5-l de cultivo bacteriano y finalmente se resuspendió en 1 ml de PBS (pH 7,3). Las OMV purificadas se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a 4◦C hasta 7 días antes de su uso. La distribución del tamaño de las OMV se midió utilizando un dispositivo de dispersión de luz dinámica (Zetasizer Nano ZS, Malvern Panalytical, Worcestershire, Reino Unido) y tenía un diámetro medio de 121,7 ± 55,43 nm (SD). La concentración de partículas se midió de manera similar y se proporciona en la descripción de cada experimento a continuación.

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2.3 Desafío de plántulas de Arabidopsis con OMV

Para examinar la respuesta transcripcional de Arabidopsis a la exposición a OMV, se utilizaron plántulas de Col-0 cultivadas en placas de 24-pocillos como se describe anteriormente. El día antes de la exposición a OMV, se retiró el medio MS de las placas y se reemplazó con 250 ul de dH2O estéril, y las placas se dejaron en la mesa durante la noche. A la mañana siguiente, se agregaron a cada pocillo 20 ul de OMV purificadas (30 ug por ml correspondientes a 1,44 x 109 partículas por pocillo), o dH2O estéril como simulacro. Las plántulas se recolectaron 2, 6 y 24 h después de la exposición, se secaron sobre papel y se congelaron rápidamente con nitrógeno líquido en tubos Eppendorf Safe-Lock de 2- ml (Hamburgo, Alemania). En cada momento, se recolectaron cuatro pocillos tratados con OMV y cuatro pocillos tratados de forma simulada, lo que representa cuatro réplicas biológicas para cada tratamiento en cada momento.

2.4 purificación de ARN

El ARN se extrajo de plántulas de Arabidopsis utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El ARN se purificó aún más utilizando el kit Turbo DNA-free (Ambion, Thermo Fisher Scientific) y el kit de concentración y limpieza de ARN (Norgen Biotek) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN purificadas se sometieron a análisis de concentración y calidad utilizando una máquina TapeStation 2200 (Agilent Technologies), RNA Screen Tape y RNA Screen.

2.5 Construcción y secuenciación de bibliotecas de ARN.

Para cada tratamiento y momento, se seleccionaron para el análisis dos muestras que mostraban la mayor pureza. Se prepararon bibliotecas de ARNm TruSeq (Illumina) con captura PolyA a partir de muestras de ARN seleccionadas en el Instituto Corona de Genómica del Instituto Weizmann de Ciencias (Rehovot, Israel). Cada muestra fue etiquetada y se preparó un conjunto a partir de las muestras. Luego, este grupo se cargó dentro de dos carriles NGS y se ejecutó en la máquina de secuenciación Illumina HiSeq, en modo de ejecución de alto rendimiento, lectura única (SR) 60 (v4).

2.6 Secuenciación lee el procesamiento inicial

The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was > 

2.7 Ontologías genéticas y descripciones genéticas. 

Las ontologías genéticas (GO) se recuperaron utilizando las anotaciones GO de TAIR (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp). Las descripciones de genes, según los modelos genéticos, se obtuvieron mediante la búsqueda de descripción de genes de TAIR (//www.arabidopsis.org/tools/bulk/genes/). El enriquecimiento de GO se calculó utilizando la herramienta web AgriGO (http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php) utilizando el locus del genoma de Arabidopsis (TAIR10) como referencia.

2.8 Validación cuantitativa-PCR y RNA-seq

Para validar los datos de RNA-seq, se usaron muestras de ARN de plántulas desafiadas con OMV y simuladas para la síntesis de ADNc, seguido de PCR cuantitativa (qPCR) usando cebadores específicos de genes (Tabla complementaria S4), como se describe (Bahar et al. , 2016). En general, se probaron 17 DEG del conjunto de datos de RNA-seq, utilizando cuatro réplicas biológicas de ARN de plántulas tratadas con OMV o simuladas. La expresión relativa de los genes analizados se comparó con la expresión de ubiquitina, utilizando una máquina de PCR en tiempo real 7500 Fast (Applied Biosystems), como se describe (Bahar et al., 2016).

2.9 Comparación de la respuesta transcripcional de Arabidopsis a MAMP y OMV 

Nuestro conjunto de datos inducido por OMV se comparó con los transcriptomas disponibles de Arabidopsis desafiados con flg22, (Denoux et al., 2008) elf26 (Zipfel et al., 2006), PGN (Willmann et al., 2011), OG (Davidsson et al. , 2017) y LPS (Livaja et al., 2008). Para la comparación de datos, se realizó un enriquecimiento de términos GO y los GO inducidos se visualizaron mediante diagramas de Venn como se describe anteriormente.

2.10 experimentos de cebado de Arabidopsis

Para probar el efecto de preparación de Xcc OMV en Arabidopsis infectada con Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pst), seguimos el procedimiento descrito por Zipfel et al. (2004). En resumen, se infiltraron hojas de plantas de Arabidopsis de 6 a 8 semanas de edad, cultivadas como se describe anteriormente, con 50 a 100 ul de OMV Xcc purificadas (30 ug/ml, correspondientes a 3.6-7.2 × 109 partículas por hoja), 1 μM flg22, o agua usando una jeringa sin aguja. Para cada tratamiento se utilizaron 5 hojas/planta y tres réplicas de plantas. El inóculo de Pst se preparó cultivando la bacteria en placas de medio King's B (20 g/l de peptona, 1,5 g/l de MgSO4 x 7H2O, 10 ml/l de glicerol y 15 g/l de agar) a 28 ˚C durante 2 a 3 días. y luego resuspender las colonias con agua y ajustar la concentración del inóculo a 105 UFC/ml. El inóculo de Pst se infiltró en las hojas imprimadas 24 h después de la imprimación, utilizando una jeringa sin aguja (se infiltraron aproximadamente 100 ul en cada hoja). El crecimiento bacteriano se determinó a 0 (1 h después de la inoculación) y 2 días después de la inoculación (dpi) recolectando y pesando las hojas inoculadas, macerándolas en 1 ml de MgCl2 10 mM y sembrando diluciones en serie 10- veces en King's B placas de agar. El número de UFC en cada placa se determinó 2 días después y se calculó por g de hoja.

FIGURA 1 Respuesta transcripcional de Arabidopsis a OMV a los 2, 6 y 24 días después del desafío. Análisis de componentes principales (A) y matriz de correlación de muestras (B) de la respuesta transcripcional de plántulas de Arabidopsis a OMV, o simulada, a las 2, 6 y 24 h después del desafío

2.11 Ensayos de crecimiento bacteriano in vitro 

Para evaluar el efecto de las OMV Xcc purificadas sobre el crecimiento de Pst in vitro, se cultivaron Pststarters en medio líquido King's B durante 24 h a 28˚C y luego se usaron para inocular tres cultivos diferentes que contenían 12 ml de medio King's B cada uno, en {{3 }}Tubos Falcon de ml en una proporción de 1:100. Los cultivos bacterianos se modificaron con 30 ug/ml de OMV (1:50 o 1:100, correspondientes a 1,44 × 109 o 7,2 × 108 partículas por ml, respectivamente), o PBS como control, y se incubaron durante 20 h a 28˚C. El crecimiento bacteriano se midió utilizando un espectrofotómetro (Amersham Biosciences) a una densidad óptica (OD) de 600 nm durante 22 h.

3 RESULTADOS

3.1 El análisis de secuencia de ARN revela un gran conjunto de genes de Arabidopsis expresados ​​diferencialmente en respuesta al desafío OMV

Para estudiar el cambio transcripcional en Arabidopsis después del desafío con OMV, tratamos plántulas de Arabidopsis con OMV purificadas del patógeno bacteriano Xanthomonas campestris pv. campestris 33913 (Xcc) y recolectó ARN de la planta a las 2, 6 y 24 h después del desafío (hpc). Luego se secuenció y analizó el ARN de muestras tratadas con OMV y simuladas como se describe en Materiales y métodos. Los análisis de correlación principal (Figura 1A) y matriz de correlación de muestras (Figura 1B) muestran que las réplicas biológicas en cada tratamiento se agrupan muy juntas, una indicación de la similitud general de la respuesta transcripcional entre las réplicas biológicas. Las muestras tratadas con OMV en 2 y 6 hpc se agrupan juntas, lo que indica que el tratamiento con OMV tuvo un mayor efecto en la respuesta transcripcional que el tiempo de muestreo (Figura 1B). Por otro lado, las muestras tratadas con OMV se agrupan junto con su respectivo tratamiento simulado a 24 hpc, lo que indica que el cambio transcripcional inducido por las OMV en este momento había disminuido y era similar al de las plantas tratadas de manera simulada.

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En cada momento analizado, las plántulas tratadas con OMV se compararon con las plántulas tratadas de forma simulada y se extrajeron los genes expresados ​​diferencialmente (DEG). En todos los momentos combinados, se encontró que un total de 984 y 175 genes estaban significativamente (cambio logarítmico > 1 o ← 1, valor de p y FDR < 0.05) regulados hacia arriba o hacia abajo, respectivamente. en respuesta al desafío OMV (Figura 2A; Tabla complementaria S1). La expresión genética Log fold-change (LogFC) osciló entre un máximo de 9,08 (AT1G26410, 6 hpc), que corresponde a más de 500-veces de cambio, hasta -5.73 (AT3G17520, 24 hpc). El mayor número de DEG se encontró en 2 y 6 hpc, donde se identificaron un total de 647 y 876 DEG, respectivamente (regulados hacia arriba y hacia abajo combinados). A 24 hpc, se encontraron 121 grados. Más del 50 % de los genes regulados positivamente a las 2 y 6 h después del desafío con OMV se compartieron entre ellos (Figura 2B). Para examinar el cambio temporal en la expresión genética, extrajimos todos los DEG regulados positivamente que se encontraron en todos los momentos (37 genes) y comparamos su cambio a lo largo del tiempo (Figura 2C). La expresión de cambio de estos genes fue significativamente diferente entre los diferentes puntos temporales (ANOVA unidireccional; F2,108=8.1633, p=0.0005). Una comparación post hoc utilizando la prueba HSD de Tukey Kramer indicó que el LogFC tanto en 2 (M=3.45, SD=1.72) como en 6 hpc (M=3.87, SD=1.98) fue significativamente mayor que a 24 hpc (M=2.32, SD=1.31) (p=0.0145 y p=0 .0005, respectivamente) (Figura 2D). Si bien la expresión LogFC media a 6 hpc fue mayor que a 2 hpc, no fue estadísticamente diferente (p=0.5413). Por lo tanto, al considerar el número de DEG y el gen general LogFC en los tres momentos analizados, podemos concluir que el cambio transcripcional más significativo ocurrió a las 2 y 6 h después del desafío con OMV. Para examinar la validez de los resultados de RNA-seq, se determinó la expresión de 17 genes regulados positivamente mediante PCR cuantitativa (qPCR) con cebadores específicos. Catorce de los genes analizados mostraron el mismo patrón que en el análisis de secuencia de ARN y estaban regulados significativamente en comparación con el simulado. Tres de los genes probados tuvieron una expresión relativa más alta, pero no fueron significativamente diferentes de los simulados mediante este método (Figura S1 complementaria).

FIGURA 2 Genes de Arabidopsis expresados ​​diferencialmente en respuesta a la exposición a OMV. (A) Un número total de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) (regulados hacia arriba o hacia abajo, LogFC > 1 o ← 1, valor p y FDR < 0.05) en 2, 6 y 24 h post-desafío. (B) Superposición entre DEG en diferentes momentos (izquierda, regulada hacia arriba; derecha, regulada hacia abajo). (C) Los genes regulados positivamente encontrados en los tres puntos temporales se representaron en un gráfico de expresión LogFC, que muestra la expresión génica a lo largo del tiempo. (D) Promedio LogFC de todos los DEG en diferentes momentos. Letras diferentes indican diferencia estadística en p < 0,05 según la prueba HSD de Tukey-Kramer

3.2 Arabidopsis responde a las OMV con un cambio transcripcional hacia la activación del sistema inmunológico

Para identificar las vías de Arabidopsis afectadas significativamente por el desafío OMV, utilizamos la herramienta web AgriGO (Du et al., 2010; Tian et al., 2017). Identificamos 333 y 55 términos de ontología genética (GO) significativamente (FDR <0,05) regulados hacia arriba y hacia abajo, respectivamente, en todos los puntos temporales combinados en respuesta al desafío OMV. Casi el 25 % de los GO regulados positivamente estaban relacionados con la respuesta de la planta al estímulo (Figura 3A). Dentro de la categoría 'respuesta al estímulo', los términos GO más dominantes se asociaron con la respuesta al estrés, al estímulo biótico, a los químicos y al estímulo endógeno (Figura 3B; Tabla complementaria S2). La herramienta AgriGO también identificó 103 funciones moleculares significativamente reguladas al alza, incluyendo "actividad transferasa", actividad quinasa", "actividad del factor de transcripción", "unión de iones y iones metálicos", "unión de carbohidratos", "unión a proteínas", "actividad catalítica". , 'Unión de nucleótidos de adenilo', 'actividad del receptor transmembrana' y más funciones de unión (Tabla complementaria S2). La ubicación celular de los términos significativos estaba en diferentes compartimentos de la célula, incluidos el núcleo, la vacuola y el sistema de endomembrana, pero se asociaba más notablemente con la periferia celular e incluía "membrana plasmática", "región extracelular", "pared celular" y ontologías 'apoplastas' (Tabla complementaria S2). Los GO significativamente regulados a la baja, por otro lado, incluían los términos "proceso metabólico y catabólico de toxinas", "respuesta al agua y la privación de agua", "transporte y localización de lípidos", y otros (Tabla complementaria S2). Los GO relacionados con la respuesta al estímulo biótico no se enriquecieron en los genes regulados negativamente. Las funciones moleculares significativamente reguladas a la baja incluyeron muchos términos redox como "actividad oxidorreductasa", "unión de hemo", "unión de iones de hierro", "unión de lípidos", "unión de oxígeno" y más funciones relacionadas con el oxígeno (Tabla complementaria S2). . Los términos regulados a la baja también se ubicaron en la región extracelular. Para determinar a qué términos GO pertenecen los DEG con la expresión más alta, filtramos la lista de DEG original seleccionando genes que tenían un LogFC superior a 4 o inferior a -4 (correspondiente a una diferencia de 16-veces). . Identificamos 117 genes que cumplían con estos criterios, de los cuales 115 estaban regulados positivamente y 2 regulados negativamente en todos los momentos combinados. Debido a la pequeña cantidad de genes regulados negativamente con un LogFC de menos de -4, no se identificaron GO significativamente reprimidos. Por otro lado, se identificaron 72 GO significativamente regulados positivamente, de los cuales los más significativos están relacionados con la 'respuesta al estímulo biótico externo', la 'respuesta a otros organismos', la 'respuesta celular a los niveles de oxígeno' y la 'respuesta de defensa'. , 'respuesta al estrés' y más GO relacionados con el sistema inmunológico (Figura 3C).

FIGURA 3 Términos de ontología del gen (GO) de Arabidopsis enriquecidos en respuesta al desafío Xcc OMV. Representaciones de gráficos circulares de la distribución de categorías en términos GO de proceso biológico (A) y respuesta al estímulo (B) regulados positivamente. (C) Lista de genes de Arabidopsis con un LogFC de > 4 en respuesta al desafío OMV. Los genes se filtraron del conjunto de datos completo de DEG y se utilizaron para identificar términos GO enriquecidos utilizando la herramienta web AgriGo. Corte de FDR < 0.05

3.2 El desafío OMV condujo a una regulación positiva de los receptores inmunes

La detección de MAMP y la respuesta de las plantas a los MAMP están mediadas en gran medida por PRR unidos a membranas que median la percepción de patógenos y la mitigación eficiente de la infección. Los PRR se clasifican comúnmente en dos grupos: receptores quinasas (RK) y proteínas similares a receptores (RLP) (Boutrot & Zipfel, 2017). Para identificar los PRR que se expresaron diferencialmente en respuesta a los OMV, comparamos nuestro conjunto de DEG con listas previamente establecidas de RK de Arabidopsis (Kemmerling et al., 2011; Mott et al., 2016) y RLP (Wang et al., 2008). Hemos identificado en nuestro conjunto de datos 33 y 10 RK y RLP regulados positivamente, respectivamente, en todos los momentos combinados (Tabla 1). No se encontraron RK ni RLP en nuestra lista de 175 genes regulados negativamente. Kemmerling et al. (2011) definieron una lista de 49 RK, cuya expresión fue inducida significativamente por MAMP como flg22 y NLP (proteína similar al péptido 1-inductor de necrosis y etileno) o tratamiento con patógenos. Comparamos esta lista con las RLK reguladas al alza de nuestro experimento y encontramos que el 45 % de las RK definidas por Kemmerling et al. (2011) también fueron inducidos en respuesta a las OMV. Entre ellos destacan FRK1, SOBIR1, SERK4, RLK/IKU2, PSKR1, HAESA, EFR, BIR e IOS1 (Tabla 1). Entre el grupo RK, FRK1 tuvo la expresión más alta a 2 y 6 hpc con un LogFC de 7,11 y 5,2, respectivamente, mientras que el LogFC promedio de todos los RK fue de 2,11 y 2,13 a 2 y 6 hpc, respectivamente. Mientras que los RK y RLP unidos a membrana median principalmente la detección extracelular de microbios invasores, los receptores de repetición ricos en leucina (LRR) (NLR) del sitio de unión de nucleótidos son receptores inmunes intracelulares. Encontramos 7 genes NLR diferentes regulados positivamente en respuesta al desafío OMV a las 2 y 6 hpc, no se encontró ninguno a las 24 hpc (la lista de NLR se extrajo de TAIR, 102 genes) (Tabla 1).

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3.3 Las OMV inducen la expresión de múltiples factores de transcripción WRKY

Se ha descubierto que los factores de transcripción (TF) WRKY desempeñan funciones en las respuestas inmunitarias de las plantas, participando tanto en la inmunidad desencadenada por MAMP (MTI) como en la inmunidad desencadenada por efectores (ETI) (Birkenbihl et al., 2018; Rushton et al., 2010 ). La exposición a OMV condujo a la regulación positiva de 20 TF WRKY diferentes (lista extraída de TAIR, 70 genes) solo en 2 y 6 HPC (Tabla 1). Los WRKY TF estaban ausentes de nuestro conjunto de genes regulados negativamente. Otra familia de TF afectados por el desafío OMV son las proteínas que contienen el dominio MYB (Tsuda & Somssich, 2015), que se sabe que están involucradas en múltiples procesos, incluidos los estreses bióticos y abióticos (Ambawat et al., 2013). En general, 9 TF MYB diferentes (lista extraída de TAIR, 211 genes) se expresaron diferencialmente en respuesta al desafío OMV, 5 regulados positivamente y 4 regulados negativamente (Tabla 1). En la Tabla 1 se enumeran clases adicionales de TF expresados ​​diferencialmente que se detectaron.

3.4 Comparación de la respuesta transcripcional de Arabidopsis a OMV con la respuesta a MAMP purificados

Para conocer las diferencias en la respuesta de Arabidopsis al elicitor purificado versus una estructura cruda y molecularmente compleja (OMV), comparamos nuestros datos de RNA-seq con datos transcriptómicos existentes de la respuesta de Arabidopsis a MAMP conocidos, incluido flg22, (Denoux et al., 2008) elf26 (Zipfel et al., 2006), PGN (Willmann et al., 2011), OG (Davidsson et al., 2017) y LPS (Livaja et al., 2008). Los GO enriquecidos se extrajeron de los conjuntos de datos mencionados anteriormente como se describe anteriormente (Tabla complementaria S3) y se compararon con los GO enriquecidos después del desafío OMV. En general, los términos GO de Arabidopsis inducidos por OMV fueron similares a los inducidos por MAMP simples, proteicos y no proteicos, compartiendo 56, 51 y 47% de los GO inducidos por OMV con los GO inducidos por flg22, elf26 y PGN, respectivamente. Por otro lado, se observó una menor superposición en los GO inducidos con LPS y OG, compartiendo 24 y 33 %, respectivamente, con los GO inducidos por OMV (Figura 4A). En particular, el gen 1 (PR1) relacionado con la patogénesis (At2g14610), un sello distintivo de las respuestas inmunes inducidas por LPS (Silipo et al., 2005, 2008), estuvo ausente de la lista de genes inducidos por OMV en todos los momentos analizados. Se encontró que cuarenta y un GO fueron inducidos por OMV y no por ninguno de los otros MAMP probados aquí (Figura 4B). Esta lista incluía GO relacionados con la 'apoptosis', la 'respuesta al fármaco', el 'transporte de fármacos y el 'transporte de múltiples fármacos' y la 'actividad de la lipasa' (Tabla complementaria S3, indicada con asteriscos y negrita).

3.5 Las OMV inducen resistencia de Arabidopsis a la infección bacteriana

Aquí y anteriormente (Bahar et al., 2016), hemos proporcionado evidencia que demuestra que el sistema inmunológico de Arabidopsis es inducido por la exposición a OMV. Para examinar si esta inducción inmune mediada por OMV se traduce en una respuesta inmune efectiva, utilizamos una prueba de crecimiento bacteriano en plantas (Zipfel et al., 2004) en la que las plantas de Arabidopsis se tratan previamente con OMV seguido de inoculación bacteriana. Una disminución significativa de más de 10-veces en Pseudomonas syringae pv. Se observaron DC3000 (Pst) UFC/g de hoja de tomate en plantas pretratadas tanto con OMV como con flg22-en comparación con el pretratamiento simulado, dos días después de la inoculación (Figura 5A). El crecimiento in vitro de Pst no se vio afectado negativamente por la adición de OMV al medio, lo que sugiere que el crecimiento reducido de Pst en la planta está relacionado con el efecto de cebado de OMV y no es un efecto directo de OMV sobre las bacterias (Figura complementaria). S2). Para probar si la resistencia inducida por OMV a Pst está mediada por FLS2, EFR o BAK1, repetimos este experimento con Col-0, mutante bak, y la línea doble mutante cae efr. Con ambas líneas mutantes, el tratamiento previo con OMV resultó en una reducción significativa en Pst UFC/g de hoja en comparación con las plantas tratadas de forma simulada (Figura 5B-C). Como se esperaba, las líneas mutantes fls efr y bak tratadas con flg22 tenían títulos de Pst similares a los de las plantas no tratadas, ya que se sabe que no responden a flg22. Para comparar la reducción relativa en el título de patógeno en Col-0 versus las líneas mutantes de receptores inmunes fallidos y horneados en plantas preparadas, calculamos la diferencia en el título de Pst en plantas tratadas con OMV y simuladas en tres experimentos independientes (Supp. (Figura S3). La reducción promedio en el título de Pst en plantas dorsales pretratadas con OMV fue menor que la observada en plantas Col-0 (0,89 frente a 1,14 Log UFC/gr de reducción de hojas para bak y Col-0, respectivamente, uno- manera ANOVA; F2,4=4.3781, p=0.0523). No vimos una reducción similar con la línea mutante fls efr (reducción de 1,26 frente a 1,32 Log CFU para fls efr y Col-0, respectivamente, ANOVA unidireccional: F1,4=0.0352, p=0.5698) (Figura 5D-E).

TABLA 1 RK/RLP inducidas por OMV y factores de transcripción relacionados con el sistema inmunológico en plántulas de Arabidopsis

TABLA 1 (Continuación)

TABLA 1 (Continuación)

4. DISCUSIÓN

Las vesículas de la membrana externa bacteriana (OMV) son nanoestructuras complejas que se originan en la membrana externa bacteriana y están compuestas por cientos de proteínas y otros componentes de la pared celular. Anteriormente se demostró que las plantas de Arabidopsis responden al desafío de OMV activando respuestas inmunes típicas como la explosión de ROS, la expresión de genes marcadores inmunes y la alcalinización media (Bahar et al., 2016). En este estudio, examinamos la respuesta transcripcional más amplia de Arabidopsis a las OMV bacterianas y su efecto sobre la infección posterior. La conclusión general de los análisis de datos de RNA-seq realizados en este estudio es que el sistema inmunológico de Arabidopsis se prepara después de la exposición a las OMV de Xanthomonas campestris pv.campestris (Xcc). Esta conclusión está respaldada por análisis distintos y complementarios. Primero, el enriquecimiento de ontología genética (GO) en plantas expuestas a Xcc OMV muestra claramente que Arabidopsis percibe las OMV como factores estresantes. La ubicación celular de la respuesta de la planta se asoció principalmente con la periferia celular, lo que sugiere una percepción celular externa del material desafiante, los OMV. Esto respalda aún más la idea de que los OMV y sus constituyentes son detectados por receptores extracelulares, de forma similar a muchos MAMP conocidos. En segundo lugar, notamos que un gran conjunto de RK y RLP están regulados al alza en respuesta al desafío OMV. Se sabe que muchos de estos receptores median la percepción de patógenos o se ha demostrado previamente que se asocian con la respuesta inmune de las plantas. La quinasa tipo receptor 1 inducida por FLG22- (FRK1) fue el receptor más inducido. Esto es interesante ya que no pudimos detectar flagelina en nuestro análisis proteómico de Xcc OMV (datos no mostrados). Se sabe que FRK1 también es inducida por otros inductores inmunes, pero es intrigante por qué su expresión es mucho más alta que la del resto de las RK reguladas positivamente aquí. La expresión del receptor del factor de elongación (EFR), por otro lado, solo se reguló significativamente en el momento de las 2 h y tuvo un LogFC de 1,12, a pesar de que EF-Tu se encuentra en Xcc OMV (Bahar et al., 2016). ). También encontramos algunos genes NLR regulados positivamente en respuesta al desafío OMV, la mitad de los cuales están anotados como proteínas de resistencia a enfermedades, aunque no se ha descrito su función en la inmunidad de las plantas. Si bien no suponemos que los NLR estén directamente involucrados en la percepción de OMV, podrían inducirse después de la detección de moléculas de OMV por parte de RK/RLP, como también se observó en respuesta a MAMP purificados como flg22, elf18 y LPS (Denoux et al., 2008). ; Livaja et al., 2008; Zipfel et al., 2006). En tercer lugar, muchos factores de transcripción relacionados con el sistema inmunitario, WRKY, MYB y otros, fueron regulados significativamente por las OMV (Bjornson et al., 2021). En nuestro estudio, el principal cambio transcripcional en respuesta a OMV ocurrió en los dos primeros momentos (2 y 6 hpc). Esto quedó ilustrado por un número significativamente mayor de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) y un cambio de registro significativamente mayor (LogFC) a 2 y 6 hpc. Sin embargo, de un total de 121 DEG encontrados en 24 hpc, casi la mitad (52) no se encontraron en 2 o 6 hpc. Esto sugiere que la mitad de los DEG a las 24 hpc son genes regulados tardíamente, cuya expresión se reguló hacia arriba o hacia abajo después de las 6 hpc. De hecho, previamente se identificaron genes de Arabidopsis con diferentes dinámicas de expresión después de desafíos inductores (Bjornson et al., 2021).

FIGURA 4 Comparación de términos de ontología genética (GO) enriquecidos en respuesta a OMV y MAMP purificados únicos. Se utilizaron conjuntos de datos de expresión de Arabidopsis en respuesta al desafío MAMP (elf26, flg22, OGs, PGN y LPS; consulte la sección Materiales y métodos para obtener referencias) para extraer GO enriquecidos utilizando la herramienta web AgriGo. Los conjuntos de GO enriquecidos de cada MAMP se compararon con la lista de GO enriquecida en respuesta a los OMV utilizando Venny (A y tabla complementaria S3). Los términos GO enriquecidos solo en los conjuntos de datos OMV se muestran en (B) ordenados por su valor FDR.

En nuestro estudio, el principal cambio transcripcional en respuesta a OMV ocurrió en los dos primeros momentos (2 y 6 hpc). Esto quedó ilustrado por un número significativamente mayor de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) y un cambio de log veces mayor (LogFC) significativamente mayor a 2 y 6 hpc. Sin embargo, de un total de 121 DEG encontrados en 24 hpc, casi la mitad (52) no se encontraron en 2 o 6 hpc. Esto sugiere que la mitad de los DEG a las 24 hpc son genes regulados tardíamente, cuya expresión se reguló hacia arriba o hacia abajo después de las 6 hpc. De hecho, se identificaron previamente genes de Arabidopsis con diferentes dinámicas de expresión después de desafíos inductores (Bjornson et al., 2021). El patrón de expresión genética rápido y en su mayoría transitorio que hemos visto aquí está de acuerdo con otros estudios que han probado la respuesta temporal de Arabidopsis a los MAMP. Por ejemplo, Denoux et al. (2008) y Bjornson et al. (2021) han demostrado que el cambio transcripcional en Arabidopsis en respuesta a varios MAMP ocurre en cuestión de minutos u horas y, en la mayoría de los casos, los DEG vuelven a sus niveles básicos aproximadamente dentro de las 24 h posteriores al desafío de la planta. A diferencia de las interacciones entre una planta y un patógeno, donde la interacción es dinámica y continua cuando se enfrenta a una muestra no viva, como un MAMP purificado o con OMV, se puede esperar que la respuesta de la planta, al menos a nivel transcripcional, sería transitorio y no se mantendría durante días. Una intensa investigación realizada en las últimas tres décadas ha revelado múltiples receptores inmunes en las plantas responsables del reconocimiento de los microbios. Muchos de estos receptores tienen la capacidad de detectar características microbianas individuales y se están estudiando en detalle para comprender mejor la percepción de patógenos, la señalización del sistema inmunológico y la respuesta de plantas modelo y de cultivo. Sin embargo, las plantas están expuestas simultáneamente a múltiples características microbianas de diferentes fuentes, lo que añade complejidad a la percepción y respuesta inmune. Estábamos interesados ​​en examinar las diferencias en la respuesta transcripcional de Arabidopsis a MAMP purificados singulares frente a OMV, que representan una estructura microbiana más natural y compleja, pero con un grado de complejidad eliminado del microbio en sí. Las OMV contienen factores de virulencia, enzimas degradativas, toxinas y otras biomoléculas que podrían tener un papel funcional para el crecimiento bacteriano en la planta y, por lo tanto, fue interesante probar si la exposición a OMV induce GO únicas que no son inducidas por MAMP sintéticos.

FIGURA 5 El tratamiento previo de las hojas de Arabidopsis con OMV induce resistencia a infecciones bacterianas posteriores. Las plantas Col-0 (A) se trataron previamente con OMV, agua (simulada) o flg22 como controles, y 24 h después se inocularon con una suspensión de 105 UFC/ml de Pst DC3000 mediante infiltración con jeringa sin aguja. . El título de células Pst DC3000 en las hojas inoculadas se determinó 48 h después de la inoculación mediante placas de dilución en serie. Las plantas Arabidopsis Col-0 y fls efr (B) o bak (C) se probaron en un experimento similar al descrito en (A). Se comparó la reducción media de Log Pst DC3000 UFC/gr después del pretratamiento con OMV (en comparación con plantas no tratadas) en Col-0 y falls efr (D), y Col-0 y espalda (E). Cada barra representa la reducción media de Log Pst DC3000 UFC/gr de tres experimentos independientes (los datos de los experimentos independientes se presentan en la figura complementaria S3). Las diferencias no fueron estadísticamente significativas (prueba t de Student de dos colas. Los valores de p se indican encima de las barras del gráfico). Los experimentos A, B y C se realizaron al menos tres veces con resultados similares (3 plantas/réplicas por tratamiento en cada experimento). Los asteriscos (**) indican una diferencia significativa en comparación con el simulacro (prueba de Dunnet p < 0,001)

Para nuestras comparaciones transcriptómicas, reunimos datos de estudios con condiciones experimentales similares, es decir, en plantas y en momentos similares. Se observó una superposición significativa en el enriquecimiento de GO en la respuesta de Arabidopsis a OMV y a flg22, elf26 y PGN. Esto no es inesperado, ya que se sabe que muchas de las vías de defensa activadas al detectar patógenos son similares, independientemente del inductor específico o su fuente (Bjornson et al., 2021; Zipfel et al., 2006). Sin embargo, se encontró que algunos GO únicos estaban regulados positivamente por los OMV y no por los otros MAMP que hemos estudiado. Entre estos se encuentran los GO relacionados con la degradación de la pared celular, como la "actividad lipasa" y la "actividad hidrolasa que actúa sobre los enlaces glicosilo", lo que puede indicar que el sistema de defensa de la planta se dirige a la degradación del OMV. Curiosamente, también se encontró que tres GO relacionados con el transporte de drogas estaban regulados positivamente de manera única por el desafío OMV. Esto puede indicar que las plantas se enfrentan a compuestos tóxicos que ingresan a sus células, tal vez mediante administración mediada por OMV. A diferencia de la respuesta de Arabidopsis a los péptidos estimulantes del sistema inmunológico y a la PGN, observamos relativamente poca superposición entre la respuesta de Arabidopsis a los OMV OG y los LPS. Esta pequeña superposición, especialmente con los LPS, es algo sorprendente, considerando que en las células de mamíferos, los LPS son bien reconocidos como potentes contribuyentes a la respuesta inmune del huésped inducida por las OMV (Ellis et al., 2010). Además, el hecho de que no pudimos encontrar una regulación positiva del sello inmunológico PR1 del LPS (Silipo et al., 2005), podría sugerir que el LPS no es un inductor importante de la interacción inmune de la planta con las OMV bacterianas. Sin embargo, esto aún debe examinarse más a fondo. Se demostró que las OMV contribuyen a la colonización bacteriana de huéspedes tanto mamíferos como vegetales y, en algunos casos, a la virulencia bacteriana. Por otro lado, las OMV activan el sistema inmunológico del huésped y, por lo tanto, actúan como un arma de doble filo: promueven la supervivencia y la virulencia de las bacterias, por un lado, y alimentan el sistema de vigilancia del huésped y activan la inmunidad del huésped, por el otro (McMillan & Kuehn, 2021). ). Nuestros ensayos de cebado mostraron que la exposición a OMV condujo a una inhibición significativa de Pseudomonas syringae pv. crecimiento del tomate DC3000 (Pst) en planta, similar al efecto de preparación observado con MAMP sintéticos (Jung et al., 2009). Por lo tanto, en este caso, la preadministración de OMV al tejido inoculado no promovió la colonización bacteriana sino que preparó a las plantas para inducir una respuesta inmune eficaz que inhibió el crecimiento de patógenos. Este resultado está en línea con nuestros datos transcripcionales y con nuestro estudio anterior, lo que respalda la idea de que las OMV inducen una respuesta inmune sólida y eficaz en Arabidopsis. Dos estudios recientes también han demostrado que el tratamiento previo de Arabidopsis con OMV de una especie de Pseudomonas patógena o comensal suprimió la infección posterior por Pst (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). Estos resultados indican de forma acumulativa que, en las condiciones probadas, la infiltración de OMV no facilita la infección por patógenos. En un estudio anterior, hemos demostrado que múltiples mutantes de receptores inmunes mantienen la capacidad de respuesta de WT a las OMV de Xcc. Estos mutantes incluían PRR conocidos, que reconocían MAMP proteicos (FLS2, EFR, RLPReMAX) o no proteicos (LYM1/LYM3) (Bahar et al., 2016). Curiosamente, Janda et al. (2021) informaron que cuando la línea mutante del receptor FLS2 de Arabidopsis (gripe) se expuso a OMV de Pst, la expresión de FRK1 no cambió y fue similar a la de las plantas tratadas de forma simulada, lo que sugiere que FLS2 media la respuesta a las OMV de Pst. Es posible que la flagelina sea más abundante en las preparaciones de Pst OMV que en las OMV Xcc 33913 y, por lo tanto, la eliminación del receptor de flagelina tuvo un efecto más pronunciado en la respuesta de la planta a Pst que a las OMV Xcc.

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Se ha demostrado que diferentes ensayos inmunológicos de plantas pueden producir resultados diferentes, lo que lleva a conclusiones supuestamente contradictorias. Por ejemplo, hemos demostrado que en un ensayo de explosión de ROS en disco de hoja, la respuesta de Arabidopsis a las OMV dependía del receptor EFR; sin embargo, en un ensayo de expresión del gen marcador inmunológico con plántulas de Arabidopsis, cada línea mutante respondía tan bien a las OMV como el peso. McMillan et al. (2021) demostraron que diferentes tratamientos físicos aplicados a las OMV abolieron ciertas actividades como la inhibición del crecimiento de las plántulas. Sin embargo, no alteró otros resultados inmunológicos, como la preparación de las plantas. Por lo tanto, es importante combinar una variedad de ensayos para probar diferentes resultados inmunes para obtener una visión lo más amplia posible de la respuesta inmune de la planta a un elicitor determinado. Para examinar más a fondo la participación de algunos de los PRR y correceptores conocidos, hemos probado las líneas mutantes falls ever y bak utilizando el ensayo de cebado de plantas. Nuestros resultados muestran que las caídas de la línea mutante doble de Arabidopsis fueron preparadas de manera similar por Xcc OMV al igual que las plantas WT, lo que respalda la idea de que MAMP distintos de flagelina y EF-Tu también están presentes en Xcc 33913 OMV. Basándonos en ensayos de expresión de genes marcadores inmunitarios, sugerimos previamente que el correceptor BAK1 está involucrado en la percepción y/o respuesta de OMV (Bahar et al., 2016). En este estudio, revisamos esta sugerencia utilizando el ensayo de cebado. Aquí, la línea mutante bak fue preparada mediante pretratamiento con OMV, pero en un grado ligeramente menor que las plantas WT Col-0. Si bien este margen no fue estadísticamente significativo, fue mayor que el observado con la línea doble fls siempre mutante. Este resultado también está en línea con un estudio reciente que demostró que la línea mutante bak respondía a OMV como plantas WT en experimentos de preparación inmune (Tran et al., 2021). En general, esto puede sugerir que, si bien BAK1 está involucrado en la percepción de OMV, OMV activa otras vías de percepción y señalización inmune, lo que conduce a una respuesta inmune efectiva y a la supresión del crecimiento de patógenos. La participación de los correceptores BAK1 y SOBIR1 en respuesta a las OMV (Bahar et al., 2016) nos llevó a suponer que múltiples receptores inmunes, probablemente PRR, están involucrados en la percepción de las OMV. Sin embargo, un estudio reciente sugirió que la activación inmune de las plantas mediante OMV puede ser independiente de MAMP y resulta de cambios fisicoquímicos en la membrana plasmática de la planta inducidos por la integración de OMV (Tran et al., 2021). Esta es una hipótesis intrigante que aún debe abordarse más a fondo. Curiosamente, McMillan et al. (2021) informaron que las OMV tratadas con proteinasa K conservaron su capacidad de preparación inmune, lo que indica que esta actividad puede ser independiente de la carga proteica de las OMV. Si bien este resultado puede respaldar la hipótesis de activación inmune independiente de MAMP de Tran et al. (2021), otros MAMP no proteicos presentes en OMV, como LPS y PGN, pueden activar MTI (Bahar et al., 2016; McMillan et al., 2021). Además, las OMV tratadas con proteinasa K conservaron su capacidad para inducir la inhibición del crecimiento de las plántulas, lo que indica que la inhibición del crecimiento depende de la carga proteica de las OMV (McMillan et al., 2021). En conjunto, estos resultados enfatizan aún más la complejidad de la respuesta de las plantas a las OMV y la importancia de utilizar una variedad de resultados para probar la participación de un inductor particular en vías específicas.

Durante 2021, cuatro estudios independientes, incluido este (que probablemente se llevaron a cabo simultáneamente), informaron que las OMV bacterianas modulan el sistema inmunológico de las plantas e inducen una respuesta eficaz contra la infección por patógenos (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021; Tran et al., 2021). Estos interesantes resultados posicionan a los OMV como un actor nuevo e importante en las interacciones entre plantas y microbios, donde todavía queda mucho por aprender. En este estudio, brindamos una visión más amplia de la respuesta transcripcional de Arabidopsis a Xcc OMV. Se necesitarán enfoques de investigación complementarios para comprender mejor los componentes y mecanismos involucrados en la percepción de las OMV por parte de las plantas.

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