Las vesículas bacterianas bloquean la replicación viral en macrófagos a través del eje TLR4-TRIF

Abstracto

Las bacterias gramnegativas secretan naturalmente vesículas de membrana externa (OMV) de tamaño nanométrico, que son importantes mediadores de la comunicación y la patogénesis. La captación de OMV por las células huésped activa la señalización de TLR a través de PAMP transportados. Como importantes células inmunitarias residentes, los macrófagos alveolares se encuentran en la interfaz aire-tejido, donde constituyen la primera línea de defensa contra los microorganismos y partículas inhalados. Hasta la fecha, se sabe poco sobre la interacción entre los macrófagos alveolares y las OMV de bacterias patógenas. La respuesta inmune a las OMV y los mecanismos subyacentes aún son difíciles de alcanzar. Aquí, investigamos la respuesta de los macrófagos humanos primarios a las vesículas bacterianas (Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Streptococcus pneumoniae) y observamos una activación comparable de NF-κB en todas las vesículas analizadas. Por el contrario, describimos una señalización diferencial de IFN tipo I con fosforilación prolongada de STAT1 y una fuerte inducción de Mx1, que bloquea la replicación del virus de la influenza A solo para las OMV de Klebsiella, E. coli y Salmonella. Los efectos antivirales inducidos por OMV fueron menos pronunciados para los OMV Clear coli libres de endotoxinas y para los OMV tratados con polimixina. La estimulación con LPS no pudo imitar este estado antiviral, mientras que la eliminación con TRIF lo anuló. Es importante destacar que el sobrenadante de macrófagos tratados con OMV indujo una respuesta antiviral en las células epiteliales alveolares (AEC), lo que sugiere comunicación intercelular inducida por OMV. Finalmente, los resultados se validaron en un modelo de infección ex vivo con tejido pulmonar humano primario. En conclusión, las OMV de Klebsiella, E. coli y Salmonella inducen inmunidad antiviral en macrófagos mediante señalización TLR4-TRIF para reducir la replicación viral en macrófagos, AEC y tejido pulmonar. Estas bacterias gramnegativas inducen inmunidad antiviral en el pulmón a través de OMV, con un impacto tremendo y potencialmente decisivo en los resultados de la coinfección bacteriana y viral.

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Palabras clave

Vesículas extracelulares, Vesículas de membrana externa, Coinfección bacteriana y viral, Neumonía, Macrófagos, Célula epitelial alveolar, Inmunidad antiviral innata

Introducción

Las vesículas de la membrana externa (OMV) son liberadas naturalmente por bacterias gramnegativas, que miden hasta 300 nm de diámetro. Las bacterias grampositivas son igualmente capaces de liberar vesículas de membrana (MV). Como resultado de su biogénesis, estas estructuras de membrana de bicapa lipídica contienen, además del contenido periplásmico, componentes importantes de la membrana bacteriana (externa), como lípidos, proteínas y, en el caso de bacterias gramnegativas, lipopolisacáridos (LPS). [1]. Además de su papel en la comunicación bacteriana, las OMV se han asociado con efectos patógenos y el transporte de factores de virulencia, por ejemplo, VacA de Helicobacter pylori, la toxina Shiga de Shigella Dysenteriae o ClyA de Escherichia coli enterohemorrágica [2]. Se demostró que estas OMV manipulan las respuestas inmunitarias y de células epiteliales. La presencia de endotoxina bacteriana en la superficie de las OMV junto con otros patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) transportados las convierte en potentes estimuladores de las células inmunitarias, ya que aún pueden ser reconocidas por sus respectivos receptores [3]. La participación de los receptores tipo Toll (TLR) y los receptores tipo Nod en las células inmunes innatas puede desencadenar la liberación de citoquinas proinflamatorias e inmunorreguladoras, incluido el reclutamiento de neutrófilos o la alteración de las uniones estrechas en las capas de células epiteliales [4]. Un tipo importante de células inmunitarias residentes en el pulmón son los macrófagos alveolares (MA), que residen en la interfaz aire-tejido de los alvéolos. A través de la ingestión de partículas inhaladas, los MA representan la primera línea de defensa contra microorganismos y partículas por fagocitosis y degradación. Tras el encuentro con un patógeno, los macrófagos presentan antígenos a las células inmunitarias adaptativas y liberan citocinas proinflamatorias. De este modo, pueden actuar sobre las células epiteliales alveolares (AEC) de tipo I y II y otras células inmunitarias (archivo adicional 1: Fig. S1A). Los AM pueden ser activados por varios PAMP para inducir la señalización intracelular y la inducción de distintos patrones de expresión genética a través de diversos receptores inmunes [5, 6], lo que lleva a la señalización MyD88 o TRIF, que, a su vez, inducen diferentes subconjuntos de genes (archivo adicional 1). : Figura S1B). Además, cumplen otras funciones en la homeostasis y patogénesis pulmonar, lo que los convierte en un centro central de señalización y orquestador de la inmunidad pulmonar. Los virus de la influenza pertenecen a la familia Orthomyxoviridae y causan infecciones del tracto respiratorio superior e inferior, que van desde casos leves hasta casos graves. Si bien la mayoría de las infecciones por el virus de la influenza estacional son autolimitadas, algunos pacientes desarrollan neumonía y síndrome de dificultad respiratoria aguda que se estima que resulta en hasta 650000 muertes anuales en todo el mundo [7]. El virus de la influenza A (IAV) infecta principalmente las células epiteliales de las vías respiratorias y se replica en ellas. La infección viral conduce a la activación y señalización del receptor de reconocimiento de patrones (PRR) a través de varios factores de transcripción, a saber, el factor nuclear kappa B (NF-κB) y el factor regulador de interferón (IRF)-3/7, que inducen los tipos I y III. producción de interferones (IFN). En consecuencia, esta destacada respuesta de IFN induce un "estado antiviral" celular de forma auto y paracrina [8]. Además, tras la infección se secretan varias otras citocinas y quimiocinas. Esta red de citoquinas de defensa del huésped, estrechamente regulada, recluta poblaciones de células inmunitarias en el sitio de la infección y organiza respuestas inmunitarias innatas y adaptativas [9]. Sin embargo, el IAV también puede infectar a los AM, lo que resulta en una cantidad drásticamente reducida de AM durante la infección aguda, que deben restablecerse para resolver la infección. La activación de las células inmunes innatas y la secreción de citoquinas proinflamatorias conducen al reclutamiento de células innatas adicionales, controlando la infección e inicializando la reparación del tejido [10, 11]. Aquí, analizamos la respuesta de los macrófagos a las vesículas extracelulares bacterianas y su impacto en la infección posterior por IAV.

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material y métodos

Productos químicos y anticuerpos.

El medio Ham's F12 se obtuvo de GE Healthcare Europe (Friburgo, Alemania). RPMI-1640, DMEM, GlutaMAX, penicilina/estreptomicina y FCS se adquirieron de Life Technologies (Darmstadt, Alemania). PBS fue adquirida de Capricorn Scientific GmbH (Ebsdorfergrund, Alemania). Opti-MEM se obtuvo de Thermo Fisher Scientific (Frankfurt, Alemania). Sigma-Aldrich Chemie (Munich, Alemania) suministró forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). El LPS (Salmonella Minnesota R595, grado TLR) se obtuvo de Enzo Life Sciences (Lausen, Suiza). Pam3CSK4 se adquirió de Invivogen (San Diego, EE. UU.). El inhibidor de JAK, Ruxolitinib, se obtuvo de Biozol Diagnostics Vertrieb GmbH (Eching, Alemania). La polimixina B se adquirió de Merck Millipore (Billerica, EE. UU.). Los anticuerpos se obtuvieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido): Mx1 (ab95926), nucleoproteína de influenza (9G8); Señalización celular (Cambridge, Reino Unido): fosfo-IRF-3 (Ser396)(4D4G), fosfo-TBK-1 (Ser172)(D52C2), TBK-1 (61223S), fosfo- STAT1 (Tyr)(58D6), STAT1 (D1K9Y), anti-conejo de ratón (L27A9), IRAK-1 (4359S), fosfo-p38 (Tr180/Tyr182)(9211S), p38 (9212S); Thermo Fisher Scientific: anti-ratón de cabra (Alexa para 488); ProteinTech: anti-IRF-3 (66670-1) o Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Alemania): -actina (C4), anti-ratón (mIgGκBPHRP, sc-516102). Todos los demás productos químicos aplicados eran de calidad analítica y se adquirieron de fuentes comerciales.

Cultivo bacteriano y preparación OMV/MV.

La cepa de L. pneumophila Corby wildtype se manejó como se describió anteriormente [12]. K. pneumoniae (#700721/ MGH78578), E.coli (#25922) y S. enterica serovar Typhimurium (#14028) se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD, EE. UU.). ClearColi™ BL21 era de BioCat GmbH (Heidelberg, Alemania). S. pneumoniae D39 Δcps fue proporcionado amablemente por Sven Hammerschmidt. Las bacterias se cultivaron en placas de agar durante la noche (MacConkey: Kp, Ec, Sal; LB: Clear coli; placas de agar sangre: Sp) y luego se usaron para inocular medios líquidos (LB: Kp, Ec, Sal, Clear coli; THY: Sp) . Las bacterias se cultivaron hasta la fase logarítmica tardía a 37 grados bajo agitación constante (MaxQ 6000, Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Alemania; excepto Sp). Luego, los cultivos bacterianos se centrifugaron tres veces (4500 xg, 15 min, 4 grados; Multifuge X3R, Thermo Fisher Scientific). Las bacterias restantes se eliminaron mediante filtración estéril a través de poros de 0,22 µm. El sobrenadante se concentró con filtros de corte de peso molecular de 100 kDa (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y las vesículas se purificaron mediante ultracentrifugación o mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Para la ultracentrifugación, el sobrenadante se ultracentrifugó a 100.000 xg, 3 h, 4 grados. Después de lavar el sedimento de OMV/MV obtenido con PBS estéril, se repitió la ultracentrifugación y el sedimento de vesículas se disolvió en PBS estéril. El contenido de proteína se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher Scientific), y se usaron cantidades iguales de proteína para los experimentos de estimulación. Para la SEC, el sobrenadante se concentró a 500 µl y se cargó en columnas originales/Gen 2 de 70 nm (IZON Science LTD, Lyon, Francia), que se lavaron previamente con 10 ml de PBS según el protocolo del fabricante. Las vesículas se eluyeron usando PBS estéril y se recogieron fracciones de 500 µl. Las vesículas se eluyeron en las fracciones 7 a 12, que se determinaron mediante citometría de nanoflujo (nFCM; NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, Reino Unido). Las fracciones agrupadas que contenían vesículas se concentraron a 200–400 µl utilizando filtros de corte de peso molecular (Merck KGaA). La concentración de vesículas de todas las preparaciones se determinó mediante nFCM y se utilizaron cantidades iguales de vesículas para los experimentos de estimulación. Se verificó la preparación de OMV/MV de ambos métodos de purificación para detectar bacterias contaminantes mediante siembra en placas y almacenamiento en alícuotas a -20 grados.

NFC

Para nFCM, se calibró un nanoanalizador (NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, Reino Unido) equipado con un láser de 488 nm con perlas de poliestireno de 200 nm (NanoFCM Co.) con una concentración definida de 2,08×10^8 partículas/ml y también se utiliza como referencia para la concentración de partículas. Además, se utilizaron perlas de sílice monodispersas (NanoFCM Co.) de cuatro tamaños diferentes como estándar de referencia de tamaño para calibrar el tamaño de las vesículas. Se analizó 1xPBS recién filtrado (0,1 µm) como señal de fondo y se restó de las otras mediciones. Cada histograma de distribución o diagrama de puntos se derivó de los datos recopilados durante 1 minuto con una presión de muestra de 1 kPa. Las muestras de OMV se diluyeron con 1xPBS filtrado (0,1 µm), lo que dio como resultado recuentos de partículas en el rango óptimo de 2500 a 12000 eventos. La concentración de partículas y la distribución de tamaño se calcularon utilizando el software nFCM (NF Profession V1.08).

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Las rejillas de cobre recubiertas de carbono (malla 400) se hidrofilizaron mediante descarga luminosa (PELCO easiGlow, Ted Pella, EE. UU.). Se aplicaron cinco µL de muestras sobre las rejillas hidrofilizadas y se tiñeron con acetato de uranilo al 2% (p/v) después de un breve paso de lavado con agua bidestilada. Las muestras se analizaron con un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-2100 utilizando un voltaje de aceleración de 120 kV. Las imágenes se adquirieron con una cámara CCD FastScan F214 (TVIPS, Gauting, Alemania).

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Cultivo de células

Las líneas celulares humanas (THP-1, A549, BEAS2B, Calu-3, HCC827) se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Las células Madin-Darby Canine Kidney II (MDCK II) se adquirieron de ECACC-Sigma-Aldrich (Darmstadt, Alemania). Las células THP-1 Dual™ (Dual) y THP-1 Dual™ TRIF-KO (TRIF-/-) ​​se adquirieron de Invivogen Europe (Toulouse, Francia). Las células se cultivaron en Ham's F12, DMEM o RPMI-1640 suplementado con piruvato de sodio 1 mM, glutamina 2 mM y FCS al 10% inactivado por calor en condiciones de cultivo celular. Se cultivaron células THP-1 Dual™ en RPMI-1640 suplementado con 1 % de penicilina/estreptomicina, 2 mM de glutamina, 10 % de FCS inactivado por calor, 100 µg/ml de Normocin™ y tampón HEPES 25 mM. Las células THP-1, Dual y TRIF-/- se diferenciaron en células similares a macrófagos mediante la adición de PMA 20 nM durante 24 h.

Clonación de Mx1 en vector SparQ

La secuencia codificante de Mx1 se generó a partir del ADNc de THP-1 mediante Phusion PCR usando ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England Biolabs, Ipswich, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se agregó una etiqueta HA fusionando la secuencia codificante de HA con el cebador inverso (sentido: 5′-atcggaTTCGAAATGGTTGTT TCCGAAGTGGAC-3′, antisentido: 5′-tccgatGCGGCC GCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAA CCGGGGAACTGGGCAAG-3′). El fragmento de PCR así como el vector SparQ (Addgene, Watertown, EE. UU.) se digirieron con las enzimas de restricción BstbI y NotI (Thermo Fisher Scientific) y se ligaron con ADN ligasa T4 (New England Biolabs) en el vector SparQ.

Transfección de células HEK293T y producción de lentivirus.

Las células HEK293T se transfectaron con el vector SparQ diluido en Opti-MEM que contiene la secuencia de Mx1 y una secuencia de GFP, el vector de empaquetamiento viral psPAX2 y el plásmido de envoltura pVSV-G (Addgene) con Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) según el protocolo del fabricante. Se produjo lentivirus y se recogió el sobrenadante que contenía el virus todos los días durante 72 h. El sobrenadante se filtró usando un filtro de 0,45 µm y se transdujeron células THP-1 (ver más abajo). Se usó un vector SparQ vacío sin una secuencia Mx1 para la transducción de células para generar una línea celular de control correspondiente (control de vector VC=).

Transducción de células THP-1

Se transdujeron células THP-1 con el lentivirus del sobrenadante filtrado del cultivo de células HEK293T (ver arriba). Se añadió polibreno (4 µg/ml, Sigma-Aldrich) para mejorar la eficacia de la transducción. Las células se incubaron hasta por seis días. Las células positivas para GFP se clasificaron mediante citometría de flujo.

Aislamiento y diferenciación de BDM.

Los monocitos humanos de donantes sanos se aislaron mediante selección magnética positiva para CD14 de células mononucleares de sangre periférica y se diferenciaron en macrófagos derivados de la sangre (BDM) en presencia de suero AB humano al 1% como se describió anteriormente [13].

Estimulación OMV/MV de macrófagos.

Se incubaron macrófagos humanos primarios o células THP-1 diferenciadas con OMV/MV purificadas (1 µg/ml cada una para vesículas purificadas mediante ultracentrifugación y una multiplicidad de vesículas (MOV) de 1,000 para células purificadas por SEC. vesículas) por hasta 20 h en medio completo. La aplicación adicional de inhibidor se realizó 1 h antes del tratamiento con vesículas. Los macrófagos estimulados con Te se utilizaron para el aislamiento de proteínas o ARN o para experimentos de infección posteriores. El sobrenadante que contenía citoquinas obtenido se usó para análisis ELISA o LDH o se filtró de forma estéril y se usó para estimulación de células epiteliales.

Purificación de virus y titulación de virus.

La purificación y titulación del virus se realizaron en células MDCK II como se describió anteriormente [14]. El título viral se determinó mediante ensayo de placa como se describió anteriormente [15]. Brevemente, se infectaron células MDCK II confluentes con un virus diluido en serie o sobrenadante de tejido (en un medio de cultivo MDCK II sin FCS). Se dejó que el virus se adsorbiera en las células durante 1 hora a 37 grados. Diez, el inóculo se reemplazó con medio nuevo (complementado con 1 ug/ml de tripsina tratada con TPCK (para IAV) y Avicel® PH-101 al 1 % (Sigma-Aldrich)). Las células MDCK II se tiñeron con cristal violeta o las células infectadas por virus se tiñeron con anticuerpo primario (1:2,000) (nucleoproteína A anti-influenza de ratón, MCA400, Bio-Rad, Alemania) y el anticuerpo secundario ( 1:4,000) (Goat Anti-Mouse IgGHRP, 170–6516, Bio-Rad, Alemania) para el ensayo de placa. Las placas se contaron manualmente y se expresaron como unidades formadoras de placas (ufp) por ml.

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Contagio de virus

Después de 20 h de estimulación previa con vesículas bacterianas o sobrenadante que contenía citocinas, las células se infectaron con IAV o virus de la estomatitis vesicular (VSV). Los macrófagos se infectaron con H1N1 (A/WSN/33) o VSV, mientras que las células epiteliales se infectaron con H1N1 (A/Hamburg/2009/PDM), ambos en medios frescos sin FCS. Después de 1 h de inoculación, se eliminó el virus libre y se reemplazó el medio con medio que contenía tripsina TPCK para IAV o medio en blanco para VSV. Las células se incubaron durante hasta 48 horas para permitir la replicación multicíclica.

Preparación de PCLS humano.

El tejido pulmonar se adquirió de pacientes que se sometieron a resección del lóbulo debido a cáncer de pulmón en la Facultad de Medicina de Hannover (MHH, Hannover, Alemania). Para los experimentos sólo se utilizó tejido de partes del pulmón macroscópica y microscópicamente libres de enfermedades. Se prepararon cortes de pulmón humano cortados con precisión (PCLS) como se describió anteriormente [16]. Se cultivaron dos cortes de tejido por pocillo en una placa de pocillos 24-en condiciones sumergidas (DMEM/F12 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1%) a 37 grados y CO2 al 5% durante la noche.

Infección por IAV de PCLS

Los PCLS se estimularon con 1 µg/ml de OMV purificadas de L. pneumophila o K. pneumoniae diluidas en DMEM/F12 suplementado con 1 % de penicilina/estreptomicina a 37 grados, 5 % de CO2 durante 20 h. Se retiró el medio y se inocularon PCLS con 25,{8}} ufp/pocillo en 250 µl de virus de la influenza A/California/04/2009(H1N1pdm). Los PCLS se incubaron a 35 grados y se agitaron cada 15 minutos durante la inoculación para permitir una infección viral homogénea. Posteriormente, el inóculo se descartó y se reemplazó por DMEM/F12 suplementado con Penicilina/Estreptomicina al 1%. Después de una incubación de 48 h, se recogió el sobrenadante para la detección del virus, la liberación de LDH y la cuantificación de citocinas. Las muestras para las mediciones de citoquinas se complementaron con un cóctel de inhibidor de proteasa al 0,2% (P1860, Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) y se almacenaron a 80 grados hasta el análisis. Los PCLS se congelaron y almacenaron a 80 grados hasta la purificación del ARN como se describió anteriormente [17].

LDH

El ensayo de liberación de LDH se realizó según las instrucciones del fabricante utilizando el kit de ensayo de citotoxicidad de LDH Pierce™ obtenido de Roche (Mannheim, Alemania) o el kit de detección de citotoxicidadPLUS (LDH) (Roche, Merck). La absorbancia se midió utilizando un lector de microplacas infinito F200Pro (Tecan, Männedorf, Suiza).

ELISA

Las citoquinas CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10 e IL-1 se cuantificaron a partir de sobrenadante libre de células usando kits ELISA disponibles comercialmente (R&D Systems, Wiesbaden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. instrucciones.

Ensayo QUANTI‑blue™

Para determinar la actividad indicadora de SEAP en el sobrenadante de cultivo celular de THP-1 Dual™ y las células TRIF-/- correspondientes, se realizó el ensayo QUANTI-Blue™ según el protocolo del fabricante. Brevemente, se recogió el sobrenadante del cultivo celular después de la estimulación de las células con OMV. En primer lugar, se dispensaron la solución QUANTI-Blue™ y el sobrenadante del cultivo celular en una placa de pocillos 96- de fondo grueso. Después de la incubación a 37 grados durante 150 min, se determinó la densidad óptica a 630 nm en un lector de microplacas infinito F200Pro.

Ensayo QUANTI‑luc™

Para determinar la actividad indicadora de Lucia luciferasa en el sobrenadante de cultivo celular de THP{{0}} Dual™ y las células TRIF-/- correspondientes, se realizó el ensayo QUANTI-Luc™ según el protocolo del fabricante. Brevemente, el sobrenadante del cultivo celular se dispensó en una placa de pocillos 96- con fondo de grasa blanca (BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, Alemania). Se añadió la solución de ensayo QUANTI-Luc™ y se realizó inmediatamente la medición de la luminiscencia con un tiempo de lectura de 0,1 s en un lector de microplacas infinito F200Pro.

mancha occidental

Para la determinación de la expresión o fosforilación de proteínas, se realizó Western Blot como se describió anteriormente [18].

Preparación de ARN y PCR en tiempo real

Para el análisis de la expresión génica, el aislamiento del ARN se llevó a cabo mediante extracción con fenol-cloroformo y se transcribió de forma inversa como se describió anteriormente [12]. Luego se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real en un ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) con Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs) y pares de cebadores específicos. Utilizando el método 2-ΔΔCT [19], se calculó la inducción x veces y los resultados se normalizaron para las células de control correspondientes. 18S: hacia delante: 5′-GACTCTTTCGAGGCCCTGTA-3′, hacia atrás: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3′ CXCL8: hacia adelante: 5′-ACTGAGAGTGATTGAGAG TGGAC-3′, hacia atrás: 5′-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC{ {20}}′ IFI44: avance: 5′-TATCCAGACAGAGCAGCTACC-3′, retroceso: 5′-ATAGAGAAGGCTAAGCCGCTTC-3′ IFIT1: avance: 5′-ATGCAGGAAGAACATGACAACC-3′, retroceso: 5 ′-TCTGGACACTCCATTCTATAGCG-3′ IFNA1: adelante: 5′-ACAGGAGGACCTTGATGCTC-3′, rev: 5′-TCTGCTGGATCAGCTCATGG-3′ IFNB: adelante: 5′-AACATGACCAACAAGTGTCTCC-3′ , rev: 5′-TGTCCTTGAGGCAGTATTCAAG-3′ IL1B: adelante: 5′-AGCTCGCCAGTGAAATGATGG-3′, rev: 5′-CAGGTCCTGGAAGGAGCACTTC-3′ IL12B: adelante: 5′-GCCCAGAGCAAGATGTGTCA{{ 58}}′, rev: 5′-CACCATTTCTCCAGGGGGCAT-3′ Mx1: adelante: 5′-GGGCTTTGGAATTCTGTGGC-3′, rev: 5′-CCTTGGAATGGTGGCTGGAT-3′ NP: adelante: 5' -GAAATTTCAAACAGCTGCACAAAG -3′, rev: 5′-AATATGAGTGCAGACCGTGC-3′ RPS18: adelante: 5'-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3′, rev: 5′-GATCACACGTTCCACCTCATC-3′

inmunofluorescencia

Las células THP{{0}} se diferenciaron en cubreobjetos mediante la adición de PMA 20 nM y se incubaron con OMV/MV durante 20 h. Posteriormente, las células se infectaron con H1N1 (A/WSN/33; la multiplicidad de infección (MOI) 0,1) durante 4 h. Después de 15 minutos de fijación con paraformaldehído al 3%, los portaobjetos se lavaron tres veces con PBS y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2% en TBS (10 min, temperatura ambiente). Después del bloqueo (BSA al 1 % en TBS/Tritón X al 0,2 %), las células se incubaron con anticuerpo -NP (1:250, en solución de bloqueo). El anticuerpo secundario (1:1000) junto con DAPI (1:2000) se incubó durante 1 h en la oscuridad. Los cubreobjetos montados se analizaron en un microscopio de fluorescencia (AxioVision, Zeiss, Jena, Alemania).

Declaración ética

Los experimentos con cortes de tejido pulmonar humano fueron aprobados por el comité de ética de la Facultad de Medicina de Hannover (MHH, Hannover, Alemania) y cumplen con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (número 2701-2015). Todos los pacientes o sus familiares dieron su consentimiento informado por escrito para el uso de tejido pulmonar para la investigación. Todos los donantes de sangre dieron su consentimiento informado por escrito (Número de aprobación ética: 161/17).

Fig. 1 Caracterización de vesículas bacterianas y respuesta en macrófagos humanos. A Separación de vesículas extracelulares bacterianas de proteínas libres mediante cromatografía de exclusión por tamaño de diferentes sobrenadantes bacterianos (Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Sal) y Streptococcus pneumoniae (Sp) ). La concentración de vesículas en cada fracción se determinó mediante citometría de nanoflujo (nFCM) y las proteínas se cuantificaron mediante BCA. B Las distribuciones de tamaño de vesícula de OMV/MV purificadas se determinaron mediante NFC. Imágenes C TEM de OMV/MV purificadas. Barra de escala=50 nm. Los BDM D – G se estimularon con OMV/MV (1 µg/ml cada uno) de diferentes bacterias o se dejaron sin tratar para el control durante hasta 48 h. La liberación de D CXCL8 se determinó mediante ELISA y se representa en ng/ml. La expresión de IL1B (E) e IL12B (F) se determinó mediante qPCR, los resultados se normalizan para RPS18 y se representan en relación con las células de control no tratadas. G Después de 1 h de incubación con vesículas bacterianas, se determinó mediante Western Blot la expresión y fosforilación de IRAK-1, p38 y TBK-1. Se muestran resultados representativos de cuatro réplicas biológicas independientes. Las barras representan valores medios + SEM de tres (B) a cuatro (D – F) experimentos independientes. Estadísticas: 2-way ANOVA (DF); *pag<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; ns=not significant; n=3–4

Estadísticas

Los datos se muestran como valores medios + SEM para al menos tres experimentos biológicamente independientes. Se utilizó Prism 6.07 (GraphPad, La Jolla, EE. UU.). Las pruebas ANOVA de una o dos vías se realizaron para muestras no apareadas. Los valores de p inferiores o iguales a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Si no se indica lo contrario, se realizaron pruebas vs. control correspondiente (*).

Disponibilidad de datos y materiales.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo y su archivo complementario.

Resultados

Activación proinflamatoria de macrófagos por OMV/MV

Para probar la respuesta inmune innata de los macrófagos primarios derivados de la sangre (BDM) humanos a OMV/MV de diferentes bacterias, vesículas de Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Sal ) y Streptococcus pneumoniae (Sp) se aislaron mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC). Las fracciones se analizaron para determinar el número de vesículas mediante citometría de nanoflujo (nFCM) y la presencia de proteínas mediante BCA (Fig. 1A). Se combinaron vesículas de las fracciones 7 a 12 y se utilizaron para experimentos. Los OMV/MV tenían un perfil de distribución de tamaño comparable (Fig. 1B), no diferían en el tamaño promedio (archivo adicional 1: Fig. S2A), se concentraban por igual (archivo adicional 1: Fig. S2B) y se visualizaban mediante transmisión de electrones. microscopía (TEM; Fig. 1C). Los BDM se estimularon con OMV/MV durante hasta 48 h, correspondientes a concentraciones iguales de vesículas de las diferentes bacterias (archivo adicional 1: Fig. S2C). La incubación de BDM con vesículas no fue citotóxica (archivo adicional 1: Fig. S2D). Los OMV/MV indujeron ampliamente la expresión y liberación de CXCL8 de los macrófagos (archivo adicional 1: Fig. S3A y 1D), mientras que la inducción del ARNm de IL1B e IL12B dependió del tiempo y de la especie (Fig. 1E+F). La liberación de IL-1 dependía de las especies de las que se aislaron las vesículas bacterianas (archivo adicional 1: Fig. S3B). Aunque la fosforilación de p38 fue comparable en BDM después de 1 h de incubación de vesículas, solo las OMV de bacterias gramnegativas indujeron la degradación de IRAK-1 y la fosforilación de TBK-1, pero no las MV de bacterias grampositivas (Fig. .1G y archivo adicional 1: S4A-D).

Fig. 2 Las vesículas extracelulares bacterianas activan la respuesta al interferón tipo I en los BDM. Los BDM se estimularon con OMV/MV (1 µg/ml cada uno) de diferentes bacterias o se dejaron sin tratar como control. Se determinó la fosforilación y expresión de IRF-3 después de 1 h de incubación de OMV/MV mediante Western Blot. Se muestra el resultado representativo de tres réplicas biológicamente independientes. La expresión de IFNA1 (B), IFNB (C), IFIT1 (E) e IFI44 (F) se midió mediante qPCR, los resultados se normalizaron a RPS18 y se representan en relación con las células de control no tratadas. D La fosforilación de STAT1 se determinó mediante Western Blot después de 2 h de estimulación con OMV/MV. Se muestra el resultado representativo de cuatro réplicas biológicas independientes. G La fosforilación de STAT1 y la expresión de Mx1 se determinaron mediante Western Blot después de 20 h de estimulación de vesículas bacterianas. Se representan resultados representativos de cuatro réplicas biológicas independientes. Las barras representan valores medios + SEM de cuatro experimentos independientes. Estadísticas: 2-way ANOVA; *pag<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=4

Además de la activación de NF-κB y AP-1 y sus objetivos posteriores, la señalización de PRR puede conducir a la activación de IRF. Así, se determinó la fosforilación de IRF-3. Kp/Ec/SalOMV aumentaron la fosforilación de IRF-3 en BDM (Fig. 2A), lo que resultó en la expresión de IFN I (Fig. 2B+C), fosforilación aguas abajo de STAT1 (Fig. 2D y archivo adicional 1: S4E) e inducción de genes estimulados por interferón (ISG; IFIT1, IFI44 y Mx1; Fig. 2E-G). Como los eventos de fosforilación suelen ser de corta duración y se sabe que desempeñan un papel fundamental en la activación y desactivación de las cascadas de señalización inmunitaria, también se examinó la fosforilación de STAT1 20 h después de la adición de Kp/Ec/SalOMV (Fig. 2G y archivo adicional 1: S4F+G). Los experimentos demostraron que las OMV no solo activan la señalización proinflamatoria en los macrófagos sino que también inducen la señalización antiviral.

La preincubación de OMV altera la replicación de IAV en macrófagos

Mx1 es un factor antiviral bien conocido que inhibe la replicación del IAV [20], que se expresó durante el tratamiento de macrófagos con Kp/Ec/SalOMV. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el tratamiento previo con OMV altera la replicación viral. Los experimentos de infección por IAV se realizaron en células THP-1, que expresan niveles similares de Mx1 tras el tratamiento con Kp/Ec/SalOMV en niveles de ARNm y proteína (archivo adicional 1: Fig. S5A+B) e inducen la fosforilación de STAT1. , mientras que la proteína STAT1 total permanece estable (archivo adicional 1: Fig. S5C), con una cepa H1N1 (A/WSN/33) que infecta y se replica en macrófagos [21]. La estimulación previa de células THP-1 con LpOMV/SpMV aumentó la replicación del IAV 24 h después de la infección (pi) en comparación con el control infectado (–-), mientras que el tratamiento previo con OMV inductoras de Mx1- (Kp /Ec/Sal) bloqueó la replicación del IAV (Fig. 3A). Si bien el tratamiento previo con Pam3CSK4, agonista de TLR2/1, podría imitar el efecto observado con LpOMV/SpMV, ambos conocidos por enviar señales a través de TLR2/1 [12, 22, 23], el LPS soluble como agonista de TLR4 no reprodujo la Kp/Ec. / Efecto SalOMV (archivo adicional 1: Fig. S5D). También se pudieron observar diferencias en la carga de IAV después del tratamiento previo mediante tinción de inmunofluorescencia contra la nucleoproteína viral (NP) (Fig. 3B). El tratamiento previo con Kp/Ec/SalOMV bloqueó la replicación del IAV y el área positiva para NP se redujo significativamente (Fig. 3C). Esto no se pudo observar después del pretratamiento con LpOMV/SpMV. Para investigar si la inducción de Mx1 es suficiente para la replicación bloqueada de IAV observada, Mx1 se sobreexpresó de manera estable (sexo) en macrófagos THP-1 para imitar la preestimulación de OMV (archivo adicional 1: Fig. S5E). La infección por IAV de células Mx1oex dio como resultado una reducción del área positiva para NP inmunofluorescente 4 h pi (Fig. 3D) y una replicación viral reducida 6 h pi en comparación con un control de vector vacío (VC) (Fig. 3E), aunque en menor medida. grado en comparación con la preestimulación OMV (Fig. 3A). En conclusión, Kp/Ec/SalOMV activó los macrófagos de una manera proinflamatoria clásica e indujo genes antivirales que resultaron en la activación del receptor de IFN-/ (IFNAR), la fosforilación posterior de STAT1 y la expresión de Mx1, que pueden interferir directamente con la replicación del IAV ( Figura 4A). Para confirmar la importancia de la señalización JAK/STAT para la inducción observada de la respuesta antiviral, se aplicó un inhibidor de JAK (JAKi) antes de la estimulación de las vesículas. La inhibición de JAK no cambió la expresión de CXCL8 inducida por Kp/SalOMV (Fig. 4B), pero redujo significativamente Mx1 en el ARNm (Fig. 4C) y el nivel de proteína incluso tras la infección por IAV (Fig. 4D y archivo adicional 1: S6A). En consecuencia, JAKi revirtió el bloqueo de replicación viral inducido por OMV (Fig. 4E).

Fig. 3 Las OMV que inducen Mx1- bloquean la replicación del virus de la influenza A en células THP-1. Una replicación del virus de la influenza A en células THP-1 diferenciadas. Las células se trataron previamente con OMV/MV (1 µg/ml cada una) o se dejaron sin tratar para el control (–). Después de 20 h de pretratamiento, las células se infectaron con A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) durante 24 y 48 h. La replicación del IAV se determinó mediante qPCR contra IAV-NP normalizado a 18S. Se muestran los valores medios ± SEM de tres a cinco experimentos independientes. B Las células THP-1 diferenciadas se trataron previamente con OMV/MV (1 µg/ml cada una) o se dejaron sin tratar para el control (–). Después de 20 h de preincubación, las células se infectaron con A/WSN/33(H1N1) (MOI 0,1) durante 4 h. Después de la fijación, las células se tiñeron con un anticuerpo NP de influenza (amarillo) y DAPI (azul). Se muestra un resultado representativo de cuatro experimentos biológicos independientes. C Cuantificación del área NP positiva (NP+) de (B). Las barras representan valores medios de cuatro experimentos independientes + SEM. Las células D THP-1 que sobreexpresan establemente Mx1 (Mx1oex) y las células de control de vector vacío (VC) se infectaron con el virus de la influenza A/WSN/33(H1N1) (MOI 0,1) durante 4 h. Después de la fijación y tinción de inmunofluorescencia con -influenza NP, se cuantificó el área NP+ y se representa en relación con las células VC. Las barras muestran valores medios de cuatro experimentos independientes + SEM. Las células E Mx1oex y VC se infectaron con A/WSN/33(H1N1) (MOI 0,001) durante 6 h. La replicación viral se determinó mediante un ensayo de placa y los resultados se representan como unidades formadoras de placa (ufp) por ml. Las barras representan valores medios + SEM de cuatro experimentos independientes. Estadísticas: 2-ANOVA de vía (A), 1-ANOVA de vía (C), prueba t no apareada (D+E); *pag<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=3–5

La respuesta antiviral a las OMV depende de TLR4‑TRIF

Para identificar el PRR involucrado, se aplicaron agonistas inmunes comerciales solos o en combinación con LPS para imitar los OMV. Sin embargo, no se observó una inducción reflejada de Mx1 con KpOMV (archivo adicional 1: Fig. S7), lo que sugiere una activación diferencial y prolongada de macrófagos por parte de OMV debido a su composición de ligando o presentación espacial a PRR. Los receptores inmunes involucrados fueron evaluados adicionalmente por células indicadoras THP-1 para la señalización de NF-κB e IRF (Fig. 5A). Tras el tratamiento con KpOMV, las células THP-1 mostraron una expresión significativamente mayor de la proteína Mx1 (Fig. 5B y archivo adicional 1: S6B), que se perdió en las células THP-1 deficientes en TRIF (TRIF-/-) ​​( Fig. 5B y archivo adicional 1: S6B). Lo mismo se observó para el indicador IRF (Fig. 5C), mientras que la activación del indicador NF-κB y la inducción de CXCL8 fueron altas tanto en las células THP-1 como en las TRIF-/- tras la estimulación (Fig. 5D+E). La expresión de los genes IFIT1, IFI44 y Mx1 dependientes de STAT se indujo tras la estimulación con KpOMV en células informadoras THP-1 (Fig. 5E), mientras que se redujo significativamente en células TRIF-/- igualmente estimuladas (Fig. 5E). La infección adicional por IAV después de la estimulación previa resultó en una disminución de la replicación viral, mientras que la eliminación de TRIF rescató la replicación de IAV (Fig. 5F). Para investigar si los KpOMV provocan una respuesta antiviral general en los macrófagos, las células se infectaron con el virus de la estomatitis vesicular (VSV), que se replicaba en las células de control, pero se bloqueaba en las células pretratadas con KpOMV y también podía rescatarse mediante la eliminación de TRIF (Fig. 5G). Dado que el reconocimiento de LPS a través de TLR4 es esencial para la endocitosis y la activación de TRIF, el LPS en la superficie de OMV fue neutralizado por el antibiótico lipopéptido Polimixina B (PB), lo que resultó en una disminución del 50 % en la inducción de Mx1 (Fig. 6A+B y archivo adicional 1). : S6C), pero no hay diferencias significativas en la transcripción CXCL8 dependiente de NF-κB (Fig. 6C). La replicación viral se rescató al nivel basal tras la estimulación previa con KpOMV + PB (Fig. 6D). Como la inhibición del reconocimiento de LPS por parte de PB fue insuficiente para bloquear completamente Mx1, se aislaron OMV de Clear coli (Cc) libres de endotoxinas y se usaron para la preestimulación. Cc expresa un lípido A alterado y no puede inducir un complejo TLR4/MD2 activado [24]. Los CcOMV no indujeron Mx1 (Fig. 6A+B y archivo adicional 1: S6C) y no redujeron la replicación de IAV en macrófagos (Fig. 6D). Es bien sabido que el aislamiento de vesículas extracelulares mediante ultracentrifugación diferencial da como resultado el aislamiento conjunto de contaminantes (por ejemplo, proteínas o apéndices de células bacterianas) junto con las vesículas. De acuerdo con las directrices de MISEV2018 [25], se repitieron experimentos clave con OMV aisladas mediante una combinación de ultrafiltración (UF) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). La estimulación de las células informadoras THP-1 con KpOMV purificados por UF-SEC dio como resultado la inducción de Mx1 (archivo adicional 1: Fig. S8A) y el informador IRF (Fig. S8B), mientras que se perdió en los macrófagos TRIF-/- ( Archivo adicional 1: Fig. S8A+B). La replicación de IAV se bloqueó en células pretratadas con KpOMV y se rescató tras la eliminación de TRIF (archivo adicional 1: figura S8C). La actividad informadora de NF-κB fue inducida por KpOMV independientemente del estado TRIF de las células (archivo adicional 1: Fig. S8D).

Fig. 4 La inhibición de la señalización JAK rescata la replicación del virus de la influenza A en macrófagos. Una OMV activa la señalización TRIF-IRF en los macrófagos, lo que a su vez induce la expresión y liberación de IFN con la posterior señalización de IFNAR. IFNAR envía señales a través de JAK/STAT e induce la expresión de ISG, uno de los cuales es Mx1. Esto conduce a un bloqueo de la replicación del IAV. Las células B – E THP-1 se preincubaron durante 1 h con inhibidor de JAK (JAKi) 10 µM antes de la adición de OMV (1 µg/mL; Kp/Sal) durante 2{{22 }}h. La expresión de B – C CXCL8 (B) y Mx1 (C) se determinó mediante qPCR y los resultados se normalizaron a RPS18 y se representan en relación con el control no tratado. Las barras muestran valores medios de tres a cuatro experimentos independientes + SEM. Las células pretratadas con D+E OMV se infectaron adicionalmente con IAV (MOI 0,001). La transferencia Western D muestra la expresión de la proteína Mx1 entre 0 y 3 h después de la infección (pi). E La replicación viral se determinó mediante ensayo de placa 24 h después de la infección. Las barras muestran valores medios de cuatro experimentos independientes + SEM. Estadísticas: 1-way ANOVA (B+C+E); *pag<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; *compared to DMSO control, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=4

Fig. 5 Las OMV inducen señalización antiviral en macrófagos mediante TRIF. Las células informadoras duales THP-1 inducen la expresión de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) después de la activación de la vía NF-κB y la expresión y secreción de Lucia luciferasa tras la activación de la vía IRF. Además, se diferenciaron TRIF (barras grises) y posteriormente se estimularon con células -/- que tienen una eliminación estable de la molécula adaptadora TRIF. (BF) Células informadoras THP-1 (=Dual; barras negras) y células TRIF-/- KpOMV (1 µg/mL) durante 20 h o se dejan sin tratar para el control. Transcurrido el tiempo indicado, se recogió el sobrenadante, ARN y/o proteínas. B Imagen representativa de Western Blot de la expresión de la proteína Mx1. La actividad indicadora C+D Lucia (C) y la actividad indicadora SEAP (D) se determinaron en el sobrenadante del cultivo celular. Se utilizó el mismo sobrenadante para determinar la actividad de ambos reporteros. E La expresión relativa de ARNm para genes diana dependientes de STAT y NF-κB (de arriba a abajo: IFIT1, IFI44, Mx1, CXCL8) se determinó mediante qPCR y los resultados se normalizaron a RPS18 y se representan en relación con el control dual no estimulado. Los cambios en veces se transformaron log2. Las células se infectaron adicionalmente con A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) durante 24 h (F) o VSV (MOI 0,1) durante 12 h (G). La replicación viral se determinó mediante ensayo de placa. Las barras muestran valores medios de cuatro (C – F) a cinco (G) experimentos independientes + SEM. Estadísticas: 2-way ANOVA (C – G); *pag<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; * compared to unstimulated Dual control, # as depicted in the graph; ns=not signifcant; n=4–5

Fig. 6 La expresión de Mx1 inducida por OMV se pierde después de la inhibición de LPS. Las células THP-1 se incubaron durante 20 h con OMV (1 µg/mL; Kp o Clear coli (Cc)) solas o en combinación con 20 µg/mL de polimixina B (PB) o se dejaron sin tratar. para controlar. Se determinó la expresión de la proteína Mx1 mediante Western Blot. Se muestra un resultado representativo de tres experimentos biológicamente independientes. La expresión de Mx1 B y CXCL8 C se determinó mediante qPCR. Las barras muestran valores medios de cuatro experimentos independientes + SEM. Se incubaron células D THP-1 durante 20 h con OMV (1 µg/mL; Kp o Cc) solas o en combinación con 20 µg/mL de PB o se dejaron sin tratar para el control y luego se infectaron adicionalmente con A/WSN/33. (H1N1) (MOI 0,001). La replicación del virus se determinó mediante ensayo de placa 24 h después de la infección. Las barras muestran valores medios de cuatro experimentos independientes + SEM. Estadísticas: 1-way ANOVA B–D; *pag<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; *compared to control, #compared to KpOMV; ns=not significant; n=3–4

El efecto inhibidor de la replicación del IAV de las OMV es transferible a las AEC

Dado que los macrófagos no son el tipo de célula principal para la replicación del IAV en el pulmón y que el IFN I también actúa paracrino, se probó la transferibilidad del efecto de replicación del IAV a las AEC, ya que estas células, a diferencia de los macrófagos, no responden directamente a las OMV/MV ( Archivo adicional 1: Fig. S9). El sobrenadante (SN) de macrófagos tratados con KpOMV indujo Mx1 en células A549, en contraste con LpOMV-SN (Fig. 7A), mientras que CXCL8 se indujo después de ambos (Fig. 7B). KpOMVSN redujo la replicación viral (Fig. 7C), lo que estaba en línea con los experimentos con macrófagos y el patrón de inducción de Mx1. Para confirmar la dependencia del efecto limitante de IAV observado en la señalización JAK/STAT, se combinó KpOMV-SN con JAKi, bloqueando la inducción de Mx1 tras el tratamiento con KpOMV-SN (Fig. 7A) y restaurando la replicación de IAV (Fig. 7C). Para imitar la compleja regulación de los procesos inmunes en el pulmón, se creó una infección ex vivo por IAV de cortes de pulmón humanos cortados con precisión (PCLS). Los Lp/KpOMV no fueron citotóxicos para el PCLS (Fig. 8A) y la combinación de preestimulación de OMV e infección por IAV dio como resultado la inducción de Mx1 (Fig. 8B) y la liberación de CXCL10 (Fig. 8C). Los KpOMV, pero no los LpOMV, redujeron significativamente la replicación del IAV en PCLS (Fig. 8D). Los efectos observados fueron abolidos por la infección con IAV inactivado por UV (Fig. 8A-C). Nuestros hallazgos conducen a un modelo de inflamación pulmonar en el que los AM responden a las OMV de bacterias gramnegativas con la inducción de IFN I, induciendo respuestas antivirales de manera autocrina en los AM y de manera paracrina en las AEC in vitro y en un modelo PCLS ex vivo. (Figura 8E).

Fig. 7 El efecto inhibidor de la replicación del virus de la influenza A de las OMV es transferible a las AEC. Las células THP-1 se incubaron con LpOMV o KpOMV durante 20 h o se dejaron sin tratar para el control. El sobrenadante (SN) se filtró de forma estéril y se usó para la estimulación previa de células A549 durante 20 h solas o en combinación con JAKi 10 µM. La expresión de A+B Mx1 (A) y CXCL8 B se determinó mediante qPCR en el momento de la infección (0 h pi). Las barras muestran valores medios de cuatro experimentos independientes + SEM normalizados para células de control no tratadas. C Las células A549 pretratadas se infectaron adicionalmente con el virus de la influenza A/Hamburg/5/2009(H1N1pdm) (MOI 0,01) durante 24 h. La replicación viral se determinó mediante ensayo de placa. Las barras son valores medios de cuatro experimentos independientes + SEM. Estadísticas: 1-way ANOVA; **pag<0.01, ****p<0.0001; * compared to control-SN; # compared to KpOMV-SN; n=4

Discusión

Descubrimos que las vesículas de diferentes bacterias inducen una señalización diferencial en los macrófagos que es capaz de limitar la replicación del IAV en una infección posterior. De acuerdo con la literatura, las OMV aisladas de Lp, Kp, Ec y Sal, y las MV de Sp fueron comparables en tamaño [26-28]. Los macrófagos incubados con vesículas bacterianas no mostraron citotoxicidad [29, 30], pero indujeron una respuesta proinflamatoria. Todas las vesículas desencadenaron la fosforilación de p38 y la liberación de CXCL8 e IL-1 de macrófagos humanos primarios, mientras que hubo diferencias en la inducción de IFN I y su señalización posterior. Nosotros y otros ya demostramos que la señal de LpOMV a través de TLR2 [12, 22] y también de SpMV indujeron un patrón de activación distinto en los macrófagos [31]. Los LpOMV/SpMV activaron genes diana proinflamatorios NF-κB, como se describe para las bacterias de origen [12, 22, 31]. Sin embargo, el reconocimiento de Kp/Ec/SalOMV provocó, además de los genes diana NF-κB, la inducción de la fosforilación de IRF-3 con expresión de IFNB aguas abajo y la fosforilación duradera de STAT1 junto con la inducción de ISG, lo que aboga por la actividad activa. Señalización IFNAR-JAK/STAT. Las OMV llevan LPS en su superficie, pero la capacidad proinflamatoria de las OMV no se puede imitar con LPS puro. Nosotros y otros observamos que los macrófagos son más sensibles a las OMV en comparación con la misma cantidad de LPS puro [32, 33]. Las OMV contienen una suma de agonistas inmunitarios que son necesarios para la inducción de una respuesta inmunitaria sólida [32]. Los agonistas comerciales de TLR y RIG-I solos o en combinación con LPS no pudieron imitar el efecto. Se demostró anteriormente que los liposomas cargados con LPS inducían una activación más prolongada de TRIF-IRF-3 en macrófagos en comparación con el LPS libre [34]. Al utilizar macrófagos TRIF-/-, mostramos la dependencia de la inducción de ISG en esta molécula adaptadora. Además, los CcOMV u OMV libres de endotoxinas combinados con PB enmascarador de LPS fueron suficientes para anular la respuesta de los macrófagos. Esto indica el reconocimiento de OMV a través de TLR4 con endocitosis posterior y señalización TRIF. En consecuencia, los Kp/Ec/SalOMV pudieron inducir la activación proinflamatoria de los macrófagos a través de TLR4, lo que condujo a la señalización MyD88 y la expresión del gen dependiente de NF-κB, así como a la señalización TRIF con respuesta a IFN I. Esto está en línea con la literatura que muestra que TLR4 y TRIF juntos son necesarios para la inmunogenicidad de las OMV de Neisseria meningitidis en ratones [35]. Como los IFN de tipo I son reguladores maestros de las respuestas antivirales, planteamos la hipótesis de que el reconocimiento de Kp/Ec/SalOMV afecta la replicación del IAV. Demostramos que los macrófagos bloquearon eficientemente la replicación de IAV y VSV después de pretratamientos con OMV activadores de TRIF, mientras que TRIF-/- rescató la replicación viral. Para identificar el efecto sobre la señalización de IFNAR, la inhibición de JAK1/2 combinada con OMV bloqueó con éxito la inducción de Mx1 dependiente de STAT1-y rescató la replicación viral en macrófagos. La combinación de KpOMV con PB o la aplicación de CcOMV libres de endotoxinas no redujo la replicación del IAV en macrófagos, ya que eran incapaces de inducir genes antivirales. Como las preparaciones de vesículas extracelulares obtenidas mediante ultracentrifugación contienen proteínas libres y uniones de células bacterianas junto con las vesículas, las preparaciones de OMV se generaron adicionalmente mediante una combinación de ultrafiltración y cromatografía de exclusión por tamaño [25].

Planta de hierba china cistanche-Antitumoral

Las preparaciones de vesículas puras obtenidas fueron igualmente capaces de inducir la señalización TRIF-IRF con la inducción de Mx1 aguas abajo y bloquearon la replicación viral, lo que aboga por un efecto directo de las vesículas. Aunque los cajeros automáticos son la primera línea de defensa en el pulmón, la mayor parte de la infección y replicación del IAV en un pulmón humano tiene lugar en las AEC [36]. Por lo tanto, las AEC fueron estimuladas con OMV, pero no respondieron a la estimulación como los macrófagos. Sólo la línea celular epitelial bronquial BEAS2B respondió con la expresión de CXCL8, pero carecía de inducción de Mx1. Dado que pudimos mostrar una expresión de genes antivirales que depende de TLR4 y TRIF en macrófagos, planteamos la hipótesis de que las cuatro líneas de células epiteliales analizadas no expresan TLR4 en un grado similar a los macrófagos y que no lograron endocitar las OMV tras la activación de TLR4. Esto está en línea con la literatura que muestra que las AEC humanas aisladas no responden al LPS como lo hicieron los AM emparejados [37]. Como vinculamos el estado antiviral tras la preincubación de OMV con IFN I, utilizamos un sobrenadante de macrófagos estimulados por OMV para preestimular las AEC. El medio condicionado de macrófagos estimulados por KpOMV, a diferencia de la estimulación directa de vesículas, indujo la expresión de Mx1 en estas células y redujo la replicación del IAV en experimentos de infección posteriores. El sobrenadante de macrófagos tratados con LpOMV indujo CXCL8 en células epiteliales, pero no provocó inducción de Mx1 ni cambios en la replicación viral. Para atribuir el efecto observado con los medios condicionados al IFN I, el sobrenadante se combinó con un inhibidor de JAK1/2, bloqueando la inducción de Mx1, y no tuvo ningún efecto sobre la replicación viral. Dado que la interacción de los diferentes tipos de células en un pulmón humano es más compleja y no puede ser imitada completamente por medios condicionados, ampliamos nuestro enfoque a secciones viables de tejido pulmonar distal humano, que se ha utilizado ampliamente para estudios sobre interacciones huésped-patógeno, incluyendo virus de la influenza e infecciones bacterianas [38-41]. En contraste con los modelos in vitro utilizados, el tejido pulmonar humano ex vivo mantiene la arquitectura tridimensional del pulmón y permite una interacción fisiológica entre los tipos de células residentes en el pulmón, pero carece de la posibilidad de entrada de más células inmunes reclutadas. La infección consecutiva de PCLS estimulada por KpOMV con IAV disminuyó la carga viral en comparación con los controles no tratados previamente. Como todas las AEC probadas in vitro no respondieron a la estimulación directa de vesículas bacterianas, planteamos la hipótesis de que en este modelo ex vivo, las AM son el tipo de célula que responde predominantemente. Dado que se eligió un aislado de influenza para la infección posterior que infecta y replica exclusivamente en las AEC, se puede suponer que se trata de un efecto antiviral paracrino que se origina en los MA y se transmite a las AEC. Con base en los datos obtenidos aquí, proponemos el siguiente modelo (Fig. 8E): las OMV de bacterias gramnegativas pueden activar los macrófagos humanos de una manera proinflamatoria clásica y prepararlos antiviralmente a través de TLR4 y TRIF después de una endocitosis exitosa de la vesículas. La liberación de IFN I puede, a su vez, hacer que los macrófagos y/o las AEC sean antivirales mediante la señalización IFNAR y JAK/STAT. La infección posterior de estas células provoca una disminución de la carga viral mediada por Mx1-. Como no teníamos acceso a AM humanos primarios, los experimentos se realizaron utilizando BDM humanos como modelo. Teniendo en cuenta los diferentes orígenes del desarrollo y preparación de estos macrófagos, es concebible que los AM hubieran mostrado una respuesta proinflamatoria más débil en contraste con los BDM. Las vesículas bacterianas ya se utilizan en estrategias de vacunación contra diferentes patógenos que inducen neumonía (revisado en [42]). Por lo tanto, las OMV no solo representan una herramienta para posibles estrategias de vacunación sistémica contra las bacterias huésped, sino que también podrían usarse localmente para combatir infecciones virales mediante la activación de células inmunes innatas residentes. Se necesitan futuros estudios in vivo para probar si estos hallazgos in vitro son aplicables a otros patógenos virales. Además, es necesario señalar que una posible respuesta endotóxica debe ser monitoreada críticamente para evitar respuestas inmunes exageradas in vivo. La inducción de IFN tipo I debe controlarse estrictamente, ya que en individuos sanos se demostró que la inhalación de un agonista de TLR7 inicialmente fue bien tolerada después de la primera dosis, pero provocó una mayor respuesta de TNF e IFN I y síntomas similares a los de la gripe. , después de una segunda dosis [43]. Para combatir los efectos adversos, pueden ser necesarias versiones genéticamente modificadas de OMV, que induzcan una respuesta inmune equilibrada y logren una buena aplicabilidad. En conjunto, presentamos en este documento un modelo de cómo las OMV pueden inducir señalización antiviral en macrófagos humanos y cómo esto puede usarse para prevenir la replicación del IAV.

Fig. 8 KpOMV reduce la replicación del virus de la influenza A en cortes de pulmón humano cortados con precisión. Los PCLS humanos se incubaron con OMV de 1 µg/ml (Lp/Kp) durante 20 h y luego se infectaron adicionalmente con influenza A/California/04/2009 (H1N1pdm) durante 48 h. La inactivación UV del virus sirvió como control. La citotoxicidad se determinó mediante la cuantificación de la LDH liberada por PCLS y se representa en porcentaje en comparación con la lisis total. La expresión de B Mx1 se cuantificó mediante qPCR y se presenta en relación con RPS18 y PCLS de control no tratado. La liberación de C CXCL10 se determinó mediante ELISA y se representa en ng/ml. D La replicación viral se determinó mediante ensayo de placa y se representa en ufp/ml. Las barras muestran valores medios de tres a cinco réplicas biológicas+SEM. E Modelo propuesto para la inducción de inmunidad antiviral de OMV en el pulmón. Estadísticas: 1-way ANOVA (AC), prueba de Friedman (D); *pag<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; * compared to IAV infected, but not pre-treated PCLS, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=5

Referencias

1. Kulp A, Kuehn MJ. Funciones biológicas y biogénesis de vesículas bacterianas secretadas en la membrana externa. Annu Rev Microbiol. 2010;64:163–84.

2. Ellis TN, Kuehn MJ. Virulencia y funciones inmunomoduladoras de las vesículas de la membrana externa bacteriana. Microbiol Mol Biol Rev. 2010;74(1):81–94.

3. Giordano NP, Cian MB, Dalebroux ZD. Secreción de lípidos de la membrana externa y respuesta inmune innata a bacterias gramnegativas. Infectar inmune. 2020. https://doi.org/10.1128/IAI.00920-19.

4. Mancini F, et al. Vacunas OMV y el papel de los agonistas de TLR en la respuesta inmune. Int J Mol Ciencia. 2020. https://doi.org/10.3390/ijms21124416.

5. Hu G, Christman JW. Editorial: macrófagos alveolares en la inflamación y resolución pulmonar. Inmunol frontal. 2019;10:2275.

6. Grassin-Delyle S, et al. El papel de los receptores tipo peaje en la producción de citoquinas por parte de los macrófagos pulmonares humanos. J Inmunidad innata. 2020;12(1):63–73.

7. Hoja informativa sobre la influenza (estacional). 2018; https://www.who.int/news-room/ fact-sheets/detail/influenza-(seasonal)

8. Crotta S, et al. Los interferones tipo I y tipo III impulsan bucles de amplificación redundantes para inducir una firma transcripcional en los epitelios de las vías respiratorias infectadas por influenza. Patógeno PLoS. 2013;9(11): e1003773.

9. Bals R, Hiemstra PS. Inmunidad innata en el pulmón: cómo las células epiteliales luchan contra los patógenos respiratorios. Eur Respir J. 2004;23(2):327–33.

10. Helft J, et al. Las células dendríticas CD103+ de presentación cruzada están protegidas de la infección por el virus de la influenza. J Clin invertir. 2012;122(11):4037–47.

11. Ghoneim HE, Thomas PG, McCullers JA. El agotamiento de los macrófagos alveolares durante la infección por influenza facilita las sobreinfecciones bacterianas. J Inmunol. 2013;191(3):1250–9.

12. Jung AL, et al. Las vesículas de la membrana externa derivadas de Legionella pneumophila promueven la replicación bacteriana en los macrófagos. Patógeno PLoS. 2016;12(4): e1005592.

13. Lindhauer NS, et al. Actividad antibacteriana de una defensa de Tribolium castaneum en un modelo de infección in vitro de Streptococcus pneumoniae. Virulencia. 2019;10(1):902–9.

14. Danov O, et al. El humo del cigarrillo afecta las poblaciones de células dendríticas, la función de barrera epitelial y la respuesta inmune a la infección viral por H1N1. Frente Medio. 2020. https://doi.org/10.3389/fmed.2020.571003.

15. Matrosovich M, et al. Nuevo medio superpuesto de baja viscosidad para ensayos de placas virales. Virol J. 2006;3:63. 16. Neuhaus V, et al. Evaluación de los efectos citotóxicos e inmunomoduladores de sustancias en cortes de pulmón humanos cortados con precisión. J Vis Exp. 2018. https://doi.org/10.3791/57042. 17. Niehof M, et al. Aislamiento de ARN a partir de cortes de pulmón cortados con precisión (PCLS) de diferentes especies. Notas de resolución de BMC. 2017;10(1):121.

18. Schulz C, et al. Los macrófagos derivados de THP-1-hacen que las células epiteliales pulmonares sean hiporresponsivas a Legionella pneumophila: un estudio de biología de sistemas. Sci Rep. 2017;7(1):11988.

19. Livak KJ, Schmittgen TD. Análisis de datos de expresión génica relativa mediante PCR cuantitativa en tiempo real y el método 2(-Delta Delta C(T)). Métodos. 2001;25(4):402–8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.

20. Haller O, et al. Mx GTPasas: máquinas antivirales de inmunidad innata similares a las dinaminas. Tendencias Microbiol. 2015;23(3):154–63. 21. Anastasia M, et al. El extremo C de la proteína NS1 del virus de la influenza A/WSN/1933(H1N1) modula las respuestas antivirales en macrófagos y ratones humanos infectados. J Gen Virol. 2015;96(8):2086–91.

22. Jager J, et al. La fusión de vesículas de la membrana externa de Legionella pneumophila con sistemas de membranas eucarióticas es un mecanismo para administrar factores patógenos a las membranas de las células huésped. Microbiol celular. 2015;17(5):607–20.

23. Lammers AJ, et al. El papel de TLR2 en la respuesta del huésped a la neumonía neumocócica en ausencia del bazo. Enfermedad infecciosa de BMC. 2012. https://doi. org/10.1186/1471-2334-12-139.

24. Mamat U, et al. Producción de proteínas sin endotoxinas: tecnología ClearColi™. Métodos Nat. 2013;10:916.

25. Théry C, et al. Información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 (MISEV2018): declaración de posición de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares y una actualización de las directrices MISEV2014. J vesículas extracelulares. 2018;7(1):1535750. https://doi.org/10.1080/20013078.2018. 1535750. 26. Bonnington KE, Kuehn MJ. La producción de vesículas de la membrana externa facilita la remodelación de los lps y el mantenimiento de la membrana externa en la salmonella durante las transiciones ambientales. MBio. 2016. https://doi.org/10.1128/mBio. 01532-16.

27. Jasim R, et al. Análisis lipidómico de las vesículas de la membrana externa de aislados clínicos de klebsiella pneumoniae resistentes y susceptibles a la polimixina. Int J Mol Ciencia. 2018. https://doi.org/10.3390/ijms19082356.

28. Olaya-Abril A, et al. Caracterización de vesículas protectoras derivadas de membranas extracelulares producidas por Streptococcus pneumoniae. J Proteómica. 2014;106:46–60.

29. Kuhn T, Koch M, Fuhrmann G. Probiomiméticos: los nuevos lactobacilos que imitan micropartículas muestran efectos antiinflamatorios y protectores de barrera en modelos gastrointestinales. Pequeño. 2020;16(40): e2003158.

30. Mehanny M, et al. Las vesículas de la membrana extracelular de los estreptococos son rápidamente internalizadas por las células inmunes y alteran su liberación de citoquinas. Inmunol frontal. 2020;11:80.

31. Volgers C, et al. Papel inmunomodulador de las vesículas de membrana liberadas por macrófagos THP-1 y patógenos respiratorios durante la infección de macrófagos. BMC Microbiol. 2017;17(1):216.

32. Ellis TN, Leiman SA, Kuehn MJ. Las vesículas de la membrana externa producidas naturalmente por Pseudomonas aeruginosa provocan una potente respuesta inmune innata mediante la detección combinada de componentes lipopolisacáridos y proteicos. Infectar inmune. 2010;78(9):3822–31.

33. Alaniz RC, et al. Las vesículas de membrana son facsímiles inmunogénicos de Salmonella typhimurium que activan potentemente las células dendríticas, preparan las respuestas de las células B y T y estimulan la inmunidad protectora in vivo. J Inmunol. 2007;179(11):7692–701.

34. Watanabe S, Kumazawa Y, Inoue J. El lipopolisacárido liposomal inicia la vía de señalización dependiente de TRIF independiente de CD14. Más uno. 2013;8(4): e60078.

35. Fransen F, et al. Efecto diferencial de TLR2 y TLR4 sobre la respuesta inmune tras la inmunización con una vacuna contra Neisseria meningitidis o Bordetella pertussis. Más uno. 2010;5(12): e15692.

36. Travanty E, et al. Susceptibilidades diferenciales de las células primarias del pulmón humano a los virus de la influenza H1N1. J Virol. 2015;89(23):11935–44.

37. Mubarak RA, et al. Comparación de respuestas proinflamatorias y antiinflamatorias en células epiteliales de las vías respiratorias primarias humanas emparejadas y macrófagos alveolares. Respirar Res. 2018;19(1):126.

38. Wu W, et al. Respuesta inmune innata a la infección por el virus de la influenza H3N2 y H1N1 en un modelo de cultivo de órganos pulmonares humanos. Virología. 2010;396(2):178–88.

39. Wu W, et al. El virus de la influenza A (H1N1) pdm09 suprime las respuestas antivirales innatas iniciadas por RIG-I en el pulmón humano. Más uno. 2012;7(11): e49856.

40. Delgado-Ortega M, et al. Respuesta inmune innata a un virus de influenza porcina de subtipo H3N2 en células de tráquea porcina recién nacida, macrófagos alveolares y cortes de pulmón cortados con precisión. Res. veterinaria. 2014;45:42.

41. Kolbe U, et al. La inducción temprana de citocinas tras la infección por Pseudomonas aeruginosa en cortes de pulmón murinos cortados con precisión depende de la detección de la viabilidad bacteriana. Inmunol frontal. 2020. https://doi.org/10.3389/fmmu. 2020.598636.

42. Jung AL, et al. El papel clínico de las vesículas extracelulares derivadas de bacterias y del huésped en la neumonía. Adv Drug Deliv Rev. 2021. https://doi.org/10. 1016/j.addr.2021.05.021.

43. Delaney S, et al. Tolerabilidad en el hombre después de la dosificación por inhalación del agonista selectivo de TLR7, AZD8848. BMJ Open Respir Res. 2016;3(1): e000113.