BCAT2 da forma a un microambiente tumoral no inflamado e induce resistencia a la inmunoterapia anti-PD-1/PD-L1 al regular negativamente las quimiocinas proinflamatorias y la inmunidad anticancerígena

Para mejorar la tasa de respuesta de la monoterapia del bloqueo de puntos de control inmunológico (ICB), es necesario encontrar un objetivo emergente en la terapia combinada. Mediante el análisis de indicadores relacionados con el microambiente tumoral (TME), se valida que BCAT2 forma un TME no inflamado en el cáncer de vejiga. Los resultados de la multiómica indican que BCAT2 tiene un efecto inhibidor sobre el reclutamiento de linfocitos citotóxicos al restringir las actividades de las vías relacionadas con citocinas/quimiocinas proinflamatorias y la vía de quimiotaxis de células T. Los inmunoensayos revelan que la secreción de quimiocinas relacionadas con las células T CD8+ mantiene una fuerte correlación negativa con BCAT2, generando una tendencia decreciente de las células T CD8+ alrededor de las células tumorales BCAT2+ de lejos a cerca. El tratamiento conjunto de la deficiencia de BCAT2 y el anticuerpo anti-PD-1 tiene un efecto sinérgico in vivo, lo que implica el potencial de BCAT2 en la terapia combinada. Además, el valor de BCAT2 para predecir la eficacia de la inmunoterapia está validado en múltiples cohortes de inmunoterapia. En conjunto, como molécula clave en TME, BCAT2 es un objetivo emergente en combinación con ICB y un biomarcador que guía la terapia de precisión.

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1. Introducción

El cáncer de vejiga (BLCA) es una de las neoplasias malignas más comunes en el sistema urinario.[1] Se estima que cada año se diagnostican más de 430000 pacientes en todo el mundo.[2] A pesar del tratamiento con cirugía radical, casi la mitad de los pacientes con cáncer de vejiga con invasión muscular presentan metástasis.[3] Por tanto, la terapia sistémica juega un papel importante en el cáncer de vejiga avanzado. Con el desarrollo de la inmunoterapia, especialmente el bloqueo de puntos de control inmunológico (BCI), la evidencia acumulada indicó que el BCI tiene un desempeño excelente para eliminar la carga tumoral.[4] Sin embargo, todavía hay un gran número de pacientes que no responden a la monoterapia con ICB debido a resistencia primaria o resistencia adquirida.[5] Para resolver la necesidad clínica no cubierta, la combinación de otras terapias racionales con ICB proporciona una visión completamente nueva de la resistencia a la monoterapia. El microambiente tumoral (TME) es un sistema complicado y tiene un profundo impacto en la eficacia de la inmunoterapia.[6] Con un nivel de infiltración insuficiente de linfocitos T citotóxicos (CTL), el TME no inflamado se consideró un factor crítico para no generar una respuesta inmunitaria antitumoral potente durante la inmunoterapia.[7] Por lo tanto, es vital encontrar una molécula clave que pueda remodelar el TME no inflamado en TME inflamado y que tenga el potencial de ser un objetivo de terapia combinada. La aminotransferasa 2 de cadena ramificada (BCAT2) es una enzima central en el proceso del metabolismo de los aminoácidos azufrados.[8] Li y col. descubrió que BCAT2 era esencial para el desarrollo del cáncer de páncreas al mediar en el catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA).[9] Lee y cols. demostró que la deficiencia de BCAT2 inhibía el crecimiento tumoral del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) mediante la regulación del metabolismo de los lípidos.[10] Aunque varias investigaciones documentaron que BCAT2 influyó directamente en el proceso biológico de los tumores al regular las vías metabólicas, nunca se ha explorado su papel en la regulación del estado inmunológico de TME. En nuestro estudio, a través de un análisis exhaustivo de los indicadores relacionados con TME en la cohorte Xiangya BLCA y múltiples cohortes públicas de BLCA, analizamos que BCAT2 probablemente da forma a un TME inmunosupresor en BLCA. Para explorar los mecanismos moleculares, realizamos además una secuenciación de ARN unicelular (siRNA seq) y una secuencia de ARN en masa, lo que revela que BCAT2 desempeña un papel represivo en el reclutamiento de CTL en TME, al inhibir las actividades de las vías de señales asociadas a citocinas/quimiocinas y Vías de señal de quimiotaxis de células T. In vitro, los multiinmunoensayos demostraron que la secreción de quimiocinas relacionadas con CTL tiene correlaciones negativas estables con la expresión de BCAT2. Según el análisis panorámico de microarrays de tejido (TMA), encontramos una relación mutuamente excluyente entre las células tumorales CTL y BCAT2+ en la distribución espacial. In vivo, se reveló un efecto cooperativo en la terapia combinada de pérdida de BCAT2 e ICB. Más importante aún, su papel en la predicción del efecto curativo de la inmunoterapia se validó en la cohorte de inmunoterapia BLCA de Xiangya.

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2. Resultados

2.1. BCAT2 se correlaciona negativamente con la inmunidad anticancerígena de TME en BLCA

En la mayoría de los tipos de cáncer, la expresión de BCAT2 es mayor en los tejidos cancerosos que en los tejidos normales (Figura S1A, Información de respaldo) y su patrón de expresión en BLCA se validó en la cohorte Xiangya BLCA (Figura S1B, Información de respaldo). Además, BCAT2 se expresa ampliamente en varias líneas celulares cancerosas (Figura S1C, Información de respaldo). Además, los resultados de un análisis integral pan-cáncer del sistema de quimiocinas, MHC, inmunoestimuladores y TIIC indicaron que BCAT2 tiene efectos inmunosupresores significativos en un par de tipos de cáncer, incluido el cáncer de vejiga (BLCA), el cáncer de mama (BRCA), el cáncer de células papilares renales carcinoma (KIRP), adenocarcinoma de páncreas (PAAD), sarcoma (SARC) y carcinoma de tiroides (THCA) (Figura S2A, B, Información de respaldo). Además, también se encontraron correlaciones negativas entre BCAT2 y puntos de control inmunes inhibidores comunes (PD- 1, PD-L1, CTLA-4 y LAG-3) (Figura S2C-F, Información de respaldo ). A través de un análisis integral del cáncer, descubrimos que BCAT2 tiene el efecto inmunosupresor más profundo en BLCA. Por lo tanto, exploramos más a fondo su papel inmunológico en BLCA. Sobre la base del valor de expresión mediano de BCAT2, dividimos a los individuos en el grupo con alto contenido de BCAT2 y el grupo con bajo contenido de BCAT2 en la cohorte TCGA-BLCA. Obviamente, una serie de quimiocinas, receptores de quimiocinas, moléculas relacionadas con el MHC e inmunoestimuladores se expresaron negativamente en el grupo con alto contenido de BCAT2 y sobreexpresados ​​en el grupo con bajo contenido de BCAT2 (Figura 1A). Se encontró un resultado similar en el ciclo de inmunidad del cáncer, que cubre múltiples pasos esenciales para reclutar e infiltrar células inmunes (Figura 1B). Además, demostramos conexiones negativas sólidas entre los niveles de infiltración de células inmunes (células T CD8+, células T CD4+, células asesinas naturales (NK) y células dendríticas (DC)) y BCAT2 en diferentes algoritmos (Figura 1C). Del mismo modo, se encontró una menor expresión de los genes efectores de las células inmunitarias (células CD8+T, células NK, macrófagos, células T auxiliares 1 (Th1) y células DC) en el grupo con alto contenido de BCAT2 en comparación con el grupo con bajo contenido de BCAT2. grupo (Figura 1D). Más importante aún, cuando se correlacionó BCAT2 con la puntuación TIS (Figura S3, Información de respaldo) y los puntos de control inmunológicos inhibidores (Figura 1E), se revelaron relaciones negativas obvias entre ellos. Por lo tanto, especulamos que BCAT2 puede regular negativamente la respuesta inmune TME y afectar profundamente la eficacia de la inmunoterapia. Además, los resultados anteriores se validaron bien en nueve cohortes BLCA independientes (GSE31684, GSE32894, GSE48075, GSE48276, GSE69795, GSE83586, GSE86411, GSE87304 y GSE128702) (Figuras S4 a S12, Información de respaldo). Por fin, verificamos nuevamente la asociación entre BCAT2 y TME en la cohorte Xiangya BLCA. Consistentemente, la expresión de BCAT2 tiene relaciones negativas con la actividad del ciclo de inmunidad del cáncer, los niveles de infiltración de TIIC, la puntuación TIS y los niveles de expresión de los puntos de control inmunológico (Figura 2A-C). En conjunto, revelamos que la alta expresión de BCAT2 forma un TME no inflamado en BLCA y la baja expresión de BCAT2 forma un TME inflamado en BLCA.

2.2. Exploración del mecanismo de BCAT2 en la configuración de TME mediante Bulk RNA-seq y siRNA-seq

En la cohorte TCGA-BLCA, se identificaron y se cruzaron los DEG entre grupos BCAT2 alto/bajo, grupos de puntuación inmune alta/baja y grupos de puntuación estromal alta/baja (Figura S13A, Información de respaldo). Curiosamente, los DEG relacionados con BCAT2 positivo no tuvieron intersección con los DEG relacionados con puntuación inmune y estromal positiva (Figura 2D). Mientras tanto, el mismo fenómeno ocurrió en los EG relacionados con negativo entre ellos (Figura S13B, Información de respaldo). Estos hallazgos indicaron que BCAT2 probablemente regula negativamente las vías inmunes relacionadas con el sistema inmunológico. Coincidentemente, los resultados de los análisis GO y KEGG revelaron que los DEG relacionados con BCAT2-se enriquecieron de manera más significativa en las vías de migración de leucocitos, activación de células T e interacción entre citocinas y receptores de citocinas (Figura 2E, F). Por lo tanto, especulamos que BCAT2 forma un TME no inflamado en BLCA al inhibir las actividades de las vías relacionadas con citocinas/quimiocinas. Sin embargo, la característica de la secuenciación masiva de NA determina su limitación, cuyo nivel de expresión del gen se calcula por el valor medio de todas las células del tejido. Para superar la limitación, se realizó ARNip en tres muestras BLCA. Se analizaron y clasificaron más de 19 000 células en seis categorías: células epiteliales, células fibroblásticas, células T/NK, células endoteliales, células B y células mieloides (Figura 3A), se refieren a biomarcadores reconocidos (EPCAM, LYZ, CD3D, COL1A1, CD79A, CD19, PECAM1 y VWF).[11] Sorprendentemente, BCAT2 se expresó principalmente en células epiteliales (EPCAM+), en lugar de en células endoteliales y células inmunes. Sobre la base de la acumulación de CNV, las células epiteliales EPCAM+ se consideraron células uroteliales malignas. Para validar el patrón de expresión de BCAT2, se incluyeron en el estudio dos cohortes externas de ARNip. En la cohorte de ARNc GSE135337, se procesaron más de 36,000 células y se dividieron en cinco grupos. El subtipo celular expresado principalmente de BCAT2 seguía siendo una célula urotelial de vejiga maligna (Figura 3B). Un patrón de expresión similar reapareció en la cohorte de ARNip GSE145137 (Figura 3C). Por lo tanto, el patrón de expresión mayoritario en células malignas infirió que BCAT2 actúa como una parte inmunorreguladora en TME principalmente mediante características variables de las células cancerosas. Según el nivel de expresión de BCAT2, las células uroteliales malignas se dividieron en un grupo con alto contenido de BCAT2 y un grupo con bajo contenido de BCAT2. El análisis GSEA de los términos GO en las cohortes de ARNip GSE135337 y GSE145137 reveló que un grupo de vías relacionadas con citocinas/quimiocinas estaban significativamente reguladas a la baja en el grupo con alto contenido de BCAT2, incluida la producción de quimiocinas, la secreción de quimiocinas, la regulación de la vía de señalización mediada por quimiocinas, la respuesta a quimiocinas, Unión al receptor de quimiocinas, actividad de citocinas, unión a receptores de citocinas y unión a receptores de citocinas (Figura 3D-G; Figura S14B, Información de respaldo). Mientras tanto, la quimiotaxis de leucocitos, la quimiotaxis de linfocitos, la quimiotaxis de células T y sus vías reguladoras tuvieron correlaciones significativamente negativas con BCAT2 (Figura 3E-I; Figura S14A, Información de respaldo). El análisis GSEA de los términos KEGG indicó que las vías de interacción entre citoquinas y receptores de citocinas y el procesamiento y presentación de antígenos estaban obviamente reguladas a la baja en el grupo con alto contenido de BCAT2 (Figura 3F). En conjunto, la alta expresión de BCAT2 reprime las actividades de las citocinas proinflamatorias y las vías relacionadas con las quimiocinas, lo que lleva a una disminución del nivel de infiltración de TIIC, lo que en última instancia da forma a un TME no inflamado.

Figura 1. BCAT2 se correlaciona negativamente con la inmunidad anticancerígena en TME de BLCA. A) Patrón de expresión de quimiocinas, receptores de quimiocinas, moléculas MHC e inmunoestimuladores en grupos de BCAT2 alto y bajo. B) Actividad del ciclo de inmunidad al cáncer en grupos de BCAT2 alto y bajo. Siete colores representan siete pasos del ciclo. *p < 0.05; **p<0.01; ***p < 0,001. C) Correlaciones entre BCAT2 y múltiples tipos de células inmunitarias (células T CD8+, células T CD4+, células DC y células NK) en seis algoritmos independientes. D) Patrones de expresión de múltiples subtipos de genes efectores relacionados con células inmunitarias (células CD8+T, células NK, macrófagos, células Th1 y células DC) en grupos de BCAT2 alto y bajo. E) Correlaciones entre genes efectores relacionados con BCAT2 e ICB. El número en el círculo significa coeficiente de correlación.

Figura 2. Validación de la función de BCAT2 por la cohorte Xiangya BLCA. A) Correlaciones entre BCAT2/ciclo de inmunidad al cáncer (izquierda) y BCAT2/TIIC (derecha). Las líneas sólidas y punteadas significan relaciones positivas y negativas, el grosor de las líneas significa coeficiente de correlaciones, las líneas con diferentes colores representan el valor p de correlaciones. B) Correlaciones entre genes efectores relacionados con BCAT2 e ICB. C) Correlaciones entre genes efectores relacionados con la puntuación BCAT2 y TIS. El número en el círculo representa el coeficiente de correlación. D) Intersección de genes relacionados con BCAT2, puntuación inmune y puntuación estromal positiva. E,F) Las 20 principales vías de señalización de enriquecimiento de los análisis GO y KEGG en los genes relacionados con BCAT2-.

Figura 3. Exploración del mecanismo de BCAT2 para dar forma a TME mediante RNA-seq y scRNA-seq en masa. A, B) Gráficos de tSNE del patrón de expresión unicelular de BCAT2 en la cohorte de ARNip de Xiangya y la cohorte GSE135337. C) Gráfico de violín del patrón de expresión unicelular de BCAT2 en la cohorte GSE145137. D, E) El análisis GSEA del término GO indica actividades de vías relacionadas con citocinas/quimiocinas y vías relacionadas con quimiotaxis de células inmunitarias entre diferentes grupos BCAT2 en la cohorte GSE135337. F) El análisis GSEA del término KEGG indica actividades de presentación de antígeno e interacción de la vía de citocinas y receptores de citocinas entre diferentes grupos BCAT2 en la cohorte GSE145137. G – I) El análisis GSEA del término GO indica las actividades de las vías relacionadas con citocinas/quimiocinas, las vías relacionadas con la quimiotaxis de las células inmunitarias y las vías relacionadas con la migración de las células inmunitarias entre diferentes grupos BCAT2 en la cohorte GSE145137. J, K) Análisis GO y KEGG de DEG entre las líneas celulares BCAT2 OE y BCAT2 KD.

2.3. BCAT2 varía los patrones de expresión de las quimiocinas relacionadas con las células T CD8+ e inhibe la capacidad citotóxica de los CTL

Para validar las vías de enriquecimiento mencionadas anteriormente, se construyeron con éxito líneas celulares de cáncer de vejiga con sobreexpresión de BCAT2 (BCAT2 OE) y eliminación de BCAT2 (BCAT2 KD) humana (T24)/murina (MB49) (Figura S15A-D, Información de respaldo) y se probaron con Secuenciación de ARN de alto rendimiento. Como era de esperar, el análisis GO de líneas celulares T24 reveló que los DEG estaban significativamente enriquecidos en las vías de señalización mediada por quimiocinas, respuesta a quimiocinas, migración de leucocitos y migración de leucocitos (Figura 3J). El análisis de la vía KEGG de líneas celulares T24 mostró que la vía de señalización de quimiocinas, la vía de interacción citocina-receptor de citocina y la vía del cáncer de vejiga se enriquecieron significativamente (Figura 3K). De manera similar, se encontraron varias vías críticas relacionadas con citocinas/quimiocinas en los análisis GO y KEGG de líneas celulares MB49 (Figura S16A, B, Información de respaldo). Es evidente que varias citocinas y quimiocinas desempeñan funciones fundamentales en la regulación de la TME. Por lo tanto, es necesario detectar citocinas/quimiocinas que estén reguladas específicamente por BCAT2. Por lo tanto, se aplicaron múltiples inmunoensayos ProcartaPlex para identificar la variación de la secreción de citocinas/quimiocinas en líneas celulares de cáncer de vejiga humana y de ratón. Sorprendentemente, los niveles de secreción de CCL3, CCL4, CCL5 y CXCL10 aumentaron en líneas celulares BCAT2-KD humanas y murinas y disminuyeron en líneas celulares BCAT2-OE humanas y murinas (Figura 4A, B; Figura S16C , D, Información de respaldo). En estudios anteriores, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 y CXCL10 se consideraron quimiocinas cruciales para reclutar células T CD8+en TME.[12] En consecuencia, para realizar un análisis más exhaustivo de las quimiocinas relacionadas con las células T CD8+, se incluyeron todas para una validación adicional. Sorprendentemente, los niveles de expresión de ARN de CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 y CXCL10 se redujeron significativamente en las células BCAT2 OE y se incrementaron significativamente en las células BCAT2 KD (Figura 4C). De manera similar, los resultados de ELISA mostraron que los niveles de proteína secretada también tenían correlaciones negativas con la expresión de BCAT2 (Figura 4D). Estos hallazgos indicaron que la sobreexpresión de BCAT2 inhibe el transcriptoma y los niveles de proteína de las quimiocinas relacionadas con las células T CD8+, incluidas CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 y CXCL10. Más importante aún, el ensayo de quimiotaxis reveló que la línea celular BCAT2 OE inhibía significativamente la capacidad de quimiotaxis de las células T CD8+ (Figura 4E, izquierda). Por el contrario, los sobrenadantes celulares de la línea celular BCAT2 KD fueron capaces de atraer más células T CD8+ que su control negativo (Figura 4E, derecha). Estos hallazgos indicaron que BCAT2 puede afectar la capacidad de quimiotaxis de las células CD8+T al regular los niveles de ARNm y proteínas de quimiocinas relacionadas. Además, se utilizó un ensayo de destrucción de células cancerosas mediado por células T para explorar la variación de la citotoxicidad de las células T después del contacto directo con células tumorales que expresan un nivel diferente de BCAT2. Como se muestra en la Figura 4F y la Figura S17A, B (Información de respaldo), la sobreexpresión de BCAT2 en células tumorales suprimió directamente la función citotóxica de las células T y la eliminación de BCAT2 en células tumorales revirtió significativamente la tendencia. El análisis de citometría de flujo de células T recolectadas encontró que las proporciones de células T CD8+TNF-𝛼+ y células T CD8+IFN-𝛾+ tenían diferencias significativas en diferentes sistemas de cocultivo, lo que significó un cambio masivo en la actividad de las células T CD8+ (Figura 4G; Figura S17C, D, Información de respaldo). En conjunto, BCAT2 es capaz de inhibir la capacidad de reclutamiento de las células T CD8+ mediante la regulación de los niveles de quimiocinas relacionadas, así como la supresión de las actividades de los CTL por contacto directo. Además, el resultado del ensayo de destrucción de células cancerosas mediado por células T (sin grupo de células T) puede inferir que BCAT2 desempeña un papel oncogénico en el cáncer de vejiga. Por lo tanto, se utilizaron el ensayo de colonias en placa y el ensayo de migración/invasión Transwell para validar esta hipótesis. Como se anticipó, la sobreexpresión de BCAT2 mejoró significativamente la capacidad de proliferación, migración e invasión de las células tumorales, y la eliminación de BCAT2 suprimió notablemente estos comportamientos (Figura S18A-F, Información de respaldo).

2.4. Validación de la relación espacial exclusiva entre la célula tumoral BCAT2+ y la célula CD8+T mediante TMA de la cohorte Xiangya BLCA

Según los resultados de los experimentos in vitro, scRNA-seq y RNA-seq en masa, demostramos que BCAT2 desempeña un papel inmunosupresor en BLCA al suprimir el reclutamiento y la citotoxicidad de las células T CD8+. Sin embargo, la interacción de las células tumorales BCAT2+ y las células T CD8+ aún se desconoce a nivel de tejido humano. En la cohorte Xiangya BLCA, las imágenes representativas y una puntuación general de IHC revelaron una correlación negativa entre BCAT2 y CD8 (R=−0.38, p=0.0 038) (Figura 5A, B). La tinción IF multicolor de células tumorales BCAT2+ (BCAT2+CK19+) y células T BCAT2+CD8+ se realizó en TMA y se analizó de forma semiautomática utilizando el Plataforma de cuantificación panorámica TissueFAXS. Como se muestra en la Figura 5C, el alcance de expresión de BCAT2 y CK19 se superpuso en gran medida. Por el contrario, el alcance de expresión de BCAT2 y CD8 era distinto y separado. Las proporciones detalladas de coexpresión de células BCAT2+CK19+ y células BCAT2+CD8+fueron 87,29% y 5,09% (Figura 5D, E), lo que fue consistente con la Patrón de expresión de BCAT2 en scRNA-seq. En TMA general, todavía hubo una diferencia significativa en la proporción de coexpresión entre ellos (Figura S19A, Información de respaldo). Más importante aún, en el análisis de gradiente de distancia multidimensional (0–25, 25–50, 50–100 y 100–150 μm) alrededor de las células tumorales BCAT2+, los recuentos de células T CD8+ aumentaron gradualmente. de cerca a lejos (Figura 5F; Figura S19B, Información de respaldo). Juntos, demostramos que a nivel de tejido humano, BCAT2 también se expresa principalmente en células tumorales, y que la célula tumoral BCAT2+ tiene una relación espacial exclusiva con la célula T CD8+.

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2.5. La pérdida de BCAT2 mejora la eficacia de la terapia anti-PD-1

Con un impacto notablemente adverso sobre TME y una estrecha correlación negativa con el bloqueo de los puntos de control inhibidores, despierta gran interés explorar el efecto sinérgico de la pérdida de BCAT2 y el tratamiento anti-PD- 1. Antes de la inmunoterapia, BCAT2 KD construyó un modelo de cáncer de vejiga subcutáneo y líneas celulares murinas de control. Luego, se aplicaron terapia anti-PD-1 y terapia de control a ratones con tumores (Figura 6A). De manera consistente con su función oncogénica y mecanismo de regulación de las quimiocinas in vitro, la deficiencia de BCAT2 inhibió el crecimiento tumoral y prolongó el tiempo de supervivencia in vivo, al regular positivamente las quimiocinas relacionadas con CD8+T (Figura 6B-E; Figura S20A, Información de respaldo). En el aspecto de la eficacia de la inmunoterapia, aunque la monoterapia anti-PD-1 podría disminuir en parte la carga tumoral, el tratamiento conjunto con BCAT2 KD y el anticuerpo monoclonal (mab) anti-PD-1 indicó un mejor efecto de supresión tumoral y obtuvo más beneficio de supervivencia. El día programado, se recogieron los tumores y se prepararon para su posterior análisis. Una parte de ellos se digirió en una suspensión unicelular y se realizó un análisis de citometría de flujo. Con una población similar de leucocitos y células T (Figura S20B-E, Información de respaldo) en el tumor, se mostró una mayor proporción de células T CD8+en el grupo con deficiencia de BCAT2 que en el grupo de control negativo. De manera similar, el grupo de terapia combinada tuvo una infiltración más masiva de CTL que el grupo de monoterapia (Figura 6F-H). Más importante aún, los indicadores de citotoxicidad (GZMB, IFN-𝛾, TNF-𝛼 y Perforin) de los CTL también se reforzaron en tumores murinos con pérdida de BCAT2 y tratamiento combinado en comparación con el control correspondiente (Figura 6G, I – L). Las otras partes de los tumores se convirtieron en secciones congeladas y se implementó tinción IF. Como se esperaba, la densidad de células CD8+T en la región de interés (ROI) mostró la misma tendencia con el análisis de citometría de flujo (Figura 6M, N). Estos hallazgos indicaron que la deficiencia de BCAT2 en las células tumorales puede dar forma a un TME inflamado y tener una gran eficacia en el tratamiento de inmunoterapia. Para determinar el papel de las células T CD8+ en el efecto sinérgico del cotratamiento, se aplicó mab CD8𝛼 para antagonizarlas en ratones inmunocompetentes (Figura S21A, Información de respaldo) y se validó su efecto de agotamiento mediante citometría de flujo e IF. (Figura S21B, C, Información de respaldo). Obviamente, después del agotamiento, la carga tumoral y el tiempo de supervivencia se revirtieron significativamente (Figura S21D-G, Información de respaldo). Estos hallazgos indicaron que las células CD8+T desempeñan un papel indispensable en el efecto sinérgico de la terapia combinada.

Figura 4. BCAT2 varía los patrones de expresión de las quimiocinas relacionadas con las células T CD8+e inhibe la capacidad citotóxica de los CTL. A, B) Los mapas de calor de los inmunoensayos múltiples de ProcartaPlex muestran la variación de la secreción de citocinas y quimiocinas comunes en los grupos BCAT2 OE, BCAT2 KD y control negativo (n=3 por grupo). C,D) Los histogramas muestran niveles de expresión de ARNm normalizados y concentraciones de secreción de proteínas de CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 y CXCL10 en BCAT2 OE (izquierda), BCAT2 KD (derecha) y grupos de control negativo (n {{ 15}} por grupo). *p < 0.{{20}}5; **p<0.01; ***p < 0,001. E) El ensayo de quimiotaxis indica una capacidad de quimiotaxis diferente de los CTL en los grupos BCAT2 OE, BCAT2 KD y control negativo (n=3 por grupo). *p < 0,05; **p<0,01. F) El ensayo de destrucción de células cancerosas mediada por células T indica diferentes capacidades de destrucción de células T cocultivadas con líneas celulares BCAT2 OE, BCAT2 KD y control negativo (n=3 por grupo). G) El análisis de citometría de flujo indica diferentes actividades de las células T CD8+ en diferentes grupos de cocultivo (n=3 por grupo).

Figura 5. Validación de las relaciones espaciales exclusivas de células tumorales BCAT2+ y células T CD8+ mediante TMA de la cohorte Xiangya BLCA. A) Imagen IHC de BCAT2 y CD8 en tipos de TME inflamados y no inflamados. Barra de escala: 50 μm. B) Correlación entre BCAT2 y CD8 sobre la base de sus puntuaciones IHC en TMA general. C) Imagen IF multicolor de BCAT2, CK19, CD8 e índice combinado en tipos de TME inflamados y no inflamados. Célula BCAT2+ (rosa), célula CK19+ (cian), célula CD8+T (naranja) y núcleo celular (azul). Barra de escala: 50 μm. D,E) Tasas de coexpresión detalladas de células BCAT2+CK19+ y BCAT2+CD8+ en la muestra típica. F) Análisis de gradiente de distancia (0–25, 25–50, 50–100 y 100–150 μm) de células CD8+T alrededor de células BCAT2+CK19+ en el modo típico muestra.

Figura 6. La pérdida de BCAT2 mejora la eficacia de la terapia anti-PD-1. A) Diagrama de flujo del plan de tratamiento. B) Tumores recolectados de diferentes regímenes de terapia (n=5 por grupo). C – E) Cuantificación del volumen tumoral, peso corporal y tiempo de supervivencia en diferentes regímenes terapéuticos (n=5 por grupo). ns: sin significancia; *pag< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. F) Contour plots indicate the proportion of CD8+T cells; G) proportions of GZMB+CD8+T cells, IFN-𝛾+CD8+T cells, TNF- 𝛼+CD8+T cells, and Perforin+CD8+T cells in different therapy regimens. H) Quantified scatter plots exhibit proportion of CD8+T cells; I–L) proportions of GZMB+ CD8+T cells, IFN-𝛾+ CD8+T cells, TNF-𝛼+ CD8+T cells, and Perforin+ CD8+T cells in different therapy regimens (n = 5 per group). ns: no significance; *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. M, N) IF image and quantified histogram show densities of CD8+T cells in different therapy regimens (n = 3 per group). Scale bar: 20 μm. CD8+T cell (green) and cell nucleus (blue). ns: no significance, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

Además, junto con las células tumorales, una pequeña proporción de BCAT2 también se expresa en las células T CD8+. Por lo tanto, exploramos más a fondo si los diferentes niveles de expresión de BCAT2 en las células T CD8+ pueden afectar sus actividades. Después de teñir una suspensión unicelular del bazo murino con BCAT2 y anticuerpos fluorescentes relacionados con células T, comparamos proporciones de células CD8+ TNF-𝛼+T y CD8+ IFN-𝛾+T entre BCAT. Grupos 2+CD8+ y BCAT2−CD8+. Curiosamente, encontramos que las proporciones eran similares entre los dos grupos, lo que revela que la actividad de la célula T CD8+ es independiente de su nivel de expresión de BCAT2 (Figura S22A-C, Información de respaldo).

2.6. BCAT2 predice la respuesta a la inmunoterapia en varias cohortes de inmunoterapia del mundo real

Los hallazgos anteriores han demostrado un papel inmunosupresor de BCAT2 en la TME y el efecto sinérgico de combinar la pérdida de BCAT2 con la terapia anti-PD-1. Sin embargo, su potencial predictivo sobre la eficacia de la inmunoterapia no está claro. Por lo tanto, en la cohorte TCGA-BLCA, se compararon las puntuaciones de enriquecimiento de las vías relacionadas con la inmunoterapia entre los grupos de BCAT2 alto y bajo. Como se muestra en la Figura S23A (Información de respaldo), el grupo con bajo contenido de BCAT2 tenía genes más activos en las vías relacionadas con la inmunoterapia, lo que puede inferir que la baja expresión de BCAT2 representa un estado más sensible a la inmunoterapia. Para una mayor validación, se incluyeron en la cohorte de inmunoterapia Xiangya BLCA 58 pacientes con cáncer de vejiga con invasión muscular (MIBC) que aceptaron terapia neoadyuvante anti-PD-1 en nuestro hospital. Las imágenes representativas de IHC, IF y CT del respondedor y del no respondedor implicaron que el nivel de expresión de BCAT2 tiene una estrecha relación con la eficacia de la inmunoterapia: un individuo con un nivel bajo de expresión de BCAT2 tiene más probabilidades de responder a la inmunoterapia que un individuo con un alto nivel de expresión de BCAT2 (Figura 7A-C). Además, la puntuación IHC de la cohorte de inmunoterapia BLCA de Xiangya y la matriz de expresión de ARNm de la cohorte IMvigor210 indicaron una fuerte correlación negativa entre BCAT2 y PD-L1 (R=−{{3{{32} }}}.4, p=0.002; R=−0,41, p < 0,001) (Figura S23B, C, Información de respaldo). Por lo tanto, comparamos directamente la eficacia de la inmunoterapia entre los grupos de BCAT2 alto y bajo en la cohorte de inmunoterapia BLCA de Xiangya y encontramos que el grupo de BCAT2 bajo tuvo una proporción significativamente mayor de respondedores que el grupo de BCAT2 alto (p=0.001). (Figura 7D). Además, evaluamos los valores de predicción de BCAT2, PD-L1 y el índice de combinación (BCAT2+PD-L1) sobre la respuesta patológica a la inmunoterapia y encontramos el gran rendimiento del índice de combinación (BCAT2+PD- L1) sobre la precisión de la predicción (Figura 7E). De manera inspiradora, en el aspecto del resultado de supervivencia, el grupo con BCAT2 bajo tuvo una supervivencia libre de enfermedad (SSE) más prolongada que el grupo con BCAT2 alto (p=0.032) (Figura 7F), lo que demuestra el valor pronóstico de BCAT2 en Inmunoterapia BLCA. En el ámbito clínico, los individuos con TME desértico tienen más probabilidades de tener una eficacia de inmunoterapia limitada que los individuos con TME inflamado, lo que resalta aún más la importancia de los indicadores de pronóstico. En consecuencia, seleccionamos a todos los individuos con TME del desierto en la cohorte IMvigor210 y realizamos una evaluación integral. En una comparación directa del nivel de expresión de BCAT2 entre diferentes grupos de respuesta, el grupo CR (que responde) tuvo un nivel de expresión de BCAT2 significativamente más bajo que los grupos SD y PD (que no responden) (Figura 7G). Más importante aún, el índice combinado (BCAT2+PD-L1) también tuvo un excelente desempeño en la precisión de la predicción (Figura 7H). Aunque no hubo diferencias significativas en la supervivencia general (SG) entre los grupos de BCAT2 alto y bajo en el tipo desértico de la cohorte IMvigor210, la tendencia del pronóstico aún fue similar al resultado de la cohorte de inmunoterapia BLCA de Xiangya (Figura 7I). Además de PD-L1, la inestabilidad de microsatélites (IMS) es el otro predictor esencial de la eficacia de la inmunoterapia. El estado de reparación de errores de coincidencia (MMR): MMR competente (pMMR) y MMR deficiente (dMMR) mantienen una alta conformidad con MSI de baja frecuencia (MSI-L) y MSI de alta frecuencia (MSI-H).[13] Por lo tanto, realizamos una evaluación integral de todos los individuos en la cohorte de inmunoterapia Xiangya BLCA basada en los resultados de la tinción de cuatro genes marcadores MMR (MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2). El resultado reveló una proporción significativamente mayor de dMMR (MSI-H) en el grupo con BCAT2 bajo en comparación con el grupo con BCAT2 alto (p=0.02) (Figura S23D, E, Información de respaldo). Además, evaluamos los valores predictivos de MMR, BCAT2 y el índice de combinación (MMR+BCAT2) sobre la eficacia de la inmunoterapia y encontramos que el índice de combinación (MMR+BCAT2) tuvo un desempeño elegible en cuanto a la precisión de la predicción (Figura S23F, Información de respaldo). En conjunto, estos hallazgos demostraron que BCAT2 está calificado para actuar como un predictor complementario de la eficacia de la inmunoterapia BLCA. Finalmente, se exploró el valor predictivo de BCAT2 en respuesta a la inmunoterapia en varios tipos de cáncer. Encontramos que los individuos con alta expresión de BCAT2 mostraron una tasa de respuesta significativamente peor (p=0.04) en la cohorte GSE35640 (melanoma) (Figura 7J). Aunque no hubo diferencias significativas en la tasa de respuesta entre los grupos de BCAT2 alto y bajo en GSE173839 (cáncer de mama), GSE135222 (NSCLC) y la cohorte Gide 2019 (melanoma), los pacientes con baja expresión de BCAT2 tenían aún más probabilidades de tener una respuesta positiva. a la inmunoterapia (Figura 7K-M).

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2.7. El valor de BCAT2 para pronosticar el subtipo molecular y guiar la terapia de precisión

Dada la gran heterogeneidad existente en la clasificación histológica tradicional, cada vez hay más pruebas que demuestran que el subtipo molecular puede proporcionar una clasificación más precisa sobre la base del perfil del transcriptoma en BLCA.[14] Además, con características inmunológicas similares en el mismo subtipo, la clasificación molecular tiene un gran potencial para predecir la EMT y guiar el tratamiento de precisión en el ámbito clínico.[15] A través de un análisis exhaustivo de diferentes sistemas de subtipos moleculares en la cohorte TCGA-BLCA, descubrimos que es más probable que los individuos con baja expresión de BCAT2 se clasifiquen en un subtipo basal, acompañado de vías activadas de diferenciación basal, diferenciación EMT, diferenciación inmune, respuesta al interferón, etcétera. Los individuos con alta expresión de BCAT2 se clasifican principalmente en subtipos luminales, acompañados de vías activas de diferenciación luminal, diferenciación urotelial y Ta (Figura S24A, Información de respaldo). Según el consenso de subtipo molecular, el subtipo basal tiene mayor nivel de infiltración de linfocitos efectores y una vía de señalización de IFN-𝛾 más activa que el subtipo luminal,[16] lo que implica una mejor eficacia de la inmunoterapia. Luego, se utilizó el AUC para evaluar la precisión de la predicción. Sorprendentemente, excepto el sistema de subtipo Baylor (AUC=0.76), la mayor parte del AUC estaba más allá de 0.90 en otros sistemas (Figura S24B, Información de respaldo), lo que significa una precisión de predicción sólida de BCAT2 en El subtipo molecular. Para explorar más a fondo su papel en la predicción de la eficacia de otras terapias, comparamos la actividad de la terapia dirigida al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y las vías relacionadas con la radioterapia entre los grupos de BCAT2 alto y bajo. Con actividades obviamente reguladas al alza, los pacientes en el grupo con BCAT2 bajo tienen más probabilidades de tener una respuesta positiva a la terapia y radioterapia dirigidas a EGFR (Figura S24C, Información de respaldo). Para mejorar la confiabilidad de la predicción sobre el subtipo molecular y la sensibilidad del tratamiento, se utilizaron ocho cohortes BLCA (cohorte Xiangya BLCA, GSE31684, GSE69795, GSE48075, GSE128702, GSE83586, GSE52329 y E-MTAB-1803) y una cohorte de inmunoterapia BLCA (IMvigor210). solicitó validación externa. Junto con una excelente precisión de predicción, se encontraron hallazgos similares en estas cohortes (Figuras S25 a S27, Información de respaldo). La enfermedad hiperprogresiva (HPD) es un estado extremadamente insensible a la inmunoterapia. Para explorar la influencia de BCAT2 en el HPD, se recopilaron biomarcadores asociados al HPD de estudios previos[17] y se comparó la CNV de los biomarcadores entre los grupos de BCAT2 bajo y alto. A excepción de EGFR, las tasas de amplificación de CNV de otros biomarcadores asociados con HPD positivo (símbolo rojo) fueron mayores en el grupo con alto contenido de BCAT2, especialmente MDM2 (p=0.0116). Las tasas de eliminación de CNV de biomarcadores asociados con HPD negativos (símbolo verde) fueron más bajas en el grupo con alto contenido de BCAT2 (Figura S24D, Información de respaldo). El resultado indicó que los pacientes con alta expresión de BCAT2 tienen un riesgo potencial de HPD durante la inmunoterapia. La quimioterapia neoadyuvante (NAC) es una terapia crucial en BLCA. Los marcadores que pronostican la respuesta a la NAC en BLCA se obtuvieron de una revisión de Buttigliero et al.[18] y sus tasas de mutación se compararon entre los dos grupos. Con base en tasas de mutación generales más altas de biomarcadores y una mutación más frecuente de RB1 en el grupo con bajo contenido de BCAT2, especulamos que el individuo con baja expresión de BCAT2 tiene una mejor eficacia de NAC en el ámbito clínico (Figura S24E, Información de respaldo). Por lo tanto, se utilizó la base de datos de Drugbank para comparar las eficacias de varios regímenes de quimioterapia comunes entre dos grupos y se encontró que los individuos con baja expresión de BCAT2 tienen más probabilidades de responder a la quimioterapia. Además, el grupo con niveles bajos de BCAT2 también mostró mejores eficacias en regímenes comunes de inmunoterapia y terapia con ERBB. Inesperadamente, los pacientes con alta expresión de BCAT2 probablemente obtengan mejores efectos curativos con la terapia antiangiogénica (Figura S24F, Información de respaldo). En conjunto, los individuos con baja expresión de BCAT2 pertenecen a un subtipo molecular inflamado, el subtipo basal, lo que significa una respuesta más positiva a la inmunoterapia, quimioterapia, radioterapia, terapia dirigida a EGFR y terapia ERBB. Desafortunadamente, los pacientes con alta expresión de BCAT2 tienen una mala respuesta a estos tratamientos. Sin embargo, la terapia antiangiogénica puede ser un rayo de luz para ellos.

Figura 7. BCAT2 predice la respuesta a la inmunoterapia en varias cohortes de inmunoterapia del mundo real. A) Imagen IHC de BCAT2 y PD-L1 entre respondedores y no respondedores en la cohorte de inmunoterapia Xiangya BLCA. Barra de escala: 50 μm. B) Imagen IF multicolor de BCAT2 y PD-L1 entre respondedores y no respondedores en la cohorte de inmunoterapia Xiangya BLCA. Barra de escala: 50 μm. Célula BCAT2+(verde), célula PD-L1+(amarilla) y núcleo celular (azul). C) Imagen de TC de la diferencia en la eficacia de la inmunoterapia entre individuos con niveles de expresión altos y bajos de BCAT2. La flecha roja apunta al área del tumor. D) Diferencia general en la tasa de respuesta entre los grupos de BCAT2 alto y bajo en la cohorte de inmunoterapia Xiangya BLCA. E) Precisión de predicción de BCAT2, PD-L1 y el índice de combinación (BCAT2+PD-L1) sobre la respuesta a la inmunoterapia en la cohorte de inmunoterapia Xiangya BLCA. F) Diferencia en la supervivencia libre de enfermedad (SSE) entre los grupos de BCAT2 alto y bajo en la cohorte de inmunoterapia Xiangya BLCA. G) Diferencias en el nivel de expresión de BCAT2 entre los grupos CR, PR, SD y PD en el tipo desértico de la cohorte IMvigor210. *p < 0,05; ns: sin importancia. H) Precisión de predicción de BCAT2, PD-L1 y el índice de combinación (BCAT2+PD-L1) sobre la respuesta a la inmunoterapia en una cohorte IMvigor210 de tipo desértico. I) Diferencia en la supervivencia general (SG) entre grupos de BCAT2 alto y bajo en una cohorte IMvigor210 de tipo desértico. J – M) Diferencias en la respuesta a la inmunoterapia entre grupos de BCAT2 alto y bajo en las cohortes GSE35640, GSE173839, GSE135222 y Gide2019.

3. Discusión

Como enzima clave en el proceso de catabolismo de los BCAA, investigaciones anteriores se centraron principalmente en el papel relacionado con el metabolismo de BCAT2 en enfermedades como la obesidad, la diabetes y la arritmia. Ma et al. demostró que eliminar BCAT2 en el tejido adiposo puede acelerar el pardeamiento y la termogénesis del tejido adiposo, lo que conduce a una reducción de la tasa de obesidad en ratones.[19] Mediante la detección de muestras de sangre de más de 2000 individuos, Gerszten et al. describieron un perfil de metabolitos relacionados con la diabetes y descubrieron que los BCAA transformados con BCAT2- desempeñan un papel crucial en el desarrollo de la enfermedad.[20] Portero et al. reveló que las mutaciones sin sentido de BCAT2p.Q300*/p.Q300* dan como resultado niveles elevados de BCAA e inducen arritmias en ratones.[21] Recientemente, un par de estudios encontraron que BCAT2 tiene una estrecha relación con el cáncer. Lei et al. reveló que la degradación de BCAT2 mediada por acetilación puede retardar el desarrollo de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) al regular negativamente el nivel metabólico de los BCAA.[22] Wang y cols. Se consideró que el nivel restringido de transcripción de BCAT2 conduce a una disminución del nivel de glutamato intracelular, lo que estimula la ferroptosis de las células del hepatoma.[23] Sin embargo, todas las investigaciones existentes enfatizaron la influencia del catabolismo de BCAA mediado por BCAT2-en el proceso biológico del cáncer en lugar de explorar un mecanismo completamente nuevo. En este estudio, revelamos por primera vez el papel inmunosupresor de BCAT2 en TME. La aplicación de la inmunoterapia redefine el tratamiento del cáncer, con una excelente calidad de vida y un tiempo de supervivencia prolongado. Sin embargo, debido a la heterogeneidad del sistema inmunológico tumoral, sólo una parte de los individuos obtiene una eficacia satisfactoria. TME es un sistema complicado, compuesto de células tumorales, células inmunitarias, células estromales y capilares.[24] Según el nivel de infiltración de los CTL, el TME se puede clasificar en tipos inflamados y no inflamados en general.[25] Cada vez hay más pruebas que indican que el TME inflamado desempeña un papel positivo en la generación de respuestas inmunitarias antitumorales eficaces durante el tratamiento.[26] Por lo tanto, analizamos exhaustivamente múltiples indicadores relacionados con TME y descubrimos que la alta expresión de BCAT2 da forma a un TME no inflamado, con un ciclo de inmunidad contra el cáncer impedido, un patrón de expresión represivo del perfil de quimiocinas, moléculas de MHC y un nivel de infiltración insuficiente de TIIC. Además, BCAT2 está relacionado negativamente con TIS y los genes efectores de ICB, lo que implica que los individuos con alta expresión de BCAT2 tienen más probabilidades de no responder a la inmunoterapia. Para validar nuestra hipótesis, comparamos la tasa de respuesta entre los grupos de BCAT2 alto y bajo en la cohorte de inmunoterapia BLCA de Xiangya y otras cohortes de inmunoterapia. Sorprendentemente, hubo diferencias significativas en múltiples cohortes, lo que indicó que BCAT2 también es capaz de predecir la eficacia de la inmunoterapia, especialmente en BLCA. Además, se utilizó scRNA-seq para explorar el mecanismo regulador de BCAT2 en TME e indicó que la actividad de las vías de señalización relacionadas con citocinas/quimiocinas, la vía de señalización de la quimiotaxis de las células T y la vía de señalización de la migración de las células T tienen correlaciones negativas significativas con BCAT2. Como red de regulación crítica, las citocinas y quimiocinas son indispensables para el tráfico de diversas células inmunitarias hacia TME. El sistema de quimiocinas tiene cuatro superfamilias: C, CC, CXC y CX3C, con una considerable redundancia en el emparejamiento de ligandos y receptores.[27] Las citoquinas se pueden dividir en subfamilias Th1, Th2 y Th17 según su función biológica.[28] A través de la secreción de diferentes niveles de ellos, la lucha entre las células tumorales y las células inmunes es suficiente para reprogramar las características de la TME.[29] Sin embargo, entre una gran cantidad de citocinas y quimiocinas, es necesario descartar el grupo más valioso. Utilizando un panel de inmunoensayo de citocinas y quimiocinas, revelamos que las quimiocinas, incluidas CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 y CXCL10, tienen una fuerte correlación negativa con la expresión de BCAT2 en células de cáncer de vejiga humanas y murinas. Es bien sabido que CXCL9 y CXCL10 son responsables de reclutar células CD8+T en TME.[30] Para determinar la función de CCL3, CCL4 y CCL5, buscamos investigaciones anteriores. Harlin et al. utilizó matrices de proteínas y qPCR para revelar que la regulación positiva de CCL3, CCL4 y CCL5 es capaz de promover la migración de células T CD8+al melanoma.[31] Nadie y col. encontró que una mayor población de secreción de CCL5 ayuda a establecer un TME proinflamatorio mediante el tráfico de CTL al tejido de cáncer colorrectal.[32] A través de IHC y RNA-seq del perfil de quimiocinas en múltiples cohortes, Romero et al. demostró que CCL4 y CCL5 tienen una fuerte asociación con el nivel de infiltración de células T CD8+en el cáncer de páncreas.[33] Por lo tanto, consideramos que las quimiocinas relacionadas con las células T CD8+ son las principales quimiocinas reguladas por BCAT2 en el cáncer de vejiga. Aunque demostramos las sólidas correlaciones negativas entre las quimiocinas relacionadas con las células BCAT2 y CD8+T, el mecanismo regulador subyacente entre ellas aún debe explorarse más a fondo. El estudio de Peterson et al. demostró que la activación de la vía de señalización MAP quinasa (MAPK) puede inducir la producción de CX3CL1.[34] Xu et al. reveló que la vía de señalización JAK-STAT regulaba la secreción de quimiocinas relacionadas con Th1-, lo que provocaba una disminución del nivel de infiltración de TIL.[35] Recientemente, Peng et al. descubrió que la desmetilasa JMJD3 puede inhibir la expresión de quimiocinas relacionadas con las células T CD4+ y reducir el nivel de infiltración de células T citotóxicas en el TME, lo que representa un papel crucial de la modificación epigenética en la regulación de la expresión de quimiocinas.[36] Mayo et al. También reveló que un inhibidor epigenético, la histona desacetilasa 1, tiene una gran capacidad para suprimir la expresión de CXCL8 mediante la activación de la vía de señalización del factor nuclear-𝜅B (NF-𝜅B).[37] Además, como símbolos del metabolismo de las células tumorales, la glucólisis aeróbica y las especies reactivas de oxígeno (ROS), indican un gran rendimiento en la inducción de la expresión de CXCL8 y CXCL14 mediante la elevación de las actividades de las vías de señalización de NF-𝜅B y la proteína activadora del factor de transcripción 1 (AP{{93 }}).[38] Curiosamente, en nuestro estudio, las vías de señalización de NF-𝜅B, STAT y MAPK se enriquecieron significativamente entre líneas celulares de BCAT2 alto y bajo (Figura 3K; Figura S16A, B, Información de respaldo). Por lo tanto, en combinación con los estudios anteriores, exploraremos más a fondo la molécula clave en el mecanismo de regulación de las quimiocinas relacionadas con BCAT2 y CD8+T. La tasa de respuesta objetiva limitada de la monoterapia con ICB impulsa la llegada de una estrategia de terapia combinada. Para convertir TME no inmunológica en TME inmunológica, Wolchok et al. aplicó el cotratamiento de nivolumab (terapia anti-PD-1) e ipilimumab (terapia anti-CTLA-4) en pacientes con melanoma y encontró un efecto curativo alentador, atribuyéndose a un cebado, activación y destrucción mejorados sincrónicos de CTL .[39] Más que combinar con otro tipo de BCI, la quimioterapia más inmunoterapia es una opción de terapia alternativa. Como régimen de tratamiento de primera línea para el carcinoma urotelial avanzado, en un par de estudios se encontró que la quimioterapia basada en cisplatino es capaz de formar un TME proinflamatorio al aumentar el nivel de expresión del MHC de clase I en las células dendríticas y dañar las MDSC y las Treg.[40] Casualmente, Homma et al. reveló que otro fármaco de quimioterapia común para el cáncer de vejiga, la gemcitabina, puede mejorar la cantidad de infiltración de células CD8+T y alterar las células inmunes inmunosupresoras en TME.[41] En nuestro experimento preclínico con animales, el cotratamiento de la pérdida de BCAT2 y mab anti-PD-1 mostró una eficacia antitumoral más distinta en comparación con la monoterapia de mab anti-PD-1 en ratones inmunocompetentes, lo que proporciona un tratamiento innovador. estrategia para pacientes con resistencia al BCI. Mientras tanto, a través del análisis de citometría de flujo e IF, demostramos que la eliminación de BCAT2 no solo recluta más población de CTL en TME sino que también mejora la actividad de destrucción de los CTL. De manera similar, Peng et al. encontró que la sobreexpresión de LGALS2 disminuye la cantidad de CTL infiltrantes, así como los biomarcadores citotóxicos en ratones con cáncer de mama.[42] Yang et al. ilustró que CXCL13 es capaz de aumentar la respuesta a la inmunoterapia en modelos de ratón con cáncer de ovario al aumentar el nivel de infiltración de células T CD8+ y el nivel de secreción de GZMB, IFN-𝛾 e IL-2.[43] Acompañada de una respuesta anticancerígena más fuerte, la terapia combinada altera aún más el circuito de retroalimentación inmune existente, lo que probablemente conduce a efectos secundarios graves. De acuerdo con el patrón de expresión de BCAT2 a nivel de ARNip, expresado específicamente en células tumorales en lugar de en células inmunes y células endoteliales, podemos inferir preliminarmente que es menos probable que la pérdida de BCAT2 o el inhibidor de BCAT2 produzca efectos adversos terribles. Sin embargo, aún es necesario explorar la dosis óptima y el intervalo de tiempo del inhibidor de BCAT2 y el mab anti-PD-1 en terapia combinada.

Para guiar la terapia de precisión en individuos, correlacionamos BCAT2 con el subtipo molecular de BLCA y biomarcadores críticos de diversas terapias. Basándonos en predicciones creíbles en múltiples cohortes, descubrimos que la inmunoterapia, la quimioterapia, la radioterapia y la terapia dirigida a EFGR son adecuadas para pacientes con baja expresión de BCAT2. Se recomienda la terapia antiangiogénica para pacientes con alta expresión de BCAT2. A diferencia del complicado proceso de detección de subtipos moleculares, BCAT2 es un predictor portátil para terapia de precisión. Inevitablemente, existen algunas limitaciones en nuestros estudios. En primer lugar, los tamaños de muestra y el tiempo de seguimiento de la cohorte Xiangya BLCA y la cohorte de inmunoterapia Xiangya BLCA fueron limitados. Necesitamos ampliar aún más el tamaño de la muestra y continuar con el seguimiento estandarizado. En segundo lugar, como cohorte del mundo real, la cohorte de inmunoterapia BLCA de Xiangya contenía diferentes opciones quirúrgicas que probablemente causaron un sesgo potencial. Ampliaremos aún más nuestra cohorte y realizaremos análisis de subgrupos basados ​​en la misma opción quirúrgica. En tercer lugar, el efecto cooperativo de la terapia combinada in vivo debe validarse aún más mediante la aplicación sistémica del inhibidor BCAT2. En resumen, como función inmunosupresora en TME de BLCA, BCAT2 es un objetivo emergente en la terapia combinada de ICB y un biomarcador preciso de terapia de precisión.

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4. Sección Experimental

cohort: As illustrated in a previous study,[44] 56 eligible BLCA patients accepted surgical treatment (TURBT (transurethral resection of bladder tumor) or radical cystectomy) in Xiangya Hospital. All the samples were conducted through high throughput RNA sequencing (RNA-seq) to acquire transcriptome information. Then, data on RNA-seq, clinicopathologic features, and follow-up information of these patients were utilized to construct the Xiangya BLCA cohort (Table S1, Supporting Information). Xiangya BLCA immunotherapy cohort: 58 MIBC patients were included in the Xiangya BLCA immunotherapy cohort. All the samples were obtained by diagnostic TURBT before the implementation of neoadjuvant anti-PD-1 therapy. After at least two cycles standard neoadjuvant immunotherapy (NAI), TURBT, or radical cystectomy (RC) were conducted based on treatment response and patients' willingness. 17 individuals with complete response (CR) and 16 individuals with partial response (PR) were classified into responders, 17 individuals with stable disease (SD), and 8 individuals with progressive disease (PD) were classified into nonresponders. The detailed clinicopathological characteristics are listed in Table S2 (Supporting Information). Xiangya scRNA cohort: Three samples of muscle-invasive bladder cancer were implemented scRNA-seq, constituting the Xiangya scRNA cohort. Detailed preparation of single-cell suspension, data transformation, and cell quality control have been elaborated in previous articles.[45] In simple terms, three tumor samples were loaded on a Chromium Single Cell Controller instrument (10×Genomics, USA) to produce single-cell gel beads in suspension. Seurat R package was applied to transform the count matrix into Seurat format. Four standards were set up for excluding low-quality cells in the matrix: unique molecular identifier (UMI) amount < 1000, gene quantity < 200, log10GenesPerUMI < 0.70, and mitochondrial-originated UMI counts > 20%. After integrating the samples based on the top 3000 variable traits, principal component analysis (PCA) and the Findclusters algorithm were employed to identify main cell clusters. Based on the level of copy number variation (CNV) in epithelial cells, malignant bladder carcinoma cells were selected from clusters. The study plan was approved by the ethics committee of Xiangya Hospital, Central South University (Item number: 2021101175). All the specific men were collected complying with informed consent rights. The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database: RNA expression matrix, survival outcome, and CNV of 33 types of carcinomas were acquired from the UCSC Xena database. Log2 transformation was employed to normalize RNA-seq data and the GISTIC algorithm was applied to process CNV data. Gene Expression Omnibus (GEO) Database: Transcriptome data of 1740 samples from nine BLCA cohorts: GSE31684 (93 samples), GSE48075 (142 samples), GSE69795(61 samples), GSE32894 (308 samples), GSE48276 (116 samples), GSE83586 (307 samples), GSE86411 (132 samples), GSE52329 (20 samples), GSE87304 (305 samples), and GSE128702 (256 samples) were obtained from GEO database. RNA-seq data of three immunotherapy cohorts: GSE35640 (14 samples, melanoma, and MAGE-A3 therapy), GSE173839 (105 samples, breast cancer, and anti-PD-L1 therapy), and GSE135222 (27 samples, nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC), and anti-PD-1/PD-L1 therapy) were downloaded from GEO database. Single-cell transcriptomic characterization of two BLCA scRNA cohorts: GSE135337 (8 samples) and GSE145137 (3 samples) was obtained from the GEO database. Data processing was similar to the Xiangya siRNA cohort. Other Databases: RNA expression matrix and clinicopathologic characteristics of immunotherapy cohorts: IMvigor210 (348 samples, bladder cancer, and anti-PD-1 therapy) and Gide2019 (58 samples, melanoma, anti-PD-1, or anti-CTLA-4 therapy) were collected from http://researchpub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies and TIDE database (http://tide. dfci.harvard.edu/). Data of RNA-seq and clinical characteristics of a BLCA cohort—E-MTAB-1803 (85 samples)—was downloaded from ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). BCAT2 expression levels in various types of cancer cell lines were downloaded from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database. Specific clinicopathologic and follow-up information from public databases were listed in our previous studies.[44,46] Assessment of Immunological Identity of TME in BLCA: As depicted in our previous study,[44] a comprehensive evaluation of the immunological trait of TME in BLCA was summarized. The tracking tumor immunophenotype (TIP) website (http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/) was used to assess the activities of cancer immunity cycles, which reflected the effectiveness of antitumor immunity. It is separated into seven concrete steps: release and presentation of tumor antigen (steps 1 and 2), startup and activation of effector T cells (step 3), trafficking and assisting diverse immune cells into TME (steps 4 and 5), recognition and killing cancer cells (steps 6 and 7).[47] Six independent algorithms (TIMER, CIBERSORT, CIBERSORT-ABS, MCP-COUNTER, TISIDB, and XCELL) were employed to calculate the infiltration levels of tumor-infiltrating immune cells (TIICs).[48] Furthermore, effector genes of immune cells, ligands and receptors of chemokines, major histocompatibility complex (MHC) molecules, and immunostimulators were collected for evaluating immunological characteristics of TME multi-dimensionally. T cell-inflamed score (TIS) and markers of ICB were utilized to assess the host sensitivity state to immunotherapy.[49] Enrichment Pathways Analysis: Limma R package with empirical Bayesian function was employed to screen differentially expressed genes (DEGs) between high and low expression of BCAT2 in the RNA expression matrix.[50] Screening thresholds were |log (fold change) (log FC) |>1,5 y el valor p ajustado < 0.05. Los análisis de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) se realizaron en DEG identificados mediante el paquete ClusterProfiler R.[51] Se aplicó el paquete Seurat R con el algoritmo Findmarker para calcular el nivel de expresión de BCAT2 en células epiteliales en scRNA-seq. Sobre la base de la clasificación variada de la expresión genética por valor de cambio de veces (FC), se implementó el análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA) para juzgar las correlaciones positivas y negativas. Identificación de DEG relacionados con el sistema inmunológico: se empleó el paquete ESTIMATE R para calcular puntuaciones inmunes y estromales en la cohorte TCGA-BLCA. De acuerdo con el valor mediano de dos puntuaciones y el nivel de expresión de BCAT2, se aplicó el paquete Limma R para identificar DEG positivos/negativos relacionados con el sistema inmunológico y con el estroma. El paquete R del diagrama de Venn se utilizó para tomar la intersección de varios grupos y garantizar los DEG comunes. Clasificación de personas que utilizan subtipos moleculares de BLCA: siete subtipos moleculares de BLCA (UNC, Baylor, TCGA, MDA, Lund, CIT y Consensus) se aplicaron ampliamente en la práctica clínica para evaluar las características de TME y la eficacia de diversas terapias.[52] Teniendo en cuenta la compleja interacción de varios subtipos, los dividimos colectivamente en dos categorías principales: subtipos basales y luminales.[16] Se emplearon paquetes R de subtipos Consensus MIBC y BLCA para clasificar individuos en subtipos específicos. Después de la normalización, se utilizó el área bajo la curva ROC (AUC) para evaluar la confiabilidad de BCAT2 en la predicción de la clasificación. Evaluación de la terapia de precisión de los pacientes: como se ilustra en nuestro estudio anterior,[53] se recopiló una serie de firmas genéticas críticas, que pueden predecir la eficacia de la quimioterapia, la radioterapia, la terapia dirigida y la inmunoterapia, a partir de diferentes estudios y bases de datos.[16, 54] El algoritmo ssGSEA se utilizó para calcular las puntuaciones de enriquecimiento de las firmas genéticas.[55] Líneas celulares: Se adquirieron células de cáncer de vejiga humana (T24) y células de cáncer de vejiga murinas (MB49) de Procell Life Science & Technology (Wuhan, China) y Meisen CTCC (Jinhua, China), respectivamente. Se mantuvieron en medio DMEM (BasalMedia, China) con 10% de suero bovino fetal (FBS) (BI, Israel), 1% de penicilina y estreptomicina (NCM Biotech, China), y se cultivaron en una incubadora a 37 grados de temperatura que contienen 5% de CO2. Construcción y secuencia de ARN de células de transfección estables: GeneChem (Shanghai, China) diseñó y construyó el vector lentiviral plenti-BCAT2-flag-puromicina (GV341) para la sobreexpresión estable de BCAT2-(BCAT2 OE) línea celular y su control negativo (oe-vector). Además, GeneChem (Shanghai, China) clonó el ARN de horquilla corta (shRNA) de BCAT112- en el vector lentiviral GV112-para obtener una línea celular estable de desactivación de BCAT2-(BCAT2 KD). . Las secuencias objetivo de shRNA se enumeran en la Tabla S3 (Información de respaldo). Luego, se transfectaron lentivirus BCAT2 recombinantes en células objetivas según las instrucciones del fabricante. Se emplearon 2 ug ml-1 de puromicina (Amersco, EE. UU.) para filtrar células de transfección estables durante tres días. Se aplicaron Western blot y PCR cuantitativa de transcripción inversa (qRT-PCR) para validar la eficacia de la transfección. Finalmente, se eligió una célula de transfección estable con la mejor eficacia para RNA-seq y experimentos adicionales. Se enviaron tres muestras duplicadas de cada línea celular a la plataforma BGI RNA-seq (Shenzhen, China). Los criterios para seleccionar DEG y el análisis de las vías de enriquecimiento fueron los mismos que se describen en 2.3 (análisis de las vías de enriquecimiento). Inmunoensayos múltiples ProcartaPlex para detectar el nivel de secreción de quimiocinas y citocinas de líneas celulares cancerosas: panel de inmunoensayo ProcartaPlex humano (Cat: EPX340-12167-901) y panel de inmunoensayo ProcartaPlex de ratón (Cat: EPX{{50}}) se adquirieron de ThermoFisher Scientific (Massachusetts, EE. UU.) para detectar niveles de expresión de proteínas de más de 30 quimiocinas y citocinas cruciales en células cancerosas de transfección estable. En resumen, los sobrenadantes del cultivo celular se recogieron de una placa de pocillos 24- y se centrifugaron para eliminar las células y los restos celulares. Luego, los sobrenadantes clarificantes se incubaron con perlas en el panel siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó la plataforma de detección Luminex (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) para realizar análisis cuantitativos en cada muestra. Los indicadores no detectados fueron excluidos del análisis. qRT-PCR: el ARN total se aisló de las células con el kit de aislamiento de ARN total celular y el kit de aislamiento de ARN total animal (Foregene, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADNc se sintetizó utilizando el sistema UeIris II RTPCR para la síntesis de ADNc de primera cadena (EE.UU. Everbright, China). qRTPCR se realizó utilizando SYBR Green qPCR Master Mix (EE.UU. Everbright, China) en CFX Connect System (Bio-Rad, EE.UU.). Se utilizó GAPDH como control estándar interno. Los cebadores fueron diseñados y sintetizados por Sangon Biotech (Shanghai, China) y las secuencias detalladas de los cebadores se enumeran en la Tabla S4 (Información de respaldo). ELISA: Las concentraciones de CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 (MIG) y CXCL10 (IP10) en sobrenadantes de cultivos de células de cáncer de vejiga humana se determinaron mediante kits de ELISA humanos siguiendo el protocolo del fabricante (Proteintech, EE. UU.). Se empleó un lector de microplacas biotecnológico (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) para medir los valores de densidad óptica (OD). En vista de la enorme diversidad de niveles de secreción entre diferentes citocinas y quimiocinas, realizamos una estandarización de datos (transformación log 2) antes del análisis. Western Blot: se utilizó tampón RIPA (NCM biotech, China) añadido con un cóctel inhibidor de proteasa al 1 % (NCM biotech, China) para lisar las células. Se empleó el kit de ensayo de proteínas BCA (NCM biotech, China) para determinar las concentraciones de proteínas. Después de ser transferidas a membranas de PVDF, las proteínas celulares se incubaron sucesivamente con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios específicos conjugados con HRP. Las señales fueron capturadas por el sistema de imágenes XRS (Bio-Rad, EE. UU.). Los anticuerpos primarios incluyen un anticuerpo anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, EE. UU.) y un anticuerpo anti-GAPDH (Cat: ab8245, Abcam, EE. UU.). Los anticuerpos secundarios incluyen IgG anti-conejo de cabra HRP (Cat: 7074, Cell Signaling Technology, EE. UU.) e IgG anti-ratón de cabra HRP (Cat: 7076, Cell Signaling Technology, EE. UU.). Ensayo de cocultivo y ensayo de destrucción de células cancerosas mediado por linfocitos T: Se recolectaron muestras de sangre de 10 donantes sanos en nuestro hospital. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, se empleó centrifugación en gradiente para extraer células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante Lymphoprep (Cat: 07851, StemCell Technologies, EE. UU.). Además, se utilizó tampón de lisis de glóbulos rojos (Solarbio, China) para eliminar los glóbulos rojos mezclados con PBMC. Para activar las células T, se cultivaron PBMC en medio DMEM (Gibco, EE. UU.), complementando IL- 2 humana recombinante (10 ng mL-1, Cat: 202-1L-050, R&D , EE. UU.) y activador de células T CD3/CD28/CD2 humano ImmunoCult (25 μL mL-1, Cat: 10970; STEMCELL Technologies, EE. UU.) durante 1 semana. En una proporción de 1:5, se cocultivaron células de cáncer de vejiga humana (BCAT2-OE, BCAT2-KD y sus controles negativos) con células T activadas en medio DMEM con anticuerpo anti-CD3 (100 ng mL-1, Thermo Scientific, EE. UU.) e IL-2 (10 ng mL-1) de un donante en 12- placa de pocillos durante 72 h. Luego, se recogieron células T para análisis de citometría de flujo. La estrategia de compuerta detallada del análisis de flujo se muestra en la Figura S28 (Información de respaldo). Las células cancerosas restantes se tiñeron con cristal violeta y se midió el valor de DO a 570 nm mediante un lector de microplacas. Los anticuerpos para el análisis de citometría de flujo incluyen el kit de viabilidad fijable Zombie Aqua (Cat: 423101, Biolegend, EE. UU.), el CD45 antihumano APC/Cy7 (Cat: 368516, Biolegend, EE. UU.), el anticuerpo CD3 antihumano Pacific Blue (Cat: 300329, Biolegend, EE. UU.), anticuerpo CD4 antihumano PerCP/Cy5.5 (Cat: 317427, Biolegend, EE. UU.), anticuerpo CD8a antihumano FITC (Cat: 301006, Biolegend, EE. UU.), TNF-antihumano PE/Dazzle 594 𝛼 Anticuerpo (Cat: 502946, Biolegend, EE. UU.) y Anticuerpo anti-IFN- 𝛾 humano Brilliant Violet 711 (Cat: 502540, Biolegend, EE. UU.). Ensayo de quimiotaxis: El ensayo de quimiotaxis se implementó en una placa transwell 24-pocillo con un diámetro central de 3 μm (Corning, EE. UU.). Se utilizó un kit de aislamiento de células T CD8+humanas (Cat: 480012, Biolegend, EE. UU.) para extraer células T CD8+de PBMC. Se agregaron 1 x 105 células aisladas en un volumen de 200 μL a la cámara superior y se agregaron 600 μL de sobrenadantes de diferentes líneas celulares de transfección estables a la cámara inferior. Después de una incubación durante 6 horas a 37 grados, las células migraron a la cámara inferior y se recogieron y contaron mediante citometría de flujo. Ensayos de proliferación, migración e invasión celular: Se utilizó un ensayo de formación de colonias en placa para evaluar la capacidad de proliferación celular. BCAT2-OE, BCAT2-KD y células de cáncer de vejiga humana de control negativo se cultivaron en 6-placas de pocillos por pocillo. Después de incubar en una atmósfera humidificada a 37 grados durante 2 semanas, las colonias se fijaron y se tiñeron con paraformaldehído y cristal violeta, respectivamente. Se emplearon cámaras Transwell con inserciones de membrana de policarbonato de poro de 8,0 μm (Corning, EE. UU.) para evaluar la capacidad de migración e invasión celular in vitro. Se suspendieron 1 x 105 células transfectadas estables en medio sin suero y se sembraron en la cámara superior con o sin Matrigel (Corning, EE. UU.), para el ensayo de invasión y migración por separado. Después de incubar durante 24 h (ensayo de migración) y 48 h (ensayo de invasión), las células adheridas a la superficie inferior de la membrana se fijaron y tiñeron. Las células que permanecieron en la cámara superior se eliminaron mediante hisopos. Se seleccionaron cinco campos aleatorios bajo un microscopio para calcular el número de células. Inmunofluorescencia (IF) e inmunohistoquímica (IHC): IF multicolor en TMA de la cohorte Xiangya BLCA y la cohorte de inmunoterapia Xiangya BLCA se implementó mediante un kit de tinción inmunohistoquímica fluorescente múltiple (Absin, China). En resumen, después de la desparafinación, la rehidratación y la renovación del antígeno, la TMA se incubó con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios que provocan la unión de diferentes luciferinas mediante la amplificación de la señal de tiramida (TSA). Después de limpiar los anticuerpos no unidos con tampón citrato, el proceso de incubación se repitió dos veces. Se empleó DAPI para contrateñir los núcleos celulares y las imágenes se escanearon mediante la plataforma Pannoramic MIDI (3DHISTECH, Hungría). Los anticuerpos primarios en TMA de la cohorte Xiangya BLCA incluyen anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, EE. UU.), anti-Citoqueratina 19 (CK19) (Cat: ab52625, Abcam, EE. UU.), anti-CD8 (Cat: ab237709, Abcam, EE. UU. ) y DAPI (Invitrogen, EE. UU.). Los anticuerpos secundarios y el fluorocromo en TMA de la cohorte Xiangya BLCA incluyen HRP IgG de conejo/ratón de cabra, Absin 520 TSA Plus, Absin 570 TSA Plus, Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). Los anticuerpos primarios en TMA de la cohorte de inmunoterapia Xiangya BLCA incluyen anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, EE. UU.), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, EE. UU.) y DAPI (Invitrogen, EE. UU.). Los anticuerpos secundarios y el fluorocromo en TMA de la cohorte de inmunoterapia Xiangya BLCA incluyen HRP IgG de cabra anti-conejo/ratón, Absin 520 TSA Plus y Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). La IF en tejidos tumorales murinos se incubó secuencialmente con anticuerpo primario, anti-CD8 (Cat: 372902, BioLegend, EE. UU.), y anticuerpo secundario, conjugado de colorante anti-ratón Alexa Fluor 488 (Invitrogen, EE. UU.). Se aplicó DAPI al núcleo celular visualizado. Se seleccionaron cinco campos aleatorios bajo un microscopio para calcular el número de células con tinción positiva. La IHC en TMA de la cohorte Xiangya BLCA y la cohorte de inmunoterapia Xiangya BLCA se realizó mediante el kit SP-9000 (ZSGB-BIO, China). Después de la recuperación y el bloqueo del antígeno, los anticuerpos primarios y los anticuerpos secundarios se incubaron alternativamente con tejidos tumorales. Luego, se aplicó diaminobencidina (DAB) para teñir los antígenos diana. La señal marrón se consideró tinción positiva. Puntuación de la intensidad de la tinción (ausente=0, débil=1, moderada=2 y fuerte=3) puntuación multiplicada del porcentaje positivo (sin tinción=0, células teñidas menos del 25 %=1, entre el 25 % y el 50 % de células teñidas=2, entre el 50 % y el 75 % de células teñidas=3 y más del 75 % de células teñidas=4) puntuación IHC final de las muestras. Las puntuaciones de BCAT2/CD8/PD-L1 inferiores a seis puntos se clasificaron como de baja expresión, las puntuaciones de ellos mayores o iguales a seis puntos se clasificaron como de alta expresión. Para juzgar el estado de un individuo en MMR, todas las muestras de la cohorte de inmunoterapia BLCA de Xiangya se evaluaron en función de los resultados de la tinción de cuatro genes marcadores de MMR (MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2). Como se muestra en estudios anteriores,[56] cuando los cuatro genes marcadores tenían tinción positiva, el individuo se marcaba como MMR. Cuando cualquiera de los cuatro genes marcadores tenía tinción negativa, el individuo se marcaba como dMMR. Se invitó a dos patólogos independientes a realizar la evaluación. Los anticuerpos incluyen: anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, EE. UU.), anti-CD8 (Cat: ab4055, Abcam, EE. UU.), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, EE. UU.), anti-MLH1 (Cat: A4858, Abcolonal, China), anti-MSH2 (Cat: A22177, Abcolonal, China), anti-MSH6 (Cat: A16381, Abcolonal, China), anti-PMS2 (Cat: A4577, Abcolonal, China) y HRP Goat Anti -IgG de conejo/ratón (ZSGB-BIO, China). Análisis panorámicos de interacción espacial en TME de TissueFAXS: para evaluar la interacción espacial de células malignas BCAT2+ y células T efectoras, se utilizó la plataforma panorámica TissueFAXS (Tissue Gnostics, Austria) para escanear y analizar semiautomáticamente células objetivas teñidas con IF multicolor en TMA de la cohorte Xiangya BLCA. La TMA estaba constituida por biopsias centrales de 1,5 mm de muestras de tejidos tumorales incluidas en parafina. En detalle, las células BCAT2+, las células malignas y las células CD8+T se tiñeron con anticuerpos primarios y secundarios específicos. Se utilizó DAPI (Invitrogen, EE. UU.) para teñir el núcleo celular. Los pasos detallados se describen en el estudio de Makarevic et al.[57] En resumen, de acuerdo con las intensidades de fluorescencia de diferentes indicadores y las propiedades físicas de las células, se marcaron y cuantificaron las células positivas. Más importante aún, las distribuciones espaciales de las células CD8+T alrededor de las células BCAT2+CK19+ se representaron mediante diagramas de dispersión sobre la base de la distancia espacial (0–25, 25–50, 50– 100 y 100–150 µm). Se invitó a dos patólogos experimentados a comprobar el resultado de la decisión de la plataforma panorámica TissueFAXS. Experimentos con animales: Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6 (6–7 semanas) del Departamento de Animales de Laboratorio de la Universidad Central Sur. Todas las operaciones en ratones fueron verificadas y aprobadas por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Hospital Xiangya, Universidad Central Sur (Número de artículo: 2021101175). Sobre todo, para investigar el papel de BCAT2 en el crecimiento tumoral in vivo, se inyectaron por vía subcutánea células BCAT2 KD MB49 (5 × 105) y sus células de control en 100 μl de volumen medio en el flanco derecho de los ratones. Además, después de construir con éxito un modelo de tumor subcutáneo (volumen tumoral de hasta 100 mm3), se utilizaron 100 ug de PD-1 anti-ratón InVivomAb (Cat: BE0146, Bioxcell, EE. UU.) y control de isotipo IgG2a (Cat: BE0089, Bioxcell, USA) se inyectaron por vía intraperitoneal en cada ratón, para evaluar el efecto sinérgico de la pérdida de BCAT2 y la terapia anti-PD-1. La terapia anti-PD-1 se implementó en ratones cada 3 días y duró hasta cinco ciclos. Además, para juzgar si el efecto cooperativo del cotratamiento dependía de las células T CD8+. Junto con la terapia combinada, se emplearon 100 ug de CD8 anti-ratón InVivoPlus (Cat: BP0117, Bioxcell, EE. UU.) y control de isotipo IgG2b (Cat: BP0090, Bioxcell, EE. UU.) para agotar las células T CD8+ en ratones. El peso corporal de los ratones se registró cada tres días. En la fecha programada, los tumores se recolectaron, midieron y prepararon para análisis de citometría de flujo, tinción IF y qRT-PCR. Para explorar la interacción entre el nivel de expresión de BCAT2 en las células T CD8+ y la actividad de las células T CD8+, se analizaron bazos de ratones hembra C57BL/6 (6 a 7 semanas) sin tumores. disociado y preparado para suspensión unicelular para su posterior análisis. Análisis de citometría de flujo: los tumores murinos se trituraron y se digirieron en una suspensión unicelular mediante colagenasa IV (Cat: C5138, Sigma, EE. UU.), hialuronidasa (Cat: H3506, Sigma, EE. UU.) y DNasa I (Cat: DN25, Sigma, EE. UU.). ). Se utilizaron filtros de células de 70 μm (BIOFIL, China) para filtrar las impurezas y se empleó un contador de células (Countstar, China) para obtener (3–5) × 106 células en cada muestra. Después de identificar células vivas utilizando el kit de viabilidad reparable Zombie Aqua (Cat: 423101, Biolegend, EE. UU.) y bloquear el receptor Fc con anticuerpo anti-ratón CD16/32 (Cat: 156603, Biolegend, EE. UU.), los antígenos de membrana celular se tiñeron con APC-Cy7 CD45 anti-ratón (Cat: 103116, Biolegend, EE. UU.), CD3 anti-ratón BV421 (Cat: 100341, Biolegend, EE. UU.), CD8a anti-ratón BV605 (Cat: 100744, Biolegend, EE. UU.) y anti-ratón PerCPCy5.5 CD4 (Cat: 100540, Biolegend, EE. UU.). Luego, se utilizó el conjunto de tampones de tinción del factor de transcripción/Foxp3 de bioscience (Cat: 2400632, Invitrogen, EE. UU.) para fijar y permeabilizar la membrana celular y el núcleo. Los antígenos relacionados con el efecto citotóxico se tiñeron con PE antihumano/ratón Granzyme B (Cat: 372208, Biolegend, EE. UU.), PE-Cy7 anti-ratón TNF-𝛼 (Cat: 506324, Biolegend, EE. UU.), PE-Dazzle 594 anti- IFN-𝛾 de ratón (Cat: 505846, Biolegend, EE. UU.), Perforina anti-ratón APC (Cat: 154304, Biolegend, EE. UU.). La estrategia de activación del análisis de citometría de flujo se muestra en la Figura S29 (Información de respaldo). Se incubó BCAT2 antihumano/de ratón (Cat: A7426, Abclonal, China) con el kit de etiquetado de anticuerpos Flexible 488 (Cat: KFA001, Proteintech, EE. UU.) para sintetizar el anticuerpo fluorescente BCAT2 personalizado para el análisis de citometría de flujo. Luego, el anticuerpo BCAT2 y los anticuerpos relacionados con las células T se mezclaron y agregaron a una suspensión unicelular de bazo murino para explorar la interacción entre el nivel de expresión de BCAT2 en las células T CD8+ y la actividad de CD{{357} }Célula T. La estrategia de activación del análisis de citometría de flujo se muestra en la Figura S30 (Información de respaldo). Las muestras teñidas se detectaron en citometría de flujo Cytek DxpAthena (Cytek Biosciences, EE. UU.) y los datos se analizaron con el software de la versión Flowjo (BD Biosciences, EE. UU.). Análisis estadístico: Los datos se presentaron como media ± DE. Se utilizó la prueba t con o sin corrección de Welch para comparar variables continuas entre dos grupos. Se utilizó el análisis ANOVA unidireccional con o sin las pruebas de Brown-Forsythe y Welch para comparar variables continuas entre múltiples grupos. Se aplicó la prueba de chi cuadrado o la prueba exacta de Fisher para comparar variables dicotómicas. Se empleó la prueba de coeficientes de correlación de Pearson o Spearman para estimar la intensidad de la correlación entre diferentes variables. Se empleó la curva de supervivencia de Kaplan-Meier para mostrar análisis de pronóstico de variables dicotómicas y se utilizó la prueba de rangos logarítmicos para juzgar las diferencias estadísticas. Se definió como umbral de significación una p < 0,05 bilateral. Se aplicaron el software R (versión 4.0) y GraphPad Prism8 para procesar los datos en el estudio.

Referencia

[1] RL Siegel, KD Miller, HE Fuchs, A. Jemal, CA: Cancer J. Clin. 2021, 71, 7.

[2] VG Patel, WK Oh, MD Galsky, Ca-Cancer J. Clin. 2020, 70, 404.

[3] R. Nadal, J. Bellmunt, Tratamiento del cáncer. Rev. 2019, 76, 10.

[4] a) MD Galsky, A. Arija JÁ, A. Bamias, ID Davis, M. De Santis, E. Kikuchi, X. García-Del-Muro, U. De Giorgi, M. Mencinger, K. Izumi, S. Panni, M. Gumus, M. Özgüro˘glu, AR Kalebasty, SH Park, B. Alekseev, FA Schutz, JR Li, D. Ye, NJ Vogelzang, S. Bernhard, D. Tayama, S. Mariathasan, A Mecke, A. Thåström, E. Grande, Lancet 2020, 395, 1547; b) MD Galsky, A. Mortazavi, MI Milowsky, S. George, S. Gupta, MT Fleming, LH Dang, DM Geynisman, R. Walling, RS Alter, M. Kassar, J. Wang, S. Gupta, N. Davis, J. Picus, G. Philips, DI Quinn, GK Haines 3.º, NM Hahn, Q. Zhao, M. Yu, SK Pal, J. Clin. Oncol. 2020, 38, 1797; c) T. Powles, SH Park, E. Voog, C. Caserta, BP Valderrama, H. Gurney, H. Kalofonos, S. Radulovi´c, W. Demey, A. Ullén, Y. Loriot, SS Sridhar, N Tsuchiya, E. Kopyltsov, CN Sternberg, J. Bellmunt, JB Aragon-Ching, DP Petrylak, R. Laliberte, J. Wang, B. Huang, C. Davis, C. Fowst, N. Costa, JA Blake-Haskins , A. di Pietro, P. Grivas, N. Engl. J. Med. 2020, 383, 1218.

[5] a) RW Jenkins, DA Barbie, KT Flaherty, Hno. J. Cáncer 2018, 118, 9; b) AJ Schoenfeld, MD Hellmann, Cancer Cell 2020, 37, 443.

[6] a) DS Chen, I. Mellman, Nature 2017, 541, 321; b) TF Gajewski, L. Corrales, J. Williams, B. Horton, A. Sivan, S. Spranger, Adv. Exp. Medicina. Biol. 2017, 1036, 19; c) DC Hinshaw, LA Shevde, Cancer Res. 2019, 79, 4557.

[7] a) SM Vareki, J. Immunother. Cáncer 2018, 6, 157; b) B. Zhang, Q. Wu, B. Li, D. Wang, L. Wang, YL Zhou, Mol. Cáncer 2020, 19, 53.

[8] JR Mayers, ME Torrence, LV Danai, T. Papagiannakopoulos, SM Davidson, MR Bauer, AN Lau, BW Ji, PD Dixit, AM Hosios, A. Muir, CR Chin, E. Freinkman, T. Jacks, BM Wolpin, D. Vitkup, MG Vander Heiden, Ciencia 2016, 353, 1161.

[9] JT Li, M. Yin, D. Wang, J. Wang, MZ Lei, Y. Zhang, Y. Liu, L. Zhang, SW Zou, LP Hu, ZG Zhang, YP Wang, WY Wen, HJ Lu , ZJ Chen, D. Su, QY Lei, Nat. Biol celular. 2020, 22, 167.

[10] JH Lee, YR Cho, JH Kim, J. Kim, HY Nam, SW Kim, J. Son, Exp. Mol. Medicina. 2019, 51, 146.

[11] a) H. Lai, X. Cheng, Q. Liu, W. Luo, M. Liu, M. Zhang, J. Miao, Z. Ji, GN Lin, W. Song, L. Zhang, J. Bo, G. Yang, J. Wang, WQ Gao, Int. J. Cáncer 2021, 149, 2099; b) D. Lambrechts, E. Wauters, B. Boeckx, S. Aibar, D. Nittner, O. Burton, A. Bassez, H. Decaluwé, A. Pircher, K. Van den Eynde, B. Weynand, E. Verbeken, P. De Leyn, A. Liston, J. Vansteenkiste, P. Carmeliet, S. Aerts, B. Thienpont, Nat. Medicina. 2018, 24, 1277.

[12] N. Nagarsheth, MS Wicha, W. Zou, Nat. Rev. Immunol. 2017, 17, 559.

[13] a) E. Stelloo, AML Jansen, EM Osse, RA Nout, CL Creutzberg, D. Ruano, DN Church, H. Morreau, V. Smit, T. van Wezel, T. Bosse, Ann. Oncol. 2017, 28, 96; b) AS Tjalsma, A. Wagner, WNM Din jens, PC Ewing-Graham, LSM Alcalá, MER de Groot, KE Hamoen, AC van Hof, W. Hofhuis, LN Hofman, KJ Hoogduin, J. Kaijser, ACF Makkus, SJJ Mol, GM Plaisier, K. Schelfhout, HPM Smedts, RA Smit, PJ Timmers, P. Vencken, B. Visschers, AAM van der Wurff, HC van Doorn, Gynecol. Oncol. 2021, 160, 771.