El betaglucano mejoró la respuesta inmune a la vacuna contra la enfermedad de Newcastle y cambió la expresión del ARNm del bazo en pollos

ABSTRACTO

El presente estudio se realizó para investigar el efecto de la administración oral de b-glucano (G70), un producto obtenido de la pared celular de la levadura, sobre los títulos de inhibición de la hemaglutinación (HI) específicos del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), la proliferación de linfocitos y el papel de las subpoblaciones de linfocitos T en pollos tratados con vacuna viva NDV. Además, se investigó la influencia del b-glucano en la expresión del gen esplénico mediante secuenciación del transcriptoma. Los resultados revelaron que la suplementación con b-glucano aumentó el título de NDV HI en suero, aumentó el índice de estimulación de NDV de los linfocitos en la sangre periférica y el tracto intestinal, y promovió la diferenciación de los linfocitos T en células T CD4+. El análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq) demostró que G70 regulaba positivamente las expresiones de ARNm relacionadas con el receptor acoplado a proteína G y el polipéptido MHC de clase I, y regulaba negativamente las expresiones de ARNm relacionadas con catelicidina y betadefensina. El efecto inmunomodulador del G70 podría funcionar a través de la vía de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos. En resumen, G70 podría aumentar la eficacia inmunológica de la vacuna viva contra el VEN en pollos y podría aplicarse como posible candidato a adyuvante en la industria avícola.

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Palabras clave: vacuna contra la enfermedad de Newcastle, betaglucano, adyuvante, pollo con hueso negro, RNA-seq

INTRODUCCIÓN

Los polisacáridos de la pared celular de levadura se derivan directamente de la pared celular de Saccharomyces cerevisiae y se utilizan ampliamente como promotores del crecimiento, agentes antimicrobianos o inmunomoduladores en aves de corral para mejorar la producción y la salud (Schiavone et al., 2017; Hasted et al., 2021). Anteriormente, se demostró que un producto llamado PW220, que contiene polisacáridos de la pared celular de levadura, estimula la respuesta inmune provocada por el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) y altera la comunidad microbiana del ciego de los pollos mediante administración oral (Bi et al., 2020 ). Los polisacáridos de la pared celular de levadura están compuestos principalmente de b-glucano y mananooligosacáridos (Wang et al., 2018). En el presente estudio, se investigó el efecto del b-glucano sobre la respuesta inmune a la vacuna NDV en pollos. El bazo es un órgano fundamental para iniciar la respuesta inmune. Un estudio reciente indicó que PW220, que es un producto de la pared celular de levadura, reguló positivamente la expresión de ARNm de TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 y T-bet en el bazo de pollos ( Bi et al., 2022). Sin embargo, es necesario dilucidar el mecanismo específico. La secuenciación de ARN (RNA-seq) es una de las tecnologías de alto rendimiento que se puede aplicar para analizar la expresión genética cuantitativa y proporcionar análisis de diferentes perfiles de expresión a nivel de todo el transcriptoma (Zhao et al., 2018). Con las ventajas de una alta sensibilidad y un bajo costo, RNA-seq se ha utilizado ampliamente en estudios de ganado y aves de corral (Teixeira et al., 2019; Yuan et al., 2020). Por lo tanto, en este estudio, se evaluó el efecto de la administración de b-glucano sobre los títulos de inhibición de la hemaglutinación (HI) específicos del NDV, la proliferación de linfocitos y las subpoblaciones de linfocitos T en pollos vacunados por vía oral con la vacuna NDV. Además, se utilizó el análisis del transcriptoma para evaluar el efecto del b-glucano en la expresión genética y las vías de transducción de señales subyacentes en el bazo de los pollos.

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animales

Se adquirieron pollos comerciales de hueso negro (machos) de un día de edad de Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (Anshun, China). Los pollos se dividieron en jaulas de alambre que permitían el libre acceso al alimento y al agua. En los primeros 7 días, la temperatura ambiente se mantuvo entre 33 grados C y 35 grados C y luego disminuyó gradualmente en 1 grado C por cada 2 días hasta 27 grados C. Todos los pollos fueron procesados ​​según los estándares establecidos por Southwest University Animal Care and Comité de Uso (Número de Certificado de Ética: IAC-2021-0057). Todas las aves experimentales fueron sacrificadas con CO2 al final del estudio.

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Vacuna

La vacuna viva contra el NDV (cepa La Sota) fue proporcionada por Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Qingdao, China).

reactivos 

El producto de pared celular de levadura (YP) G70 se obtuvo a partir de la pared de células de levadura (Saccharomyces cerevisiae), que contiene b-glucano (mayor o igual al 70%) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, China). Tanto el antígeno como el suero de control positivo para medir los títulos de HI específicos del NDV se adquirieron en el Centro de Desarrollo de Diagnósticos Regen de Qingdao (Qingdao, China). CD3-APC antipollo (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) y CD8-PE (L{{14 }}TH49T) en ratas fueron ofrecidos por Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, China).

Diseño experimental

Cuarenta y ocho pollos de hueso negro de 5 días de edad fueron asignados aleatoriamente a 3 grupos (Tabla 1) y recibieron la dieta basal (Tabla 2) o la dieta basal con 0.1% G7{{10} } (b-glucano, 0,7 g/kg) suplementación durante la presente investigación. Los grupos H (vacuna G70 +) y C (vacuna) fueron inmunizados por vía oral con la vacuna NDV a los 14 y 28 días, respectivamente. El grupo S (Sailne) fue tratado con un volumen igual de solución salina. Se recolectaron muestras de sangre mediante punción venosa del ala a la edad de 5, 7, 14, 21, 28, 35 y 42 días para probar el título de HI. Siete días después de la vacunación de refuerzo, se seleccionaron al azar 8 pollos de cada columna y se sacrificaron por asfixia con CO2. Los linfocitos se separaron tanto de la sangre periférica como del yeyuno para realizar análisis de proliferación de linfocitos y citometría de flujo. En el caso del muestreo yeyunal, el ligamento suspensorio duodenal fue el punto de partida del yeyuno y se recogió una sección de 5 cm de largo desde el punto inicial del yeyuno. El bazo se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y luego se almacenó a -80 grado para RT-qPCR y perfil de secuencia.

Tabla 1. Diseño experimental

Tabla 2. 1 Composición y contenido de nutrientes de dietas basales experimentales para pollos de engorde.

Estudio HI

El ensayo para los títulos de HI específicos del NDV en el suero se realizó siguiendo la descripción anterior (Ball et al., 2019). En resumen, el suero se diluyó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 1:2 a 1:1,024 en la placa de microtitulación de pocillos con fondo en V 96-. Luego, se agregaron 25 ml de dilución de NDV por pocillo y se incubaron a 37 grados durante 30 minutos. Después de eso, se agregaron 25 ml de suspensión de eritrocitos de gallo al 1% a cada pocillo y se incubaron a 37 grados durante 30 minutos. Todas las muestras se analizaron dos veces y en cada placa se incluyeron controles positivos y negativos. Los títulos de HI se basaron en la mayor dilución que dio como resultado una inhibición completa de la hemaglutinación. Se midieron el título de HI promedio y el error estándar (SE) por grupo.

Aislamiento de linfocitos de sangre periférica

Los linfocitos se aislaron y recolectaron de linfocitos de sangre periférica utilizando el kit de medio de separación de linfocitos (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Tianjin, China). Luego, los linfocitos se almacenaron en suspensión con medio RPMI 1640 (Solarbio, Beijing, China) que incluía suero fetal de ternera al 5 % y HEPES 25 mM (pH 7,0).

Aislamiento de linfocitos del yeyuno

El proceso de asignación se realizó de acuerdo con la descripción anterior, y con ligeras modificaciones (Yuan et al., 2020). En resumen, utilice un filtro celular de 70 mm para dividir el intestino en 4 ml de PBS frío. A continuación, la suspensión de células de muestra se centrifugó a 4500 rpm durante 12 minutos con eliminación del sobrenadante. Luego, resuspender las células intestinales en un medio completo (Solarbio Co., Beijing, China) que consiste en suero bovino fetal (FBS) al 5% en RPMI 1640 (Sijiqing Co., Hangzhou, China). Al final, se utilizó el kit de aislamiento de linfocitos de pollo (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) para separar los linfocitos. El tejido del intestino se dividió en 4 ml de PBS frío utilizando un filtro de células de 70 mm. A continuación, la suspensión de células de la muestra se centrifugó a 4500 rpm durante 12 min y se descartó el sobrenadante. Después de eso, las células intestinales se resuspendieron en RPMI 1640 (Solarbio Co.) que contenía FBS al 5 % (Sijiqing Co.). Finalmente, los linfocitos se separaron utilizando el kit de aislamiento de linfocitos de pollo (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.).

Proliferación de linfocitos 

Las células se sembraron en 96-placas de pocillos (5£105 por pocillo), estimuladas por el antígeno de NDV inactivado durante 4 unidades de hemaglutinación o un volumen igual de solución salina. Cada muestra se analizó en 3 réplicas. Las células y el antígeno se incubaron durante 44 h a 37 grados en CO2 al 5 % y luego se agregaron 50 ml de metil tiazolilo tetrazolio (MTT) (2 mg/ml) a cada pocillo y se incubaron durante otras 4 h. Las muestras se centrifugaron a 1200 £ g durante 8 min a temperatura interior. Posteriormente, se eliminó con cuidado el sobrenadante y se agregaron 100 ml de DMSO a cada pocillo. Las placas se agitaron durante 8 minutos para solubilizar completamente los cristales. Finalmente, la densidad óptica (DO) promedio se registró a 570 nm. El índice de estimulación (SI) se obtuvo mediante la ecuación: valores de DO de pozos estimulados/valores de DO de pozos no estimulados (Cui et al., 2020).

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Análisis de citometría de flujo de subpoblaciones de linfocitos T

Se aislaron suspensiones de células linfoides y se lavaron dos veces con PBS. La concentración celular se modificó a 106/ml y luego se mantuvo en hielo. Cada muestra se tiñó con 2 ml de CD3-APC anti-pollo de rata, CD4- FITC y CD8-PE anti-pollo de rata en condiciones a prueba de luz durante 30 minutos, seguido mediante 2 lavados con PBS. Las células se analizaron mediante análisis de citometría de flujo en un citómetro de flujo (BD Bioscience, San José, CA).

Análisis RT-qPCR

El ARN total se derivó del bazo usando el reactivo TRIzol (Takara, Shiga, Japón) de acuerdo con las pautas del fabricante y luego se convirtió en ADNc usando PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian, China) en un ciclador térmico T100 (Bio-Rad, Hércules, California). La beta-actina de pollo se empleó como gen de control interno. La RT-qPCR de genes seleccionados se llevó a cabo en un sistema de PCR múltiple en tiempo real (AB, Carlsbad, CA) con SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Se realizó el método cuantitativo relativo (244CT) para evaluar la variación cuantitativa (Bi et al., 2022). Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 3.

Extracción de ARN

Cada una de las 3 muestras de bazo del Grupo H (Vacuna G70 +) y del Grupo C (Vacuna) se utilizó para la secuencia de ARN con reactivo TRIzol (Takara). Después de eso, se analizó la contaminación y degradación del ARN con gel de agarosa al 1% y se analizó la pureza del ARN utilizando un espectrofotómetro NanoPhotometer (IMPLEN, Westlake Village, CA). La concentración de ARN se determinó empleando el kit de ensayo de ARN Qubit en el fluorómetro Qubit 2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). La integridad del ARN se midió utilizando el kit de ensayo RNA Nano 6000 del sistema Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Los resultados demostraron que el ARN estaba completo y sin contaminación del ADN.

Análisis del transcriptoma

La secuenciación del transcriptoma, el ensamblaje de secuencias y el análisis de datos fueron proporcionados por Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Beijing, China). Los principales procedimientos para el transcriptoma se enumeraron a continuación: 1) La purificación del ARNm a partir del ARN total se realizó utilizando perlas magnéticas unidas a oligopoli-T. La fragmentación se llevó a cabo con cationes divalentes en tampón de reacción de síntesis de primera hebra NEB Next (5X) a alta temperatura. 2) Se sintetizó el tamaño del ADNc de la primera cadena utilizando un cebador hexámero aleatorio y el virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV) inverso. Luego se sintetizó la síntesis de ADNc de la segunda cadena utilizando ADN polimerasa I y ARNasa H. 3) Los salientes restantes se transformaron en extremos romos mediante las actividades exonucleasa/polimerasa. Luego se ligó una estructura de bucle en horquilla NEB Next Adapter para preparar la hibridación después de la adenilación del extremo 3' de los fragmentos de ADN. 4) Se obtuvieron fragmentos de ADNc de aproximadamente 250 a 300 pb y la biblioteca se purificó usando el sistema AMPure XP de Beckman Coulter (Beckman Coulter, Beverly, MA). Luego se aplicaron 3 ml de enzima NEBU SER (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) con ADNc ligado al adaptador y de tamaño seleccionado a 37 grados C durante 15 minutos, seguido de 5 minutos a 95 grados. La amplificación por PCR se llevó a cabo con ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion. Al final, los productos de la PCR se purificaron (sistema AMPure XP) y la calidad de la biblioteca se estimó utilizando el sistema Agilent Bioanalyzer 2100. La agrupación de las muestras codificadas por índice se realizó en el TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA). Luego, la secuenciación se realizó en una plataforma Illumina Novaseq y se generaron lecturas de extremos emparejados de 150 pb. Los archivos de anotaciones del genoma de referencia y del modelo genético se descargaron del sitio web del genoma (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ y ftp://ftp. ensembl.org/pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Se estableció un índice del genoma de referencia utilizando HISAT2 (v2.0.5) y las lecturas limpias de extremos emparejados se alinearon con el genoma de referencia. El número de lecturas asignadas a cada gen y los fragmentos por kilobase por millón (FPKM) para cada gen en función de la longitud del gen y el número de lecturas asignadas al gen se calcularon utilizando Feature Counts v1.5.{{38} }p3. La expresión diferencial entre el grupo H (vacuna G70 +) y el grupo C (vacuna) se obtuvo utilizando el paquete DESeq2 R (1.16.1). Genes con P <0,05 y |log2 (cambio veces)| > 1 se definieron como genes de expresión diferencial (DEG).

Tabla 3. Secuencias de cebadores para RT-qPCR.

Validación de PCR cuantitativa en tiempo real 

Se eligieron dos DEG regulados positivamente y 4 DEG regulados negativamente en la comparación del grupo H (vacuna G70 +) frente al grupo C (vacuna) para confirmar los resultados de la secuenciación del transcriptoma mediante RT-qPCR. El ARN se convirtió en ADNc utilizando PrimeScript RT Master Mix (Takara) en el ciclador térmico T100 (Bio-Rad). Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 3. Se usó b-actina de pollo como gen de control interno. La RT-qPCR de genes seleccionados se llevó a cabo en un sistema de PCR múltiple en tiempo real (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) con SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Se aplicó un método cuantitativo relativo (244CT) para evaluar la variación en la cuantificación. Todas las muestras se realizaron por triplicado para el análisis.

Análisis estadístico

Se utilizó ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Duncan para comparaciones múltiples entre grupos utilizando el software SPSS (versión 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Los datos se expresan como la media § SE. Un valor de P < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.

RESULTADOS Efecto del b-glucano sobre los títulos de anticuerpos séricos

Como se muestra en la Figura 1, los títulos de HI específicos del NDV disminuyeron en todos los grupos antes de la vacunación y aumentaron en los grupos H (vacuna G70+) y C (vacuna) después de la inmunización. Curiosamente, se observaron títulos de HI más altos en el grupo H (vacuna G70+) en 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (P > 0,05) y 42 (P > 0,05) días de edad que en el grupo C (Vacuna).

Efecto del b-glucano sobre la proliferación de linfocitos

El efecto de G70 sobre la proliferación de linfocitos de sangre periférica se representa en la Figura 2A. La SI en los linfocitos sanguíneos aumentó en las aves suplementadas con G70 (vacuna G70 +) a los 7 días (P <0,05) de la inmunización de refuerzo, en comparación con el grupo de la vacuna. Además, la SI en los linfocitos yeyunales aumentó significativamente a los 7 días (P <0,05) después de la inmunización de refuerzo en comparación con el grupo de la vacuna (Figura 2B).

Efecto del b-glucano sobre la proporción de células T CD4 +/CD8 + en sangre periférica 

Las Figuras 3A y 3B indicaron la selección de linfocitos y células CD3 + y las Figuras 3C a 3E mostraron la proporción de células T CD4 +/CD8 + en el G70, vacuna y solución salina, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3F, no hubo diferencias notables entre el grupo de vacuna y el grupo de solución salina después de la inmunización de refuerzo (P > 0.05), mientras que la proporción de CD4 +/CD{{12} } Las células T fueron obviamente mayores en el grupo G70 (vacuna G70 +) que en el grupo de vacuna (P <0,05).

Figura 1. Efecto de la administración oral de b-glucano sobre los títulos de anticuerpos séricos contra la vacuna NDV. Los datos se expresan como media § SE.

Expresión genética relacionada

Como se ilustra en la Figura 4, la expresión de ARNm aumentó significativamente de TGF-b (P < 0.05), IL-6 (P < 0.{{13} }5) y TLR5 (P < 0.05) se detectó en el bazo de pollos tratados con G70 (vacuna G70 +), en comparación con el grupo de la vacuna. No se encontraron diferencias significativas en la expresión de ARNm de IFN-g (P > 0,05), TLR4 (P > 0,05) y TLR3 (P > 0,05) en el bazo entre la vacuna G70 (vacuna G70 +) y la vacuna grupos.

Análisis de datos de secuenciación de ARN 

La secuenciación de ARN de 8 bibliotecas de bazo arrojó 24,1 G de datos sin procesar como se presenta en la Tabla S1 del material complementario. CN significa vacuna del grupo y HN significa vacuna del grupo G70 +. Las bibliotecas C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 y H4 respectivamente, constan de 45.591.492, 47.424.782, 46.193.492, 54.403.376, 47.118.476, 45.899.262, 45.841.884 y 45.504,43. 8 lecturas originales. Después del aptámero, se eliminaron las secuencias ambiguas y las secuencias de baja calidad, dejando 44.050.198, 45.449.884, 44.261.112, 52.097.846, 45.542.404, 44.566.290, 44.113.172 y 44.026.960 lecturas limpias. Más del 96 % de las lecturas limpias se encontraban entre las lecturas originales, y se compararon 8 bibliotecas utilizando HISAT2 para secuenciar lecturas con una base de datos de referencia que consta del genoma de Gallus. Además, las lecturas limpias se asignaron a esta base de datos en más del 95 % de los casos. Específicos de las bibliotecas de C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 y H4 fueron 40.921.384 (92,9%), 41.302.100 (90,87%), 40.771.075 (92,11%), 46.905.784 (90,03%), 42.444.112 (93,2%). %), 40.213.444 (90,23%), 40.922.895 (92,77%) y 40.971.972 (93,06%) lecturas se asignaron únicamente a la base de datos de referencia, respectivamente.

Genes expresados ​​diferencialmente

Como se indica en la Figura 5A, se identificaron un total de 198 genes expresados ​​diferencialmente, incluidos 47 genes regulados positivamente y 151 genes regulados negativamente. Los DEG se describieron en detalle en el material complementario Tabla S2. La Figura 5B indica que los DEG tienen una buena reproducibilidad de los tratamientos.

Análisis de la clasificación de ontología genética y enciclopedia de genes y enriquecimiento de genomas de Kioto

Los genes que se expresan diferencialmente se clasificaron en 3 categorías funcionales principales según el sistema de clasificación Gene Ontology (GO): proceso biológico, componente celular y función molecular. Los 10 términos GO principales en las 3 categorías se presentan en la Figura 6. Hubo un predominio de genes implicados en la "respuesta inmune humoral", "respuesta a quimiocinas", "respuesta humoral antimicrobiana", "respuesta de defensa contra la bacteria", "respuesta inmune al humor antimicrobiano mediada por péptidos antimicrobianos", "respuesta de defensa contra bacterias Gram negativas" y "respuesta de defensa contra bacterias Gram positivas" en la categoría de procesos biológicos. Además, en la categoría de función molecular, una proporción notable de genes estaban relacionados con la "unión al receptor de quimiocinas con motivo CC (CCR)," la "unión al receptor de quimiocinas" y la "unión a lipopolisacáridos". Además, "complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial", "complejo NADH deshidrogenasa" y "cadena respiratoria" fueron los términos enriquecidos más dominantes en la categoría de componentes celulares. El análisis de la ruta de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto también se realizó en los genes expresados ​​diferencialmente. Los resultados sugirieron que los genes se agrupaban principalmente en 7 vías, incluida la "interacción ligando neuroactivo-receptor", la "unión comunicante", la "vía de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK)", los "transportadores ABC", la "biosíntesis de aminoácidos" y la "interacción ligando-receptor neuroactivo". "Metabolismo de fármacos" y "Exportación de proteínas".

Figura 2. Efecto de la administración oral de b-glucano sobre el índice de estimulación de linfocitos (SI). (A) Linfocitos de sangre periférica; (B) linfocitos del intestino. Los datos se expresan como media § SE.

Figura 3. Efecto de la administración oral de b-glucano sobre la proporción de células CD4+/CD8+ de sangre periférica. (A) Puerta de los linfocitos; (B) puerta en células T CD3+; (C) frecuencias de células T CD3+ CD4 + CD8 + en el grupo de vacuna G70+; (D) frecuencias de células T CD3+ CD4 + CD8 + en el grupo de vacuna; (E) frecuencias de células T CD3+ CD4 + CD8 + en el grupo salino; (F) diagrama de barras que representa la relación CD4+/CD8+. Los datos se expresan como media § SE.

Figura 4. Efecto de la administración oral de b-glucano sobre la expresión de ARNm en bazo de pollo. Los datos se expresan como media § SE.

Figura 5. Resumen de datos de RNA-Seq. (A) Lista de genes expresados ​​diferencialmente, (B) mapa de agrupación de los DEG.

Verificación de genes expresados ​​diferencialmente mediante RT-qPCR

Los 6 DEG que estaban regulados hacia arriba o hacia abajo se confirmaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El resultado sugirió que los datos de RT-qPCR generalmente coincidían con los datos de RNA-seq en general, lo que indica un resultado de secuenciación confiable (Figura 7). Expresión de ARNm de genes asociados a la vía MAPK Como se muestra en la Figura 8, se redujo significativamente la expresión de ARNm de FAS (P < 0.05) y CACNA2 (P < 0.05). detectado en el bazo de pollos del grupo G70 (vacuna G70 +) en comparación con el grupo de la vacuna. Además, se detectó un aumento numérico de la expresión de ARNm de DUSP5 y DUSP4, y una expresión numéricamente reducida de ARNm de p38, JNK y ERK en el grupo G70 (vacuna G70 +) en comparación con el grupo de vacuna (P > 0,05). .

DISCUSIÓN

La vacuna viva contra la EN se inocula ampliamente en granjas de pollos y, sin embargo, todavía hay brotes esporádicos de la enfermedad de Newcastle en bandadas de aves de corral inmunizadas (Zhang et al., 2022). Las vacunas óptimas se definen para estimular la inmunidad celular y mucosa, así como una inmunidad humoral eficaz (Shan et al., 2019). Por lo tanto, se prestó cada vez más atención a los adyuvantes que podrían conferir respuestas inmunes tanto mucosas como celulares (Chen et al., 2014; Yu et al., 2015). En comparación con la vía de inyección, la administración oral es un enfoque más sencillo que reduce los costos e induce menos estrés en los pollos de engorde (Boyaka et al., 2003; Zhang et al., 2008). Los resultados de este estudio mostraron que una dieta suplementada con b-glucano aumentó notablemente el nivel de títulos de HI específicos del NDV en el suero de los pollos, lo que concuerda con informes anteriores (Horst et al., 2019). El anticuerpo específico del NDV es esencial para el desarrollo de la respuesta inmune humoral para proteger a los pollos de la infección por el NDV (Martinez et al., 2018; Li et al., 2020). Los linfocitos B producen anticuerpos y los linfocitos T se expanden en respuesta al mitógeno (Bohacova et al., 2021). En el presente estudio, el índice de estimulación de los linfocitos de sangre periférica de pollo frente al VEN del grupo G70 fue obviamente mayor que el del grupo vacunado, lo que indica que se activaron más linfocitos T. Las subpoblaciones predominantes de linfocitos T son las células T CD4 + y CD8 + (Cui et al., 2020). Las células T CD4 + producen principalmente citocinas y promueven la maduración de las células B, mientras que las células T CD8 + se asocian con la destrucción de las células diana (Zhang et al., 2021b). En esta investigación, la proporción de células T CD4 +/CD8 + detectadas en el grupo G70 estaba claramente aumentando, lo que sugiere que G70 podría activar más células T CD4 + de sangre periférica. Además, observamos un índice de estimulación de linfocitos intestinales significativamente mayor en el grupo G70 que en el grupo de vacuna, lo que confirmó que el b-glucano también podría estimular los linfocitos intestinales. Nuestros experimentos anteriores confirmaron que el extracto de pared celular de levadura PW220 aumentó significativamente las células sIgA e IgA + específicas del intestino (Bi et al., 2020). Es decir, tanto el b-glucano G70 como el PW220 son eficaces para promover la inmunidad de la mucosa intestinal.

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Anteriormente se ha informado de una mejora de la inmunidad de los animales mediante la administración de b-glucano. Guo et al. (2003) confirmaron que la administración de b-glucano mejoró el índice de bolsa y anticuerpos específicos del NDV en pollos. Levine et al. (2018) sugirieron que la suplementación con b-glucano puede regular positivamente el MHC Ⅱ intestinal y aumentar la cantidad de células CD45 + para aliviar la lesión intestinal.

Li y col. (2005) revelaron que el b-glucano en la dieta podría regular positivamente los niveles de expresión de ARNm de IL-8 y TGF-b en el tracto intestinal de los cerdos. El mecanismo del efecto inmunomodulador del b-glucano no está claro. Kim y cols. (2010) demostraron que el b-glucano promovía la maduración de las células dendríticas al regular positivamente la expresión de CD40, CD80 y CD86. Además, Lee y Kim (2014) y Su et al. (2020) informaron que el b-glucano activaba receptores de reconocimiento de patrones como el receptor Dectin-1, el receptor tipo Toll y CR3 (Baert et al., 2015). El bazo es un órgano fundamental para iniciar la respuesta inmune y desempeña un papel esencial tanto en la inmunidad innata como en la adquirida (Brontë y Pittet, 2013). Sin embargo, solo hay una pequeña investigación basada en el análisis de secuencia de ARN de la expresión de ARNm en el bazo después de la administración oral de polisacáridos de levadura. En el presente estudio, el análisis de la vía de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto sugirió que estos genes se agrupaban principalmente en 2 vías, incluida la "interacción ligando neuroactivo-receptor" y la "vía de señalización MAPK". Los receptores para el reconocimiento de patrones dirigidos al b-glucano se enriquecieron en la superficie de las células inmunes (Goodridge et al., 2009). Después del reconocimiento del b-glucano, estos receptores estimularon la tirosina quinasa y el factor nuclear kappaB (NF-kappaB), lo que resultó en la inducción de la secreción de citocinas proinflamatorias y la activación de respuestas inmunes (Kankkunen et al., 2010; Masuda et al. ., 2012; Xu et al., 2016; Bode et al., 2019). La MAPK, como familia de proteínas quinasas de serina-treonina, desempeña un papel crucial en la inflamación y la producción de citoquinas en los pollos. Byun et al. (2016) demostraron que el b-glucano elevó la producción de interferón-g e interleucina -2 y desencadenó niveles significativamente mayores de fosforilación de MAPK p38 en macrófagos peritoneales. Wang y cols. (2014) informaron que el b-glucano atenúa las respuestas inflamatorias en las células THP-1 al inhibir la activación de p38 MAPK. En este estudio, se identificaron 13 DEG, incluidos DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB y EGFR, en la vía de señalización MAPK, lo que sugirió que el b-glucano podría regular la respuesta inmune. del bazo vía MAPK en pollos. La MAPK es una clase conservada de quinasas Ser/Thr en células que participan principalmente en respuestas celulares como la respuesta inmune, la apoptosis y la proliferación. La familia MAPK incluye al menos 3 subfamilias: quinasa N-terminal c-Jun (JNK), p38 MAPK y quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) (Hong et al., 2020; Zhang et al., 2021a). DUSP4 y DUSP5 son fosfatasas de doble especificidad que inhiben específicamente la actividad de los miembros de la familia MAPK, como p38, JNK y ERK, desempeñando un papel regulador importante en la prevención de la reacción inflamatoria exagerada y promoviendo la regresión de la inflamación en el cuerpo (Imasato et al. ., 2002; Talreja et al., 2021). Además, se ha informado que un pequeño ARN no codificante llamado gga-miR-200a-3p suprime la expresión de factores proinflamatorios y, por lo tanto, regula la respuesta autoinmune del huésped mediante la regulación negativa de la vía MAPK. y sus moléculas de señalización posteriores (Pham et al., 2017). En el presente estudio, el análisis RT-qPCR mostró que la expresión de ARNm de P38, JNK y ERK disminuyó y la expresión de ARNm de DUSP4 y DUSP5 aumentó en pollos alimentados con b-glucano (G70). Estos resultados sugieren que el efecto de mejora del sistema inmunológico del b-glucano (G70) en la vacuna contra la enfermedad de Newcastle puede estar relacionado con la regulación por retroalimentación negativa de los factores proinflamatorios mediados por MAPK. Además, FAS es una sustancia esencial que media en la apoptosis y es vital para la homeostasis inmune (Krueger et al., 2003; Guegan y Legembre, 2018). Mientras tanto, CACNA2 es una subunidad del canal de calcio dependiente de voltaje, que tiene un efecto promocional sobre la proliferación, migración e invasión celular (Sun et al., 2020). En este estudio, FAS y CACNA2 disminuyeron significativamente en pollos suplementados con b-glucano (G70), lo que indica que el b-glucano (G70) ejerce efectos de mejora del sistema inmunológico principalmente al inhibir la apoptosis de las células inmunitarias y equilibrar la autoinmunidad. Estos hallazgos proporcionan una referencia teórica para el uso del b-glucano (G70) como potenciador inmunológico en entornos clínicos. Sin embargo, el mecanismo por el cual el b-glucano mejora la respuesta inmune a través del efecto de retroalimentación negativa de la vía MAPK necesita más pruebas. Es interesante observar que los genes que codifican la catelicidina, que comprende CATH3, CATH1, CATH2, y los genes que codifican la b-defensina, incluidos AvBD6, AvBD7, AvBD1 y AvBD4, estaban notablemente regulados a la baja en la comparación H (vacuna del grupo G). vs. Control (Vacuna Grupal). Los péptidos de defensa del huésped (HDP) son moléculas efectoras que desempeñan un papel crucial en el sistema inmunológico innato (Cuperus et al., 2013). Estos péptidos se han descubierto en una variedad de especies animales, desde mamíferos hasta aves. Hay cuatro catelicidinas en los pollitos, que consisten en CATH1, CATH2, CATH3 y CATHB1, que matan eficazmente varias bacterias (Hamad et al., 2017). Las beta-defensinas aviares (AvBD), denominadas alternativamente gallináceas, son pequeños péptidos catiónicos con 3 enlaces disulfuro de cisteína entre sus residuos de cisteína y desempeñan un papel importante en el sistema inmunológico innato (Yoshimura, 2015). La reducción en la expresión de catelicidinas y beta-defensina posiblemente se explicó por la regulación por retroalimentación, donde las poblaciones bacterianas y parabacterianas se redujeron por los polisacáridos de la pared celular de la levadura (Bi et al., 2020). Se revelaron resultados similares en otros estudios. Shao et al. (2016) demostraron que la suplementación con b-glucano de levadura en pollos de engorde suprimió la infección por Salmonella y disminuyó la expresión de HDP mediante un análisis de PCR cuantitativo en tiempo real. En este estudio, un producto G70 compuesto principalmente de b-glucano mejoró el nivel de anticuerpos específicos del NDV en suero, aumentó el índice de estimulación del NDV de los linfocitos de sangre periférica y de los linfocitos intestinales, y promovió la diferenciación de los linfocitos T de sangre periférica en CD{{ 123}} células T. Además, el análisis de secuencia de ARN mostró que G70 regulaba positivamente las expresiones de ARNm relacionadas con el receptor de serotonina acoplado a proteína G y el polipéptido MHC de clase I y regulaba negativamente las expresiones de ARNm relacionadas con catelicidina y beta-defensina. Teniendo en cuenta el efecto potenciado del G70 sobre la vacuna ND en pollos, se puede estudiar más a fondo el efecto del G70 sobre otras vacunas avícolas, como la vacuna contra la influenza aviar.

Figura 6. Análisis de la vía KEGG.

Figura 7. Confirmación por RT-qPCR de los candidatos DEG seleccionados. Los datos se expresan como media § SE.

Figura 8. Expresión relativa de ARNm en el bazo. El ARN total se extrajo del bazo. La b-actina de pollo sirvió como gen de control interno. Los datos se expresan como media § SE.

REFERENCIAS

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