Los complejos de manganeso (II) estimulan la inmunidad antitumoral agravando el daño del ADN y activando la vía CGAS-STING

La activación de la vía estimuladora de la GMP-AMP sintasa cíclica del gen del interferón (cGAS-STING) es una estrategia inmunoterapéutica prometedora para el tratamiento del cáncer. Se descubrió que los complejos de manganeso (II) MnPC y MnPVA (P=1,10-fenantrolina, C=cloro y VA=ácido valproico) activan la vía cGAS-STING. . Los complejos no solo dañaron el ADN, sino que también inhibieron las histonas desacetilasas (HDAC) y la poliadenosina difosfato-ribosa polimerasa (PARP) para impedir la reparación del daño del ADN, promoviendo así la fuga de fragmentos de ADN al citoplasma. Los fragmentos de ADN activaron la vía cGAS-STING, que inició una respuesta inmune innata y una comunicación bidireccional entre las células tumorales y las células inmunes vecinas. El cGAS-STING activado aumentó aún más la producción de interferones tipo I y la secreción de citoquinas proinflamatorias (TNF-a e IL-6), impulsando la infiltración tumoral de células dendríticas y macrófagos, además de estimular las células T citotóxicas. para matar células cancerosas in vitro e in vivo. Debido a la mayor capacidad de dañar el ADN, MnPC y MnPVA mostraron una inmunocompetencia y actividad antitumoral más potentes que los iones Mn2+, lo que demuestra un gran potencial como agentes quimioinmunoterapéuticos para el tratamiento del cáncer.

Beneficios de la cistanche tubulosa-Antitumoral

Introducción

La recurrencia, la metástasis y la resistencia a los medicamentos de los tumores plantean grandes desafíos para los fármacos antitumorales convencionales.1 La inmunoterapia es una estrategia eficaz para erradicar las células tumorales aprovechando o estimulando el sistema inmunológico de los pacientes.2,3 En la última década, se han utilizado múltiples inmunoterapias contra el cáncer, incluidas En la práctica clínica se aplicaron inhibidores de puntos de control inmunitarios, virus oncolíticos y células T receptoras de antígenos quiméricos (CAR-T) para mejorar la inmunidad antitumoral adaptativa. Los objetivos antigénicos con frecuencia socavan la eficacia de la inmunoterapia.7,8 La inmunidad antitumoral adaptativa depende en gran medida de una inmunidad innata sólida.8 Además de moldear y mantener la inmunidad antitumoral adaptativa, el sistema inmunológico innato, como barrera de apoyo para defender las células huésped, asume la responsabilidad clave de la reconocimiento de las células tumorales.9 Desafortunadamente, durante la progresión del tumor, las células malignas a menudo evaden la vigilancia inmune y eventualmente se convierten en tumores "fríos".10,11 Por lo tanto, activar la inmunidad innata y facilitar su interacción con la inmunidad antitumoral adaptativa puede reforzar el sistema inmunológico. respuestas a los tumores y mejorar el efecto terapéutico de la inmunoterapia. Los estimuladores cíclicos de la GMP-AMP sintasa de los genes del interferón (cGAS-STING) constituyen los componentes vitales de la inmunidad innata, que se han convertido en objetivos prometedores para la inmunoterapia contra el cáncer.12,13 La activación de la vía cGAS-STING desencadena una serie de reacciones posteriores eventos de señalización, incluida la estimulación y el reclutamiento de la quinasa 1 de unión a TANK (TBK1) y el factor regulador de interferón 3 (IRF3), que inducen la liberación y secreción de interferones tipo I (IFN-I) y factores proinflamatorios IL-6 y TNF-a. 13,14 Posteriormente, los IFN promueven la maduración y migración de células dendríticas (DC), mejoran el efecto citotóxico mediado por células asesinas naturales (NK) y realizan cebado cruzado de células T específicas de tumores, orquestando así la inmunidad innata y adaptativa para regular el comportamiento. de tumores agresivos.15,16 En la actualidad, el proceso terapéutico del agonista oral de molécula pequeña MSA-2,17 los dinucleótidos cíclicos (CDN) agonistas naturales,18 y algunos nanosistemas19–23 se han probado en modelos de tumores murinos para intervenir en la vía cGAS-STING. El manganeso (Mn) es un oligoelemento nutricional que desempeña funciones importantes en muchos procesos fisiológicos, incluidas las respuestas inmunitarias antitumorales.24,25 Recientemente, se descubrió que los iones Mn2+ mejoran la sensibilidad de un sensor de ADN de doble cadena (ADNbc). cGAS y desencadenan la producción de un mensajero secundario cGAMP, aumentando así la actividad STING al aumentar la afinidad de unión cGAMP-STING.12,26 Además, los iones Mn2+ inhiben indirectamente la progresión tumoral al promover la función de CD8+ Células T mediante la inducción de la producción de IFN in vivo. 27 Sin embargo, la administración directa de iones Mn2+ in vivo no puede garantizar una concentración efectiva en el microambiente del tumor23 y un exceso de iones Mn2+ puede inducir toxicidades sistémicas, como neurotoxicidad irreversible y toxicidad cardiovascular.28 Los complejos de Mn son más estable e inerte a las biomoléculas debido al efecto protector de los ligandos y, por lo tanto, podría aliviar la toxicidad de los iones Mn2+. Sin embargo, hasta ahora no se ha utilizado ningún complejo de Mn para activar la vía cGAS-STING. Las modificaciones epigenéticas alteran reversiblemente las expresiones genéticas, lo que puede contribuir al inicio y la progresión de los cánceres y a la supresión de la inmunidad antitumoral. La naturaleza reversible de la modificación epigenética permite que las células malignas regresen a un estado normal.29,30 Las histonas desacetilasas (HDAC) median la acetilación de proteínas, la dinámica de la cromatina, el recambio de proteínas y las respuestas al daño del ADN. Los inhibidores de HDAC son una clase de potentes moduladores epigenéticos, con la cromatina como objetivo, que actúan sobre la mayoría o todos los tipos de tumores.31 La inhibición de los HDAC contribuye, al menos en parte, a la acetilación de las histonas, lo que resulta en una alteración de la formación y reparación de la rotura de la doble hebra del ADN ( DSB),32,33, que puede contribuir a abolir la resistencia a los medicamentos en las células cancerosas.34 La estructura relajada de la cromatina inducida por los inhibidores de HDAC puede promover que los agentes quimioterapéuticos accedan al ADN más fácilmente, agravando así el daño al ADN,35 lo cual es beneficioso para la activación de la vía cGAS STING. Algunos inhibidores de HDAC, como el ácido valproico (VA), afectan a las HDAC de clase I y II (HDAC1/2), que sensibilizan las células cancerosas a las terapias que dañan el ADN.36

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Las poliadenosina difosfato-ribosa polimerasas (PARP) son proteínas esenciales implicadas en la resistencia del cáncer a las quimioterapias. Estas enzimas son cruciales para la reparación de roturas monocatenarias (SSB) del ADN37 y participan en múltiples procesos celulares, como la apoptosis, la respuesta inmune, la transcripción genética y la inflamación.38–40 Los inhibidores de PARP previenen la reparación de las lesiones del ADN. lo que lleva al enriquecimiento del ADN citosólico, que es reconocido por cGAS para activar la vía cGAS-STING.41,42 Se ha descubierto que una serie de complejos metálicos anticancerígenos, incluidos los de platino, rutenio y oro, inhiben la actividad de PARP.43, 44 En este documento informamos las propiedades inmunoestimulantes y antitumorales de dos complejos MnII, MnPC y MnPVA. Las estructuras químicas y cristalinas de los complejos se muestran en la Fig. 1. En estos complejos, la 1,{12}}fenantrolina (P) es un intercalador de ADN no tóxico y el VA es un inhibidor de las HADC.31 El VA podría promover la acetilación de proteínas histonas conjugadas con ADN, mejoran la accesibilidad del ADN dentro de la cromatina relajada y reactivan genes supresores de tumores latentes.33,35 Suponemos que la incorporación de 1,10-fenantrolina y/o VA en MnPC o MnPVA puede otorgar los complejos con actividad antiproliferativa al inducir daño en el ADN y estimular la inmunidad antitumoral. Una serie de experimentos demostraron que MnPC y MnPVA dañaban eficazmente el ADN, activaban la vía cGAS-STING en células tumorales e inmunitarias y aumentaban la secreción de IFN y citoquinas proinflamatorias. En particular, MnPVA inhibió la actividad de HDAC1/2 y PARP1, activando así la vía cGAS-STING de forma más eficaz que MnPC. Todos los resultados fueron confirmados tanto in vitro como in vivo. Hasta donde sabemos, MnPC y MnPVA son los complejos MnII multifuncionales más destacados que suprimen las células tumorales principalmente mediante la activación de la inmunidad antitumoral a través de la vía cGAS-STING iniciada por daño en el ADN.

Fig. 1 Estructuras químicas y cristalinas de MnPC y MnPVA. Los átomos de hidrógeno se omiten para mayor claridad.

Resultados y discusión

Propiedades químicas y físicas.

MnPC y MnPVA se prepararon de acuerdo con los métodos de la literatura45,46 y se caracterizaron completamente mediante análisis elemental, espectroscopia IR (Fig. S1†), resonancia paramagnética electrónica (Fig. S2,† EPR) y cristalografía de rayos X. Los parámetros de la estructura cristalina y las longitudes y ángulos de enlace seleccionados se presentan en las Tablas S1 y S2 (consulte el ESI†). El átomo de Mn en estos complejos exhibía una geometría octaédrica distorsionada con un número de coordenadas de 6. MnPC cristalizó en el sistema cristalino monoclínico con el grupo espacial P21/c; MnII formó cuatro enlaces Mn-N con dos ligandos bidentados 1,{{10}}fenantrolina y dos enlaces Mn-Cl. Las longitudes de los enlaces Mn-N varían entre 2,281 y 2,369 Å, es decir, la longitud de los enlaces de Mn-N1, Mn-N2, Mn-N3 y Mn-N4 es 2,369(4), 2,281(3), 2,341(3). ), y 2,287(3) Å, respectivamente, y el ángulo de N1–Mn–N2, N1–Mn–N4 y N2–Mn–N3 es 71,15(11) grados, 97.86(11) grado y 89.00(11) grado, respectivamente. Esta estructura es algo diferente de la reportada por Abbas et al., 45 donde MnPC cristalizó en el sistema cristalino triclínico con el grupo espacial P1. Por consiguiente, en estos casos difieren las correspondientes longitudes de unión y los ángulos. De manera similar a una estructura reportada, 46 MnPVA cristalizó en el sistema cristalino monoclínico con el grupo espacial C2/c, que tiene un conjunto donador de N2O4. MnII se coordinó con dos átomos de N de 1,10-fenantrolina y cuatro átomos de O de una molécula de agua y dos ligandos VA, respectivamente. Uno de los VA reaccionó como un ligando monodentado, mientras que el otro era un ligando bidentado. La longitud del enlace de Mn–N1 y Mn–N2 es 2,265(19) y 2,298(2) Å, respectivamente, y la de Mn–O1, Mn–O2, Mn–O3 y Mn–O5 es 2,2476(19). 2,260 (2), 2,0639 (18) y 2,1471 (17) Å, respectivamente. Como ligando quelante de N, N fuerte, la 1,10-fenantrolina estabiliza los complejos de Mn contra la desmetalación. La estabilidad de MnPC y MnPVA en solución salina tamponada con fosfato (PBS, con DMSO al 0,5% v/v, pH 7,4 y 37 grados) y medios de cultivo celular (que contienen FBS al 10%) se investigó mediante espectroscopia visible UV (Fig. S3† ). Los espectros UV dependientes del tiempo demuestran que estos complejos son estables en 72 h.

Tabla 1 Valores de IC50 (mM) de MnPC y MnPVA frente a diferentes líneas celulares a las 72 h, con MnCl2, VA, CDDP y P como referencias. Los datos se muestran como media ± desviación estándar (DE, n=3)

Actividad antiproliferativa

Las actividades antiproliferativas de los compuestos contra el cáncer de mama humano triple negativo (MDA-MB-231), el cáncer de páncreas humano (PANC-1), el cáncer hepatocelular humano (HepG2), el cáncer de mama de ratón (4T1) Las líneas celulares y la línea celular epitelial tubular renal normal humana (HK-2) se evaluaron mediante el ensayo MTT. Se utilizaron MnCl2, VA, cisplatino (CDDP) y 1,10-fenantrolina (P) como compuestos de referencia. Las concentraciones inhibidoras medio máximas (CI50) a las 72 h se enumeran en la Tabla 1. MnPC y MnPVA mostraron una potente actividad antiproliferativa hacia todas las líneas celulares cancerosas analizadas, particularmente hacia MDA-MB-231 y PANC-1 células que son insensibles al CDDP y que muestran aproximadamente 8- y 11-veces mayor actividad, respectivamente. La actividad antiproliferativa de MnPC y MnPVA contra HepG2 y 4T1 es similar a la del CDDP. Curiosamente, tanto MnPC como MnPVA mostraron una menor toxicidad hacia las células HK-2, siendo los valores de IC50 ligeramente superiores a los del CDDP. Por el contrario, MnCl2, VA y P casi no fueron tóxicos en estas líneas celulares, lo que concuerda con la literatura.13,36 De acuerdo con estos resultados, las siguientes investigaciones se centraron en la acción de MnPC y MnPVA sobre la línea MDA-MB. -231 celdas.

Captación celular y daño al ADN.

La acumulación de los complejos en células MDA-MB-231 en términos de Mn se midió mediante incubación conjunta con ICP-MS durante 24 h. Como se muestra en la Fig. 2A, la acumulación sigue un orden de MnPVA > MnPC > MnCl2, manteniéndose en línea con su actividad antiproliferativa. Además, determinamos el Mn unido al ADN en células MDA-MB-231 mediante ICP-MS. Como se muestra en la Fig. 2B, MnPC y MnPVA exhibieron una mayor capacidad de unión al ADN que MnCl2, posiblemente debido a su mayor absorción celular. La histona fosforilada g-H2AX es un marcador sensible de roturas de doble cadena de ADN (DSB).47 Para evaluar el daño en el ADN inducido por los complejos de Mn, detectamos la expresión de gH2AX mediante inmunotransferencia. Como se muestra en la Fig. 2C, MnPC y MnPVA aumentaron la expresión de g-H2AX en células MDA-MB-231 a las 24 h. Se sabe que los complejos metálicos de P son intercaladores eficaces del ADN;48,49 sin embargo, el P por sí solo apenas causó daño al ADN (Fig. S4†). La expresión de g-H2AX en tejidos tumorales de ratones portadores de tumores 4T1 también se investigó mediante inmunodetección y tratamiento con ER con cada compuesto (1,3 mg de Mn por kg) una vez cada 2 días durante 16 días. MnPC y MnPVA dañaron eficazmente el ADN en el tejido tumoral, mientras que MnCl2 y PBS apenas afectaron a g-H2AX (Fig. S5†). El ADNds liberado de las células MDA-MB- 231 al sobrenadante del medio de cultivo se determinó usando un kit ELISA después del tratamiento con los complejos de Mn. Como se presenta en la Fig. 2D, el contenido de ADNbc en el medio de cultivo celular tratado con MnPC o MnPVA fue evidentemente mayor que el de otros grupos. Los resultados sugieren que MnPC y MnPVA pueden elevar la inestabilidad del ADN genómico y el nivel de ADN citosólico. La naturaleza del daño en el ADN se estudió por primera vez midiendo los cambios de fluorescencia de un sistema de ADN-bromuro de etidio (EB) de timo de ternera. EB es un intercalador que proporciona un aumento significativo en la fluorescencia cuando se une al ADN, mientras que la fluorescencia disminuye cuando se desplaza.50 MnPC y MnPVA redujeron moderadamente la intensidad de la fluorescencia (Fig. S6†), lo que sugiere que estos complejos podrían intercalarse en los surcos del ADN para reemplazar el EB unido debido a la estructura plana de P. Sin embargo, la interacción no es una unión covalente robusta. Algunos complejos de Mn podrían generar especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares e inducir estrés oxidativo,51 y por lo tanto detectamos las ROS en células MDA-MB-231 mediante imágenes confocales utilizando diacetato de 2′,7′-dicloro-fluoresceína ( DCFH-DA) como sonda de fluorescencia de ROS después de la exposición al complejo de Mn durante 18 h. Como se muestra en la Fig. 3, MnPC y MnPVA intensificaron la fluorescencia de ROS intracelular en comparación con el control o MnCl2, especialmente MnPVA, lo que sugiere que pueden causar daño oxidativo al ADN celular. El daño al ADN no sólo contribuye a la acción asesina de las células cancerosas sino que también estimula la inmunidad antitumoral activando la vía cGAS-STING.14,52

Fig. 2 Captación celular (A) y Mn unido al ADN (B) determinados mediante ICPMS, expresión del marcador de daño del ADN g-H2AX determinada mediante transferencia Western (C) y ADNds extracelular determinado utilizando el kit ELISA (D) después Las células MDA-MB-231 se trataron con MnCl2, MnPC, MnPVA y VA (6 mM) respectivamente durante 24 h.

Detención del ciclo celular y apoptosis.

La respuesta al daño del ADN celular (DDR) está asociada con la señalización que impulsa la captura del punto de control del ciclo celular.53 El impacto de los complejos de Mn en el ciclo celular de las células MDA-MB-231 se analizó mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 4A, MnPC y MnPVA aumentaron levemente la detención de la fase G1 al tiempo que causaron un colapso completo de la fase G2 en comparación con el control y MnCl2. Los resultados indican que el daño al ADN inducido por MnPC y MnPVA bloqueó seriamente la etapa posterior de la síntesis de ADN. Por tanto, el mecanismo antiproliferativo de MnPC y MnPVA difiere del de MnCl2. El modo de muerte de las células MDA-MB-231 se investigó mediante citometría de flujo después del tratamiento con los complejos durante 72 h y tinción con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI). Como se muestra en las Fig. 4B y S7,† en comparación con el control y MnCl2, la tasa de apoptosis (temprana + tardía) inducida por MnPC y MnPVA alcanzó el 84,0% y el 87,4% respectivamente. Los resultados indican que MnPC y MnPVA tienen una fuerte capacidad proapoptótica, que se correlaciona estrechamente con su actividad antitumoral.

Beneficios del suplemento cistanche: aumentar la inmunidad.

Potencial de membrana mitocondrial

Las mitocondrias son participantes centrales en la inmunidad innata, y el ADN mitocondrial (ADNmt) se reconoce como un agonista del sistema inmunológico innato.54 Se informó que tanto el ADN citosólico como el ADNmt se unían a receptores de reconocimiento de patrones y activaban la vía de señalización cGAS-STING. 55 Para explorar la posible liberación de ADNmt de las mitocondrias en presencia de MnPC y MnPVA, verificamos la integridad de la membrana mitocondrial mediante imágenes confocales usando JC-1 como sonda fluorescente, que forma agregados y muestra fluorescencia roja en mitocondrias normales con un DJm alto, mientras que existe como monómero y emite fluorescencia verde en las dañadas con DJm bajo. 56 Como se muestra en la Fig. 5, MnPC y MnPVA redujeron en gran medida la intensidad de la fluorescencia roja en células MDA-MB-231 teñidas con JC-1. La relación de fluorescencia "verde (G) a rojo (R)" para las células tratadas con MnPC y MnPVA es 4,91 y 5,66, respectivamente, significativamente mayor que la de las células de control (2,35) y tratadas con MnCl2- ( 1,75). Las observaciones sugieren que MnPC y MnPVA dañaron la integridad de la membrana mitocondrial, lo que puede facilitar la fuga de ADNmt al citosol para desencadenar la vía cCAS-STING.

Fig. 3 Imágenes confocales de fluorescencia de ROS generadas por los complejos de Mn (12 mM) en células MDA-MB-231 después de la incubación durante 18 h y la tinción con DCFH-DA (10 mM) durante 30 min.

Fig. 4 Detención del ciclo celular de células MDA-MB-231 tras incubación con diferentes compuestos (6 mM) durante 24 h (A), y análisis apoptótico de células MDA-MB-231 mediante citometría de flujo tras incubación con diferentes compuestos (6 mM) durante 72 h (B).

Actividad y expresión de HDAC.

Los inhibidores de HDAC sensibilizan las células cancerosas a las terapias que dañan el ADN al alterar la estructura de la cromatina e impedir la reparación del ADN.33,35 Como inhibidor de HDAC de clase I, VA se dirige selectivamente a las enzimas HDAC1 y HDAC2, modulando la señalización del daño del ADN para destruir la estabilidad genómica e inhibir el tumor. proliferación in vivo. 31 La incorporación de VA en MnPVA puede reforzar la inhibición de HDAC y la inducción de DDR de manera más eficiente. Por lo tanto, determinamos el efecto de los complejos de Mn sobre la actividad HDAC total en células MDA-MB-231 después de la coincubación durante 48 h. Como se muestra en la Fig. 6A, MnPVA inhibió significativamente la actividad HDAC total, siendo la actividad inhibidora aproximadamente 1,5 veces mayor que la de VA. Además, estudiamos la expresión de las proteínas HDAC1/2 en células MDA-MB-231 mediante inmunotransferencia. Como se muestra en las figuras 6B y C, MnPVA obviamente reguló negativamente la expresión de HDAC1 y HDAC2 en comparación con el control. Aunque MnPC inhibió la actividad de HDAC, apenas influyó en la expresión de las proteínas HDAC1/2. Inesperadamente, VA como inhibidor conocido de HDAC no mostró una inhibición obvia en HADC1/2 a esta concentración (6 mM), destacando así el papel esencial de la coordinación de Mn en la intensificación de la inhibición de VA en HADC. Los resultados indican que MnPVA es un inhibidor eficaz de HDAC1/2, que promovería DDR y desencadenaría la vía cGAS-STING, estimulando así la inmunidad antitumoral. Además, detectamos la expresión de HDAC en tejidos tumorales de ratones con tumores 4T1 mediante inmunofluorescencia después del tratamiento con cada compuesto. Como se muestra en la Fig. 6D, MnPVA evidentemente disminuyó la expresión de HDAC1, mientras que MnPC y MnCl2 solo afectaron leve o apenas a HDAC1.

Beneficios de la cistanche tubulosa-Antitumoral

Expresión de PARP1 y proteínas apoptóticas.

Los PARP desempeñan un papel clave en la reparación de lesiones del ADN. Los inhibidores de PARP impiden la reparación del ADN, lo que conduce a la exportación de fragmentos de ADN al citosol, lo que desencadena una respuesta inmune innata mediada por cGAS.42 Como proteína sensora de las roturas de las cadenas de ADN, PARP1 se localiza en los sitios de daño del ADN y domina la reparación de ADN, convirtiéndose así en un objetivo importante para la terapia contra el cáncer. La activación de las caspasas, especialmente la caspasa-3, podría iniciar la apoptosis mediante la escisión de PARP1, que se considera un sello distintivo de la apoptosis.38,57 Por lo tanto, las expresiones de caspasa-3, PARP1 y PARP1 escindida en Las células MDA-MB-231 se examinaron mediante transferencia Western. Como se muestra en la Fig. 7, MnPC y MnPVA aumentaron notablemente la expresión de caspasa -3 y escindieron PARP1 en comparación con el control y otros compuestos. La escisión de PARP1 por la caspasa activada-3 separaría el dominio de unión al ADN del dominio catalítico, evitando así la activación de PARP y la reparación de las lesiones del ADN. Además, la inhibición de PARP1 puede aumentar el nivel de linfocitos T infiltrantes de tumores y regular las respuestas inmunes innatas. La disfunción de la reparación del ADN tiene el potencial de iniciar aberraciones globales del ADN, que podrían desencadenar la apoptosis. Las proteínas proapoptóticas Bax y antiapoptóticas Bcl-xL desempeñan papeles fundamentales en la apoptosis. Por lo tanto, detectamos su expresión en células MDAMB-231 después del tratamiento con diferentes compuestos durante 48 h mediante transferencia Western. MnPC y MnPVA aumentaron notablemente la expresión de Bax y regularon negativamente la expresión de Bcl-xL. Los resultados indican que MnPC y MnPVA podrían promover la apoptosis mediante la regulación de proteínas apoptóticas como un efecto de cascada relacionado con PARP1-. Aunque VA puede inducir la apoptosis de las células tumorales al inhibir la expresión de HDAC1/2 en dosis altas,58 no afectó significativamente a estas proteínas apoptóticas en esta condición, lo que significa la superioridad de los complejos de Mn.

Fig. 5 Imágenes de fluorescencia de células MDA-MB-231 después de la incubación con MnCl2, MnPC y MnPVA (6 mM) respectivamente durante 36 h y tinción con la sonda fluorescente JC-1.

Activación de la vía cGAS-STING.

Se sabe que el inhibidor de PARP1 puede provocar una respuesta en cascada de señalización cGAS-STING en células cancerosas.40,59 cGAS es un sensor inmunológico innato que reconoce una amplia gama de ADNbc citosólico, incluido ADN con micronúcleos virales, apoptóticos, exosomales, mitocondriales y orígenes de retroelementos.60,61 El enriquecimiento del ADN citosólico inducido por MnPC y MnPVA creó una circunstancia favorable para la activación de la vía cGAS-STING, que posteriormente iniciaría eventos de señalización posteriores a través del reclutamiento y activación de TBK1 e IRF3.12,59 Por lo tanto, detectamos la expresión de estas proteínas en células MDA-MB-231 mediante inmunotransferencia después de la exposición a cada compuesto durante 24 h. Como se muestra en la Fig. 8A, MnPC y MnPVA elevaron significativamente la expresión de cGAS, p-STING, p-TBK1 y p-IRF3. Además, investigamos el efecto de los complejos en la vía cGAS-STING en células THP-1 de leucemia monocítica humana mediante inmunotransferencia. Como se muestra en la Fig. 8B, MnPC y MnPVA indujeron una regulación positiva significativa de cGAS, p-STING, p-TBK1 y p-IRF3, especialmente MnPVA, lo que manifiesta que activaron la vía cGAS-STING, que iniciaría la inmunidad innata para bloquear. escape del tumor y estimula la inmunidad adaptativa, sin dañar las células THP-1 (Tabla S3†). Por el contrario, MnCl2 solo aumentó el nivel de p-STING o p-TBK1 y apenas afectó la expresión de cGAS y p-IRF3 en comparación con el control, lo que puede deberse a su incapacidad para inducir daño en el ADN y escisión de PARP1 en bajas concentraciones. y, por lo tanto, no puede desencadenar eventos de señalización posteriores, como la activación de p-IRF3. Con base en estos resultados, llegamos a la conclusión de que MnPC y MnPVA indujeron daño en el ADN nuclear y mitocondrial dentro de las células tumorales y liberaron fragmentos de ADN al citoplasma, que luego activó la vía cGAS-STING. El cGAS-STING activado podría activar directamente las vías de señalización de senescencia y apoptosis en las células cancerosas,62 lo que lleva a una respuesta inmune antitumoral bidireccional. Sin embargo, la expresión de STING, TBK1 e IRF-3 en células MDA-MB-231 y THP-1 apenas se vio afectada (Fig. S8†).

Fig. 6 (A) actividad de HDAC, (B) expresión de proteínas HDAC1/2 y (C) el contenido de proteína correspondiente en relación con GAPDH en células MDA-MB-231 después de la incubación con cada compuesto (6 mM) durante 48 h determinadas mediante el uso del kit ELISA y Western Blot respectivamente; (D) imágenes de inmunofluorescencia de la expresión de HDAC1 en el tejido tumoral 4T1 de un ratón después del tratamiento con cada compuesto (1,3 mg de Mn por kg) una vez cada 2 días durante 16 días. *p < 0.05, **p < 0.01 y ***p < 0,001.

Interferones y citocinas proinflamatorias.

La activación de TBK1 e IRF3 podría inducir la expresión y secreción de IFN y citocinas proinflamatorias, como IFN-b, TFN-a e IL-6.59,63 Así, el IFN-I extracelular liberado por THP{ {8}} y el IFN-b, TNF-a e IL-6 liberados por las células MDAMB-231 se midieron mediante ensayo ELISA después de la incubación con diferentes compuestos durante 24 h. Como se muestra en la Fig. 9, MnPC y MnPVA mejoraron drásticamente la secreción de IFN-I en relación con el control, MnCl2 y VA. Al mismo tiempo, también desencadenaron la secreción de IFN-b y TNF-a. Sin embargo, el nivel de IL-6 solo aumentó moderadamente. El IFN-I (IFN-a e IFN-b) desempeña múltiples funciones inmunoestimuladoras en la inmunidad antitumoral, como promover la maduración y la presentación de antígenos de las CD y el cebado cruzado de células T específicas del tumor para destruir las células tumorales uniendo la inmunidad innata y adaptativa.13 TNF -a participa en la necrosis cancerosa aguda mediada por el dinucleótido cíclico (CDN) y en el ajuste del inlado inmunológico.59 Los resultados significan que MnPC y MnPVA podrían estimular respuestas inmunes antitumorales y sugieren que pueden superar la resistencia a los medicamentos de los tumores al un mecanismo quimioinmunoterapéutico.

Maduración de células derivadas de la médula ósea (BMDC)

Las BMDC representan células heterogéneas de origen mieloide que constan de progenitores mieloides y macrófagos, granulocitos y células dendríticas (DC) inmaduros; participan en la respuesta inmunitaria al suprimir la activación de las células T y la activación de los macrófagos asociados a tumores (TAM).64 Como principales células presentadoras de antígenos (APC), las CD funcionan como un puente para la comunicación entre los sistemas inmunológicos innato y adaptativo. 22

Fig. 7 Expresión de proteínas relacionadas con la reparación del ADN y la apoptosis en células MDA-MB-231 después de la exposición a diferentes compuestos (6 mM) durante 48 h, y el contenido de proteína correspondiente en relación con la tubulina a. *p < 0.{{10}}5, **p < 0,01 y ***p < 0,001.

Fig. 8 Expresión de proteínas implicadas en la vía cGAS-STING determinada mediante transferencia Western después de que las células MDA-MB-231 (A) y THP-1 (B) se trataran con 6 y 3 mM de diferentes compuestos. durante 24 h, respectivamente, y el contenido de proteína correspondiente en relación con GAPDH. *p < 0.{{10}}5, **p < 0,01 y ***p < 0,001.

Fig. 9 Secreción de (A) IFN-I en células THP-1, (B) IFN-b, (C) IL-6 y (D) TNF-a en MDA-MB{{ 7}} células después del tratamiento con diferentes compuestos (6 mM) durante 24 h. Los datos se muestran como media ± DE (n {{10}}); *p < 0.05, **p < 0,01 y ***p < 0,001.

Las CD maduras y activadas pueden presentar un antígeno específico a los linfocitos T e iniciar una respuesta adaptativa contra los tumores.65 Para probar si la vía cGAS-STING activada por MnPC y MnPVA podría inducir la maduración de las BMDC, probamos los marcadores de superficie en las BMDC mediante Tratamiento por citometría de flujo con el sobrenadante de células MDA-MB-231 incubadas con diferentes compuestos durante 24 h. Como se muestra en la Fig. 10A, en comparación con el control, MnPC y MnPVA elevaron notablemente la coexpresión de los marcadores de maduración CD86 y CD80, alcanzando 36,62% y 43,15%, respectivamente. Sin embargo, el MnCl2 sólo superó moderadamente al del control. Además, el complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) se expresa constitutivamente mediante APC, que presentan péptidos antigénicos a las células T. Como resultado, se inician, mantienen y regulan respuestas inmunitarias adaptativas.8 Como se muestra en las figuras 10B y C, MnPC y MnPVA aumentaron la expresión de MHC-II a aproximadamente 1,5-veces que la del control. . Los datos sugieren que estos complejos indujeron en gran medida la maduración de las BMDC, lo que puede desencadenar las respuestas inmunitarias de los linfocitos T citotóxicos.

Fig. 10 (A) Coexpresión de CD86 y CD80, (B) análisis cuantitativos de CD11c+CD86+CD80+ en BMDC, (C) expresión de MHC-II en la superficie de los BMDC, y (D) intensidad media de MHC-II determinada por citometría de flujo después del tratamiento con el sobrenadante de células MDA-MB-231 incubadas con diferentes compuestos (6 mM) durante 24 h.

Cocultivo de células cancerosas con PBMC.

Para evaluar más a fondo los efectos inmunomoduladores de los complejos, se evaluó la viabilidad de las células MDA-MB-231 en presencia de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas activadas por fármacos mediante el ensayo MTT de acuerdo con un método publicado en la literatura.66 Se establecieron como controles células cancerosas o células cancerosas con PBMC. Como se muestra en la Fig. 11, en ausencia de PBMC, MnPC y MnPVA suprimieron la viabilidad celular al 64,98% y 62,02%, respectivamente. El cocultivo de las células con PBMC sin complejo de Mn solo mostró citotoxicidad basal con una viabilidad celular media del 81,49%. Sin embargo, en presencia de PBMC, MnPC y MnPVA suprimieron la viabilidad celular en un 38,19% y 36,98%, respectivamente. A esta concentración (6 mM), la mayoría de las PBMC todavía están vivas (Fig. S9†). Los resultados demuestran que MnPC y MnPVA pueden activar la respuesta inmune de las PBMC para ejercer efectos citotóxicos en las células MDA-MB-231, exhibiendo así un efecto sinérgico significativo contra las células cancerosas.

Toxicidad aguda y actividad anticancerígena in vivo.

La toxicidad aguda de los complejos MnII se evaluó en ratones hembra Balb/c. Se determinaron la dosis letal media (LD50) y los cambios de peso corporal después de la inyección intravenosa de cada complejo. La LD50 de MnPC y MnPVA fue 16,08 ± 2,16 y 25,16 ± 3,19 mg kg-1, respectivamente (Fig. S10†), que son mucho más altas que la de CDDP (4,{{60}}6 ± 1,02 mg kg-1).67 No se observaron cambios significativos en el peso corporal en los ratones tratados con MnPC y MnPVA. Los resultados indican que MnPC y MnPVA son poco tóxicos para los mamíferos. Curiosamente, la unión de VA al complejo de Mn atenuó la toxicidad general o aumentó la biocompatibilidad. Además, se establecieron modelos de ratón con cáncer de mama 4T1 para evaluar la actividad anticancerígena de MnPC y MnPVA in vivo. Como se muestra en la Fig. 12, después de tratar los ratones con PBS, MnCl2, MnPC y MnPVA (1,3 mg de Mn por kg) respectivamente durante 16 días, MnPC y MnPVA mostraron una inhibición más eficaz del crecimiento del tumor que MnCl2. El día 16, el volumen tumoral promedio (A, B) disminuyó a 554,78 ± 43,76 y 348,01 ± 39,61 mm3, respectivamente, para los ratones tratados con MnPC y MnPVA, mientras que para los ratones tratados con PBS y MnCl2- ratones tratados fue de 1182,01 ± 95,87 y 784 ± 64,93 mm3, respectivamente. El peso promedio del tumor (C) fue de 1,41 ± 0,13, 0,95 ± 0,19, 0,82 ± 0,19 y 0,59 ± 0,1 g para los ratones tratados con PBS, MnCl{67}}, MnPC y MnPVA, respectivamente. Obviamente, el efecto inhibidor tumoral de MnPVA fue superior al de MnPC y MnCl2, lo que puede deberse a la inhibición efectiva de la expresión de HDAC por parte de MnPVA. Además, no se observó ninguna anomalía patológica aparente o lesión en el peso corporal (D), la supervivencia y la anatomía macroscópica de los órganos (Fig. S11†). Estos resultados sugieren que los complejos MnII son fármacos candidatos prometedores para la terapia del cáncer.

Fig. 11 Viabilidad promedio (%) de células MDA-MB-231 después de la coincubación con PBMC activadas por compuesto (6 mM) durante 48 h. Los datos se muestran como media ± DE (n=3); **p < 0.01 y ***p < 0,001.

Respuesta inmune anticancerígena in vivo

La capacidad inmunoestimulante in vivo de los complejos MnII se probó en ratones Balb/c portadores de tumores 4T1. El estado de las células inmunes en el tumor, el bazo y los ganglios linfáticos (LN) que drenan el tumor se analizó mediante citometría de flujo.21 Las células T CD8+ son esenciales para restringir el inicio del cáncer y la progresión maligna en el sistema inmunológico. y la inducción de linfocitos T citotóxicos (CTL) requiere la activación de CD inmaduras en células maduras,8,9 que se denominaron células CD11c+ CD80+ CD86+.68 Como se muestra en las figuras 13A y B , en los ratones tratados con MnPVA, el porcentaje de DC maduras indicado por la expresión de los receptores coestimuladores CD80+ y CD86+ (ref. 69) fue mayor (45,59%) en los LN que en los LN. tratados con PBS, MnCl2 y MnPC, respectivamente. Los macrófagos son partes integrales del sistema inmunológico y modulan el microambiente tumoral.70 Según sus funciones, los macrófagos se pueden clasificar en estados de activación fenotípica tumoricida M1 y protumoral M2.71 Los macrófagos M1 están marcados por TNF-a, IL-12 , CD80, CD86 y destrucción directa de células tumorales,70 mientras que los TAM tipo M2- se caracterizan por una alta expresión del receptor 1 de manosa de macrófagos (MMR o CD206) y la promoción del crecimiento de células tumorales, como además de exhibir una fuerte actividad inmunosupresora. Se sabe que los inhibidores de HDAC pueden potenciar los cambios de movimiento en la polarización de los macrófagos y mejorar el fenotipo M1, además de prevenir la reparación del ADN.72 Por lo tanto, detectamos la polarización de los macrófagos en el bazo y el tumor mediante citometría de flujo. después del tratamiento con los complejos de Mn. Como se muestra en las figuras 13C-E y S12A-C,† el fenotipo M2 marcado por CD206+ se suprimió significativamente y el fenotipo M1 marcado por CD86+ aumentó notablemente en los ratones tratados con MnPVA. Los resultados indican que MnPVA indujo efectivamente la polarización de macrófagos del fenotipo M2 al M1. MnCl2 y MnPC también aumentaron la expresión de CD86, pero solo influyeron levemente en CD206 en comparación con PBS. Mientras tanto, se midieron mediante ELISA el IFN-b, la IL-6 y el TNF-a secretados por las CD maduras y los macrófagos. Como se muestra en las figuras 13F y G, MnPVA mejoró los niveles de IFN-b y TNF-a de manera más efectiva que PBS, MnCl2 y MnPC, lo que puede provocar que las células T destruyan las células tumorales. Sin embargo, no se observó ningún cambio significativo en IL-6 (Fig. S13†).

Fig. 12 Efecto terapéutico de MnPC, MnPVA y MnCl2 en ratones portadores de tumores 4T1, utilizando PBS como control. (A) Imágenes de tumores extirpados, (B) volumen del tumor, (C) peso del tumor y (D) peso corporal de los ratones después del tratamiento con PBS, MnCl2, MnPC y MnPVA, respectivamente, a 1,3 mg de Mn por kg una vez cada 2 días durante 16 días. **p < {{10}}.01 y ***p < 0,001.

Fig. 13 CD maduras (CD80+CD86+ activadas en CD11c+) y análisis cuantitativos de los ganglios linfáticos que drenan tumores (A y B), la polarización de los macrófagos (CD206+CD{ {7}} activado en CD11b+) en el tejido tumoral 4T1 de un ratón (C-E) determinado por citometría de flujo, y análisis ELISA de IFN-b (F) y TNF-a (G) en suero de ratones después del tratamiento con cada compuesto (1,3 mg Mn por kg) una vez cada 2 días durante 16 días. Los datos se presentan como media ± DE (n=3). *P < 0.05; **P<0.01; ***P < 0,001.

Tras la activación de la vía cGAS-STING en CD y macrófagos por MnPC y MnPVA, los IFN-I secretados y las citoquinas proinamatorias podrían cebar los linfocitos citotóxicos.59 Por lo tanto, evaluamos más a fondo la activación de las células T citotóxicas (CD8+ ) y células T colaboradoras (CD4+ ) en tejidos tumorales y del bazo, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 14A y S12D-F†, las células T CD8+ (cuadrado azul) en los tumores se activaron eficazmente (9,18%) en los ratones tratados con MnPVA en comparación con los tratados con PBS (3,53%). ), MnCl2 (4,48%) y MnPC (6,05%); Las células T CD4+ (cuadrado rojo) también se activaron ligeramente y los resultados fueron opuestos a los del bazo después del tratamiento con los complejos. La Fig. 14B muestra que las frecuencias de células T CD8+ activadas (CD69+ ) infiltrantes de tumores aumentaron dramáticamente. Todos estos resultados indican que MnPVA fue capaz de estimular fuertes respuestas inmunes in vivo debido a la activación de la vía cGAS-STING.

Fig. 14 Células T CD8+ (cuadrado azul) y CD4+ (cuadrado rojo) (A) y porcentajes del subconjunto CD69+ entre las células T CD8+ ( B) en el tejido tumoral 4T1 de un ratón después del tratamiento con cada compuesto (1,3 mg de Mn por kg) una vez cada 2 días durante 16 días determinado mediante citometría de flujo.

Mecanismo de acción

Se propuso una acción para los complejos de Mn como se muestra en la Fig. 15. En las células tumorales, MnPC o MnPVA dañaron el ADN nuclear y/o mitocondrial, lo que provocó la regulación positiva de g-H2AX; mientras tanto, el complejo inhibió la actividad de HDAC1/2 y PARP1, perjudicando así la capacidad de reparación del ADN e intensificando el daño al ADN. Los fragmentos de ADN acumulados se liberaron desde el núcleo y/o las mitocondrias al citoplasma y cGAS los reconoció para activar STING. El STING, a su vez, estimuló la fosforilación de TBK1 e IRF3 y la translocación al núcleo, induciendo la producción de IFN, IL-6 y TNF-a. Estos IFN y citoquinas proinflamatorias luego se secretaron desde el núcleo al citosol y luego al microambiente tumoral, donde promovieron la maduración y la presentación de antígenos de las CD y los macrófagos, y activaron aún más las células T citotóxicas para matar las células cancerosas. También ocurrieron eventos similares en células inmunes como los macrófagos y se activó la vía cGAS-STING-TBK1. La activación de la vía cGAS-STING inició respuestas inmunes innatas y comunicación bidireccional entre las células tumorales y las células inmunes vecinas para mejorar el efecto letal sobre los tumores.21 En consecuencia, los complejos de Mn mostraron una potente actividad antitumoral debido a la sinergia entre la quimioterapia y la inmunoterapia. . La mayoría de estos procesos han sido probados in vitro o in vivo.

Fig. 15 Mecanismo de acción propuesto para los complejos de manganeso.

Conclusión

Cada vez hay más evidencia que muestra que muchos complejos metálicos interactúan con células tumorales e inmunes para remodelar microambientes inmunosupresores, además de ejercer un efecto citotóxico directo sobre las células tumorales.73 En este estudio, presentamos dos complejos MnII, MnPC y MnPVA, como potenciales quimioinmunoterapéuticos para frenar el cáncer mediante la estimulación. respuestas inmunes innatas, así como romper las dobles hebras del ADN. Estos complejos multifuncionales matan las células cancerosas no sólo dañando el ADN sino también reactivando las respuestas inmunitarias latentes. En primer lugar, actúan como rompedores del ADN, induciendo daño oxidativo en el ADN y produciendo fragmentos de ADN; en segundo lugar, actúan como inhibidores de HDAC y PARP1, impidiendo la reparación del daño del ADN y reforzando las lesiones del ADN; en tercer lugar, actúan como agonistas de la vía cGAS-STING, induciendo la secreción de IFN y citocinas proinflamatorias para promover la maduración de las CD y los macrófagos, y estimulando aún más las células T específicas del tumor para matar las células tumorales.

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Con todo, MnPC y MnPVA activaron eficazmente la vía cGAS-STING y restringieron el crecimiento de células cancerosas in vitro e in vivo. La unión de VA al complejo MnII potenció dramáticamente su inhibición de las HDAC y fortaleció la actividad antiproliferativa del complejo, y la formación de complejos de Mn proporciona un impulso significativo a la actividad antiproliferativa de MnCl2 y 1,10-fenantrolina. Desde que Jiang et al. informó por primera vez la actividad estimulante del Mn2+ en la vía cGAS-STING,12 no se ha descubierto tal propiedad en los complejos de Mn. Este estudio demuestra que la capacidad estimulante de MnPC y MnPVA para la vía cGAS-STING es mucho mayor que la de MnCl2 o Mn2+ tanto en células tumorales como inmunes porque indujeron más fragmentos de ADN en el citoplasma para activar el cGAS. -Vía de la picadura. Los hallazgos significan que se podrían obtener agonistas de cGAS-STING más potentes mediante la construcción de complejos MnII con ligandos que bloquean la reparación o dañan el ADN.

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