Membranas de nanocelulosa bacteriana bioactiva enriquecidas con Eucalyptus Globulus Labill. Extracto acuoso de hojas para aplicaciones de cuidado de la piel antienvejecimiento

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Resumen:Las membranas de nanocelulosa bacteriana (BNC), con notables propiedades físicas y mecánicas, surgieron como un vehículo biopolimérico versátil de compuestos bioactivos para aplicaciones de cuidado de la piel. En este estudio, las membranas BNC se cargaron con glicerol (como agente plastificante y humectante) y diferentes dosis (1-3 ug cm-2) de un extracto acuoso obtenido de la hidrodestilación de Eucalyptus globulus Labill. hojas (HDE), para aplicación como mascarillas faciales en lámina. Todas las membranas son resistentes y altamente maleables en estado seco y húmedo, con propiedades mecánicas similares o incluso mejores que las de una máscara BNC comercial. Además, se encontró que el HDE confiere una actividad antioxidante dependiente de la dosis a BNC puro. Además, tras 3 meses de almacenamiento a 22-25 grados y 52 % de humedad relativa (HR) o a 40 °C y 75 % de HR, se confirmó que la actividad antioxidante y el aspecto macroscópico de la membrana con 2 ug cm{{10 }} de HDE se mantuvieron. También se demostró que las membranas no son citotóxicas para las células HaCaT y NIH/3T3, y la membrana con 2 ug cm-2 de HDE provocó una reducción significativa en la actividad de la galactosidasa asociada a la senescencia en las células NIH/3T3. Estos hallazgos sugieren la idoneidad y el potencial de las membranas obtenidas como máscaras faciales bioactivas para aplicaciones antienvejecimiento.

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Palabras clave:nanocelulosa bacteriana; Eucalipto globulus Labill. hojas; extracto acuoso; actividad antioxidante; máscaras faciales de hoja; antienvejecimiento; aplicaciones para el cuidado de la piel

1. Introducción

La población mundial está considerablemente envejecida debido a la disminución de la natalidad y la mejora de la supervivencia, y el consiguiente aumento de la esperanza de vida media, asociado a los avances médicos y tecnológicos alcanzados en las últimas décadas [1,2]. Se espera que la población mundial de 60 años o más alcance alrededor de 2100 millones para 2050, lo que representa un aumento de aproximadamente el doble desde 2017, y se espera que la cantidad de personas de 80 años o más casi se triplique en el mismo período 3]. Sin embargo, a pesar de la longevidad mejorada, el envejecimiento de la piel es un proceso inevitable y, por lo tanto, se espera una demanda creciente de productos para el cuidado de la piel antienvejecimiento.

El envejecimiento de la piel es un proceso biológico complejo que combina mecanismos endógenos y exógenos [4]. El envejecimiento endógeno está determinado principalmente por factores genéticos y cambios hormonales que ocurren con el proceso normal de envejecimiento [4]. Por otro lado, el envejecimiento exógeno está mediado por factores externos (por ejemplo, la sobreexposición a la radiación ultravioleta (fotoenvejecimiento), la gravedad, el tabaquismo, la contaminación y la mala alimentación)[5]. En ambos procesos de envejecimiento, pero particularmente en el exógeno, está bien aceptado que el aumento del estrés oxidativo, inducido por especies reactivas de oxígeno (ROS) y resultante del desequilibrio entre la producción de ROS y la defensa antioxidante, juega un papel crucial [{{3} }]. Con la edad, también hay una disminución en la capacidad de las células de la piel humana para reparar el ADN dañado, lo que también contribuye al envejecimiento de la piel [8].Extracto de Cistanche Anti RadiaciónAsí, el proceso de envejecimiento provoca diversas alteraciones bioquímicas en la composición de la piel, con efectos sobre su estructura y función [9], dando como resultado signos visibles como arrugas, sequedad, pérdida de elasticidad, adelgazamiento, textura áspera o pigmentación irregular [7,10]. . De ahí que con la creciente búsqueda de la salud y el bienestar, en la que también se incluye la salud y la estética de la piel, el desarrollo de cosméticos que incorporen compuestos bioactivos para prevenir o atenuar el envejecimiento de la piel y sus signos externos, mejorando así el aspecto de la piel, ha estado en el centro de la atención. vanguardia de la investigación y la innovación en la industria cosmética en las últimas décadas. En este contexto, y entre los cosméticos para tratamiento tópico, las mascarillas de belleza y, en particular, las mascarillas faciales en láminas, son un mercado en crecimiento, con una tasa de crecimiento anual compuesta (CAGR) esperada del 8,1 % entre 2019 y 2027 [11]. Este tipo de máscara es especialmente atractiva para los consumidores modernos, en gran parte debido a su aplicación sencilla y fácil, su uso rápido y su eficacia]12. Se pueden usar varios materiales como matriz de soporte de estas mascarillas, a saber, polímeros sintéticos (p. ej., alcohol polivinílico) y silicona, tejidos (p. ej., no tejidos y algodón), hidrogeles (p. ej., hidrogeles a base de colágeno y seda). )o nanofibras de celulosa, como la nanocelulosa bacteriana (BNC)[13].Con la creciente demanda de productos para el cuidado de la piel de origen natural, BNC ha ganado relevancia y ahora se erige como un material de base biológica superior, ya explorado y comercializado por algunos de las principales empresas de cosméticos (p. ej., Lancome, Elizabeth Arden y DHC)[14] que están siguiendo la tendencia de la demanda de los consumidores orientada al medio ambiente.

Bacterial nanocellulose is an extracellular polysaccharide produced by several non-pathogenic bacteria from different genera (e.g., Komagataeibacter (formerly Gluconacetobacter), Agrobacterium, Rhizobium, Escherichia, and Aerobacter), through fermentation in the presence of oxygen and carbon sources(e.g., glucose)[1516]. BNC is synthesized in the air-culture medium interface as an ultrafine 3D nanofiber network, showing high water content(>90 por ciento), alta hidrofilicidad y una estructura nanoporosa [17]. Cuando se produce en cultivo estático, el BNC se obtiene como una membrana gelatinosa similar a un hidrogel con un grosor y una forma variables del recipiente de cultivo (a saber, moldeabilidad in situ), lo cual es una ventaja cuando se desea una forma predefinida [18]. El conjunto de propiedades únicas de BNC también abarca alta cristalinidad y pureza, notable resistencia mecánica y estabilidad térmica [19]. Además de ser biodegradable, BNC también ha demostrado una buena tolerancia cutánea y biocompatibilidad en varios estudios in vivo [20-22], lo que lo convierte en un material ideal para productos para el cuidado de la piel. En este sentido, y debido a su nanoestructura porosa, la aplicabilidad y eficacia de BNC como portador para la entrega de compuestos activos en la piel ha sido el foco de varios trabajos, por ejemplo, para la entrega de cafeína [23], seda-sericina [24], retinol [25] o rutina [26]. Para leer más, una revisión reciente proporciona una descripción general completa de la versatilidad y aplicabilidad de BNC en cosméticos verdes, incluso como portador de sustancias activas para la piel [27].

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Los compuestos bioactivos naturales se utilizan ampliamente en los cosméticos antienvejecimiento para el cuidado de la piel [28].hierba de cistancheLos extractos de plantas, en particular, son una rica fuente de compuestos bioactivos (por ejemplo, polifenoles, terpenoides, vitaminas, entre otros) con múltiples acciones potenciales sobre la piel, siendo las actividades antioxidantes y antimicrobianas de los efectos de inhibición de la tirosinasa los principales beneficios reportados hasta el momento [ 29]. Por lo tanto, dada la tendencia actual de productos naturales en cosmética, los extractos de plantas aparecen entre los ingredientes más prometedores para el desarrollo de productos para el cuidado de la piel. Además, también se ha investigado la incorporación de extractos naturales en membranas BNC con fines cosméticos. Ejemplos son los trabajos que reportan la incorporación de extracto de propóleo, conocido por tener actividades antisépticas y astringentes[13,30], extractos de avena y romero con efectos humectantes [13], o la formulación cosmética compuesta por fruto de Adansonia digitata, flor de Hibiscus sabdariffa, Coffea arabica seedcake, Kigelia Africana fruit, y extractos de bulbo de Acacia y Crocus chrysanthus, con propiedades antienvejecimiento, en particular, alisador de arrugas [21]. Recientemente, una revisión hizo una visión crítica de la importancia de asociar BNC con fenoles vegetales para prevenir el daño de la piel inducido por los rayos UV [31].

Eucalipto globulus Labill. el árbol de hoja perenne es una fuente bien conocida de compuestos bioactivos, a saber, compuestos fenólicos como ácidos fenólicos, flavonoides o taninos hidrolizables [32-36]. Las actividades antioxidantes y antimicrobianas de los extractos de E.globulus que contienen estos compuestos se han demostrado en varios estudios [34,35]. En cuanto a la aplicación en el campo cosmético, un estudio reciente demostró el efecto protector, tanto in vitro (en fibroblastos dérmicos humanos) como in vivo (ratones sin pelo), de un extracto etanólico al 50 por ciento de biomasa comercial seca de E.globulus contra el fotoenvejecimiento inducido por UV. , con resultados prometedores en cuanto a la prevención de la formación de arrugas y la sequedad de la piel [37]. Sin embargo, hasta donde sabemos, los extractos de E.globulus nunca se han explorado, en combinación con un sustrato polimérico, para producir máscaras cutáneas bioactivas para el cuidado de la piel antienvejecimiento.

Con esta perspectiva, el propósito del presente trabajo fue producir membranas BNC cargadas con un extracto acuoso derivado de la hidrodestilación (hydro-distillation extract, HDE) de hojas de E.globulus. La hidrodestilación es un método comúnmente utilizado por la industria para la extracción de aceites esenciales [38]. Además, el glicerol (G), un ingrediente humectante ampliamente utilizado en cosmética [39], también se incorporó a las membranas BNC (7,5 mg cm-2) ​​para aumentar su flexibilidad y, al mismo tiempo, su adaptabilidad a la piel. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue obtener un material completamente de base biológica con propiedades funcionales para su posible aplicación como mascarilla facial antienvejecimiento. Las membranas BNC cargadas con diferentes dosis del extracto de hidrodestilación se caracterizaron en cuanto a su morfología, propiedades mecánicas, estabilidad térmica y capacidad de absorción de humedad. Además, también se evaluó la actividad química antioxidante de las diferentes membranas, así como su citotoxicidad in vitro (en queratinocitos humanos y líneas celulares de fibroblastos de ratón). Además, la estabilidad de la actividad antioxidante después de 3 meses de almacenamiento, en la oscuridad, a 22-25 grados y 52 por ciento de humedad relativa (HR) o a 40 grados y 75 por ciento de HR de la membrana con 2 ug cm{{19} } de HDE fue evaluado. Finalmente, se investigó más la actividad antisenescencia in vitro de la membrana BNC con 2 ug cm-2 de HDE.

2. Materiales y métodos

2.1. Químicos y Materiales

Citric acid (≥99.5%), dimethyl sulfoxide (DMSO) (≥99.0%), disodium hydrogen phosphate(≥99.0%), glucose(≥99.5%), glycerol(≥99.5%), magnesium nitrate hexahydrate (≥99.0%), potassium chloride(≥99.0%), potassium dihydrogen phosphate (≥99.0%), potassium sulphate (>99.0%), sodium bicarbonate (>99.5%), sodium chloride (>99.0 por ciento), y 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio (MTT)( Mayor mayor o igual al 97,5 por ciento) se adquirieron de Sigma-Aldrich (Lisboa, Portugal). Todos los demás productos químicos eran de grado de laboratorio.crecimiento del pene cistancheCloruro de calcio, medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), etopósido, reactivo de fenol de Folin-Ciocalteu, cloruro de magnesio, piruvato de sodio, solución de tripsina-EDTA, N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-({{6} }ácido etanosulfónico),4-(2-hidroxietil piperazina-1-ácido etanosulfónico (HEPES) y 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) fueron suministrado por Sigma-Aldrich (Lisboa, Portugal), la peptona y el extracto de levadura se adquirieron de Himedia Laboratories GmbH (Einhausen, Alemania), el suero fetal bovino (FBS), la penicilina y la estreptomicina se adquirieron de Gibco (Carlsbad, CA, EE. UU.).

Se utilizaron muestras de una máscara facial de hoja comercial BNC en los ensayos mecánicos y de absorción de humedad, con fines de comparación. La mascarilla facial en hoja comercial de BNC (Superstart Probiotic Boost Skin Renewal Biocelulosa Mask, Elizabeth Arden, Nueva York, NY, EE. UU.) se describe como derivada del agua de coco natural e integrada en una formulación cosmética con propiedades renovadoras de la piel que contiene, entre otros ingredientes, probióticos (lisado de fermento de Lactococcus, Lactobacillus), extractos de plantas (extracto de flor de rosa de Althea, jugo de raíz de Polymnia sonchifolia, extracto de Crithmum maritimum), cafeína y humectantes, como glicerol, ácido hialurónico o polietilenglicol (PEG)-450 . Las muestras de la lámina comercial BNC se secaron en un horno ventilado a 358ºC antes de su uso.beneficios de la salsa cistancheE.globulus Labill fresco. Se recolectaron hojas de árboles adultos de una plantación industrial de The Navigator Company cerca de Aveiro en Sever do Vouga (Bracal) (Aveiro, Portugal) y se sometieron a un proceso de hidrodestilación hasta la extracción completa de la fracción de aceite esencial (2-3 h) utilizando un aparato de tipo Clevenger modificado. Al final, un extracto acuoso, el HDE, fue recuperado y liofilizado, almacenado y protegido de la luz en un desecador, a temperatura ambiente, hasta su uso [40].

2.2. Contenido fenólico total de HDE

El contenido fenólico total (TPC) de HDE se determinó utilizando el método de Folin-Ciocalteu, como se describe en otra parte [41], con algunas modificaciones. Brevemente, en una 96-placa de pocillos, 150 μL de reactivo de Folin-Ciocalteu previamente diluido（1∶10, o/ø） con agua y 120 L de solución acuosa de carbonato de sodio （75 g L- ) se agregaron a 30 μL de una solución acuosa de HDE en concentraciones que oscilaron entre 1,95 ug y 500 ug mL-1 de extracto. Las mezclas de reacción se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 60 min. Después del período de incubación, la absorbancia se midió a 760 nm frente a un blanco (agua en lugar de extracto) en un lector de microplacas Thermo Scientific MultiskanTM FC (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.). El TPC se calculó como equivalentes de ácido gálico (GAE) a partir de la curva de calibración de las soluciones estándar de ácido gálico (5,13-205,0 ug mL-1) y se expresó como mg de GAE de extracto liofilizado. El ensayo se realizó cinco veces y cada muestra se analizó por triplicado.

2.3. Producción de las Membranas BNC

Las membranas BNC se produjeron en nuestro laboratorio utilizando medio de cultivo líquido Hestrin-Schramm (HS) (20g L-1glucosa, 5 g L-1 peptona, 5 g Ll extracto de levadura, 2,7 g L -1 hidrógeno fosfato disódico, 1,15 g L-ácido cítrico, pH 5) inoculado con la bacteria del ácido acético Gluconacetobacter sacchari en condiciones de cultivo estático [42]. Después de 4-6 días de cultivo a 30 grados, las membranas BNC se recogieron y se trataron dos veces con NaOH 0,5 M a 80 grados durante 30 min. Posteriormente, las membranas se lavaron varias veces con agua destilada para eliminar los componentes restantes del medio y las células bacterianas. Finalmente, las membranas BNC se blanquearon con una solución acuosa de hipoclorito de sodio al 1 por ciento seguido de lavados repetidos con agua destilada hasta que se alcanzó un pH neutro. Las membranas purificadas se almacenaron en agua ultrapura a más 4 grados hasta su uso.

2.4. Preparación de las Membranas BNC-G-HDE

Membranas BNC húmedas （diámetro∶ ca.7.0±0.5 cm; espesor∶ 7000± 1000 μm）fueron cargados con diferentes dosis de HDE (expresado como masa de HDE por área superficial de la membrana) y glicerol (7.5 mg cm-2) ​​(Tabla 1), utilizando el método de impregnación. Sucintamente, las membranas BNC húmedas se pesaron (alrededor de 180 mg de BNC seco) y se drenaron presionando a mano con papel absorbente de laboratorio hasta que el contenido de agua disminuyó a casi el 40 por ciento (estimado por pérdida de peso). Luego, las membranas se empaparon en 5 ml de una solución acuosa que contenía las dosis respectivas de HDE y glicerol y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta la completa absorción de la solución de HDE-G. Finalmente, las membranas BNC se secaron (en placas de Petri) a 35 grados en un horno ventilado (línea Venticell Eco, grupo MMM, Planegg, Alemania) durante al menos 20 h. Las membranas secas se almacenaron y protegieron de la luz en un desecador a temperatura ambiente hasta su uso. Para fines de comparación, las membranas BNC puras (sin el extracto y el glicerol) se secaron como se describió anteriormente, y las membranas cargadas con glicerol (BNC-G) se prepararon siguiendo el mismo procedimiento.

2.5. Caracterización de Membranas

2.5.1.Espesor

El grosor de las membranas secas se midió en cinco sitios aleatorios utilizando un micrómetro digital portátil (Mitutoyo Corporation, Tokio, Japón) con una precisión de 1 μm

2.5.2. Morfología

Las morfologías de superficie y sección transversal (criofracturadas) de las membranas se analizaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Las micrografías se obtuvieron utilizando un microscopio de alto voltaje (HR-FESEMSU 70 Hitachi, Tokio, Japón) operado a 4,0 kV. Antes de la adquisición de imágenes, las muestras se colocaron en un soporte de acero y se recubrieron con carbono.

2.5.3. Rendimiento Mecánico

El rendimiento mecánico de las membranas en estado seco y húmedo (80 por ciento de humedad) se evaluó mediante pruebas de tracción. El contenido de humedad de las membranas húmedas se definió de acuerdo al contenido de humedad determinado en el BNC comercial. Las pruebas de tracción se realizaron en una máquina de prueba uniaxial Instron 5564 (Instron Corporation, Norwood, MA, EE. UU.) en el modo de tracción a una velocidad de cruceta de 10 mm min-I utilizando una celda de carga estática de 500 N. Todas las mediciones se realizaron en al menos cinco repeticiones utilizando muestras de prueba rectangulares (5 × 1 cm²) y una longitud de calibre de 30 mm. Se trazaron las curvas de tensión (MPa) y deformación (porcentaje), y se determinaron el módulo de Young, la resistencia a la tracción y el alargamiento a la rotura utilizando el software Instron BlueHill 3. En estos ensayos, también se probaron muestras de una máscara facial BNC comercial en las mismas condiciones, para comparar.

2.5.4. Estabilidad térmica

El análisis termogravimétrico (TGA) se llevó a cabo con un analizador SETSYS Setaram TGA (SITARAM Instrumentation, Lyon, Francia) equipado con una celda de platino. Las muestras se calentaron desde temperatura ambiente hasta 800C a una velocidad constante de 10 grados min-1 bajo una atmósfera de nitrógeno.

2.5.5. Capacidad de absorción de humedad

La capacidad de absorción de humedad de todas las membranas se evaluó colocando especímenes secos (2 × 2 cm-) de cada membrana en un desecador, a temperatura ambiente, con una humedad relativa de aprox. 52 por ciento utilizando una solución acuosa saturada de nitrato de magnesio (52,89 ± 0,22 por ciento a 25 grados)[43]. Las muestras se tomaron del desecador y se pesaron después de 0,5 h, 1 h, 2,5 h, 24 h y 48 h. Todas las membranas se ensayaron por triplicado. La absorción de humedad se calculó de la siguiente manera:

donde Who es el peso inicial del espécimen y Wwi es el peso en cada momento.

2.6. En Chermico Actividad Antioxidante

La actividad antioxidante de las membranas cargadas con HDE se estimó utilizando el método de eliminación de radicales libres DPPH, siguiendo el procedimiento informado anteriormente [44], con algunas modificaciones. La reacción se basa en la disminución de la absorbancia de la solución de DPPH resultante del barrido de radicales por parte de los compuestos antioxidantes, con el consiguiente cambio de color de la solución de DPPH de púrpura a amarillo pálido [45]. Brevemente, se agregaron muestras (2 × 5 cm²) de cada membrana a 3,75 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y etanol (EtOH) (60∶40); pH5.5）. Luego, se agregaron 250 μL de solución de DPPH (1 mM) en etanol y las mezclas resultantes se incubaron en la oscuridad con mezcla suave (100 rpm) a 22 grados durante 0,5 h, 1 h y 2,5 h, y luego se midió la absorbancia a Se leyó 517 nm contra el blanco (EtOH: PBS1 × pH 5,5) usando un lector de microplacas MultiskanTM FC (Thermo Scientific, Waltham, Massachusets, EUA). A modo de comparación, las mezclas de reacción que contienen el HDE diluido en EtOH: PBS1×pH5,5 a una concentración final equivalente a la cantidad máxima de HDE que podría liberarse de cada membrana (HDE 1:2,5 ug mL-1; HDE1. 5∶3,75 ug mL-1, HDE 2∶5,0 ug mL-1, HDE 3∶7,5 ug mL-）también se incluyeron en el ensayo. Un control que constaba de EtOH: PBS 1× pH 5,5 con DPPH y sin membrana.Se realizaron tres ensayos independientes para cada muestra.La actividad captadora de radicales DPPH se calculó a partir de la absorbancia de cada muestra (muestra A) con respecto a la absorbancia del DPPH control (ApppH) de la siguiente manera:

2.7. Evaluación de la Estabilidad de la Membrana BNC-G-HDE2 bajo Almacenamiento

Sobre la base de las "Directrices sobre pruebas de estabilidad para productos cosméticos"[46], se evaluó la estabilidad de almacenamiento de BNC-G-HDE2. Para esto, muestras (14 cm²) de membranas BNC-G (como control) y BNC-G-HDE2 se colocaron en viales de vidrio y se almacenaron durante 3 meses en la oscuridad en las condiciones normales de almacenamiento esperadas, a temperatura ambiente ({{10 }} grado) y 52 por ciento de HR (una condición I, usando una solución saturada de nitrato de magnesio [43]) y en la condición acelerada de 40 grados C y 75 por ciento de HR (una condición I, usando una solución saturada de cloruro de sodio [43] ). La humedad relativa se monitoreó periódicamente utilizando un termohidrómetro para asegurar una humedad constante durante todo el período de almacenamiento. Todas las muestras se analizaron antes y después de 1, 2 y 3 meses de almacenamiento con respecto a su actividad antioxidante (como se describe en la Sección 2.6). También se registró el aspecto macroscópico de las membranas. Para cada condición, todas las muestras se analizaron por triplicado.

2.8. Ensayos biológicos in vitro

2.8.1. Cultivo de células

Se cultivaron líneas celulares de queratinocitos humanos (HaCaT, de CLS, Cell Lines Service, Eppelheim, Alemania) y fibroblastos de ratón (NIH/3T3, ATCC CRL-1658, Manassas, VA, EE. UU.) usando medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) , a 37 grados , en una atmósfera de aire humidificado al 5 por ciento de CO2-95 por ciento. El medio se complementó con 10 por ciento (o/v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 1 por ciento (o/ø) de pen/strep, 3,7 g de L-bicarbonato de sodio y piruvato de sodio 1 mM. Las células se separaron con solución de tripsina-EDTA 1x.

2.8.2. Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad de las membranas se evaluó utilizando un ensayo de reducción de MTT. Muestras (2,5 cm²) de las membranas (BNC-G, BNC-G-HDE1, BNC-G-HDE1.5, BNC-G-HDE2, BNC-G-HDE3) se esterilizaron dos veces con radiación UV en cada lado durante 20 min y luego se incubaron, durante 24 h, en 2,5 ml de medio DMEM completo a 37 grados en una atmósfera humidificada con 5 por ciento de CO, -95 por ciento de aire, para preparar cada extracto de membrana.

Mientras tanto, se sembraron 2x10 y 1x104 células/pocillo en 96-placas de pocillos para células HaCaT y NIH/3T3, respectivamente. Después de 24 horas, se usó el mismo volumen del extracto de membrana para reemplazar el medio de cultivo y las células se incubaron durante 24 horas a 37 grados. Como control, las células se trataron de la misma manera que se describe para las muestras, pero se expusieron solo al medio DMEM. Después de 24 h, se retiró el medio y se determinó la citotoxicidad como se describió previamente [47]. Brevemente, se añadió una solución fresca de MTT (0,5 mg L-1) preparada en medio Krebs (pH 7,4) y se incubó a 37 grados durante 2 h (células HaCaT) o 4 h (células NIH/3T3). Después de eso, la solución de MTT se reemplazó por DMSO y se incubó durante 10 min, con agitación, para disolver completamente los cristales de formazán. Después de la incubación, se midió la absorbancia a 570 nm en un espectrofotómetro (SLT spectra I). Los resultados de 3 experimentos independientes, con 3 réplicas cada uno, se expresaron como porcentaje (por ciento) del valor de absorbancia obtenido en el control y se presentaron gráficamente como porcentaje de reducción de MTT.

2.8.3. Actividad anti-senescencia

La actividad anti-senescencia de la membrana BNC-G-HDE2 se evaluó utilizando el ensayo de tinción de -galactosidasa (-gal). La membrana BNC-G se utilizó como control. Para preparar los extractos de membrana, las muestras esterilizadas (10 cm-) se incubaron en 10 ml de medio DMEM completo como se describió anteriormente para el ensayo de citotoxicidad.

Las células NIH/3T3 se sembraron en 12-placas de pocillos a una densidad de 2,5 × 104 células/pocillo y se dejaron estabilizar durante 24 h. Posteriormente, se utilizó etopósido 12,5 μM para inducir la senescencia celular en NIH/3T3 durante 24 h. A continuación, las células estimuladas con etopósido se trataron con el extracto de membrana BNC-G-HDE2 durante otras 24 h.dosis de cistanche tubulosa redditComo control, las células no tratadas se incubaron con medio DMEM o con extractos de membranas BNC-G y BNC-G-HDE. Después de la incubación, se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron con PBS y se marcaron con una solución de -gal preparada según lo descrito por el fabricante (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.). El análisis de las células positivas para la senescencia se realizó con un aumento de 20x utilizando un microscopio de campo amplio (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania). Se realizaron al menos 3 experimentos independientes por duplicado y se determinó el porcentaje de células positivas para -gal usando cuatro imágenes microscópicas.

2.9. Análisis estadístico

En el tratamiento de los resultados de la caracterización, actividad antioxidante y prueba de estabilidad de almacenamiento de las membranas, se utilizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey para evaluar el nivel de significancia. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar de la media. En cuanto a los ensayos in vitro, la normalidad de la distribución de datos se evaluó mediante las pruebas de normalidad de D'Agostino-Pearson y Shapiro-Wilk. Las comparaciones estadísticas entre grupos se realizaron mediante ANOVA seguido de la prueba post-hoc de Dunnett o la prueba t de Student no apareada. Los resultados se presentan como la media ± error estándar de la media del número indicado de experimentos.

Se aceptó la significación a valores de p<0.05. all="" statistical="" calculations="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" software(8.0.2,="" graphpad="" software="" inc.,="" san="" diego,="" ca,="">

Este artículo está extraído de Materials 2022, 15, 1982. https://doi.org/10.3390/ma15051982 https://www.mdpi.com/journal/materials