Impulso de la actividad anticancerígena del taxol "endofito de jojoba" de Aspergillus Favus a través de la conjugación con nanopartículas de oro mediadas por -irradiación Ⅱ
May 30, 2023
Identidad química y actividad anticancerígena del taxol de A. favus
Los supuestos puntos de TLC deA. FavusSe desguazaron taxol y se disolvieron en metanol,y las propiedades químicas del compuesto se resolvieron a partir de las diferentes HPLC,Análisis cromatográficos y espectroscópicos HNMR y FT-IR. Protón nuclear magnéticoseñales de resonancia (1 RMN H) deA. FavusTaxol extraído se distribuyeron entre 1.0y 8.0 ppm, con tres señales de protones resueltas en 1.0–3.0 ppm correspondientes a metilo,grupos acetato y acetileno, mientras que las señales de protones a 6,5–9.0 ppm correspondientes alas fracciones aromáticas (Fig.3). El patrón y la distribución de las señales de protones deA.faen contraTaxol autentica la identidad estructural y la similitud de la muestra con el estándarTaxol (Fig.3). Además, Taxol deA. Favustiene los mismos espectros FTIR del Taxol auténtico.El pico en 3393.3 cm−1fue asignado para el hidroxilo (OH), mientras que el pico en 2923.5 fueasignado al tramo CH alifático, los picos en 1661.0 cm−1corresponden a C=Ofrecuencia de estiramiento. Los picos observados en 1452.0 cm−1y 1404.0 fueron referenciados ala frecuencia de estiramiento de NH, mientras que el pico a 1109,0 cm−1se refiere al grupo carbonilofrecuencia de estiramiento de oxígeno. Los picos en el rango entre 1020.0 y 979.77 cm−1eranreferenciado a la presencia de curvas C y H aromáticas. En conclusión, el patrón espectral deFTIR con respecto a los grupos funcionales deA. FavusTaxol era idéntico al auténticoTaxol (Fig.3). En conclusión, a partir de los análisis cromatográficos y espectrales, el supuestomuestra ha sido resuelta y autenticada como compuestos de Taxol en comparación con el auténticocompuesto.
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Efecto de diferentes tipos de medios en la producción de taxol por A. favus
La influencia de la composición del medio en la producción de Taxol porA. Favusha sido evaluadocultivando en PDB, M1D, Czapek's-Dox y extracto de malta. Después de la incubación culturalción, Taxol fue extraído y cuantificado como se describe en Materiales y Métodos. Desde elresultados en la Fig.4, el mayor rendimiento de Taxol porA. Favusse obtuvo cultivando en maltaextracto (170 µg/l) y Czapek's-Dox (166 µg/l), en comparación con medio de cultivo PDB como control(89 µg/l). Por lo tanto, el rendimiento de Taxol porA. Favusse incrementó en aproximadamente 2 vecespor su cultivo en medios Czapek's-Dox y extracto de malta, en comparación con el medio control.Por lo tanto, más estudios de optimización para maximizar el rendimiento de Taxol porA. Favuspor la respuestaSe ha implementado el enfoque estadístico de la metodología de superficie.
Optimización de variables de bioproceso utilizando la metodología de superficie de respuestaEvaluación de diseño de Plackett-Burman para factores críticos
El rendimiento de Taxol porA. Favusha sido optimizado por el diseño experimental estadístico dePlackett-Burman [18, 28]. Los rangos mínimo y máximo de los parámetros seleccionadosseleccionados por el diseño de Plackett-Burman se resumen en la Tabla2. La concentración de taxol fuedeterminada por TLC y HPLC. Todos los experimentos fueron
se consideró la concentración promedio de Taxol. El análisis estadístico de este diseño ilustrathat the model F-value of 5.98 implies the model is significant and values of "Prob>F" menosrealizado por triplicado yque 0.0500 como se informa en la tabla3. El rendimiento real y previsto de Taxol en respuesta a laLos parámetros experimentales revelados por el diseño de Plackett-Burman se mostraron a partir delmatriz en tabla4. El "Pred R-Squared" de 0.3061 no está tan cerca del "Adj R-Squared"de 0.5760 como uno esperaría normalmente. El valor máximo real (255,35 µg/l) y previsto(280,4 µg/l) rendimiento de Taxol porA. Favussobre un diseño factorial de Plackett-Burman designse obtuvo en la ejecución # 8. A partir de los datos obtenidos (Fig.4), el mayor rendimiento de Taxol porA. Favus(225 µg/l) se obtuvo utilizando extracto de malta (20 g/l), peptona (2 g/l), sacarosa (20 g/l), soja(2 g/l), cisteína (0,5 g/l), glutamina (0,5 g/l), extracto de carne (1 g/l), a temperatura de incubación30 grado, pH inicial 6,0, y tras 12 días de incubación a velocidad de agitación (150 rpm). En esta culturalejecutar (12), el rendimiento de Taxol porA. Favusaumentó significativamente en alrededor de 1,4 veces,en comparación con el medio de control (170 µg/l). La reducción del modelo, la transformación de la respuesta,y Adeq Precision miden la relación señal-ruido, y es deseable una relación superior a 4[46]. En base al parámetro estimado y aplicando análisis de regresión múltiple sobre eldatos experimentales, las variables de prueba y la variable de respuesta se relacionaron por la siguienteecuación modelo: ecuación de primer orden en términos de factores codificados — Taxol Con.= más 11,51 más 1,91E más 2,92 J más 0,81 K. Los niveles reales y previstos de Taxol porA. Favussobre Plackett-Burbioproceso de optimización del hombre se resumen en la Tabla4y la figura4. El máximo real(255,35 µg/l) y rendimiento previsto (280,4 µg/l) de Taxol porA. Favussobre un diseño factorial deEl diseño de Plackett-Burman se obtuvo en la ejecución n.º 8 con un componente medio. El efecto de la indiparámetros individuales como se revelan en el diseño de Plackett-Burman se representaron en el ParetoGráfico que representa el orden de importancia de las variables involucradas en la producción de Taxol Fig.4. Así, las variables más significativas que afectan la productividad de Taxol porA. Favuseran cisteína,pH y tiempo de incubación según lo revelado por el diseño de Plackett-Burman.
El diseño compuesto central enfrentado se adoptó para estudios de optimización adicionales utilizando elvariable significativa la del diseño de Plackett-Burman. Los resultados de 20 carreras de tresvariables con efectos positivos demostraron que las producciones de Taxol se diversificaron notablementecon la condición se probaron en el rango de 96,5–302,7 µg/l. El rendimiento máximo deTaxol porA. Favus(302.7 µg/l) usando cisteína (0.50 g/l) a pH 6.0 y se incubódurante 15 días como se registra en la Tabla5. La producción mínima de Taxol se registró encorrida número 15, donde la cisteína (1.0 g/L) a pH 7.0 y se incubó durante 7 días. la estadisticaEl análisis del diseño del modelo lineal demuestra que el valor F es 87,08, lo que implica lasignificance of the model, and the values of "Prob>F" menor que 0.050 indica ese modelotérminos son significativos (Tabla6). Por lo tanto, la cisteína, el pH y el tiempo de incubación son importantestérminos del modelo. El análisis reveló que el "Pred. R-Squared" de 0.8972 está en un rango razonableacuerdo con el "Adj. R-Squared" de 0.9315. Relación "Adeq. Precision" de 30.800 medidasla relación señal/ruido, ya que es deseable una relación superior a cuatro, el Adeq.Los resultados obtenidos del experimento CCD fueron analizados por ANOVA que arrojóla siguiente ecuación de regresión al nivel de producción de Taxol: modelo de primer orden equatérminos de ción de factores codificados — Taxol Conc.{{0}} más 11,47 más 1,60A más 2,43B más 0,67C. el tridimensionalCurvas de superficie de respuesta que muestran el efecto de las interacciones más significativas.Los parámetros de cant, cisteína, pH y tiempo de incubación se muestran en la Fig.4.
Tabla 2mínimo y máximorangos de los parámetros seleccionadosen P-BD para la optimización deProducción de taxol
Tabla 4Diseño de Plackett-Burman para evaluar los factores que afectan la producción de Taxol porA. Favus
variables con efectos positivos demostraron que las producciones de Taxol se diversificaron notablementecon la condición probada en el rango de 96.5–302.7 µg/l. El rendimiento máximo deTaxol porA. Favus(302.7 µg/l) usando cisteína (0.50 g/l) a pH 6.0 y se incubódurante 15 días como se registra en la Tabla5. La producción mínima de Taxol se registró encorrida número 15, donde la cisteína (1.0 g/L) a pH 7.0 y se incubó durante 7 días. la estadisticaEl análisis del diseño del modelo lineal demuestra que el valor F es 87,08, lo que implica lasignificance of the model, and the values of "Prob>F" menor que 0.050 indica ese modelotérminos son significativos (Tabla6). Por lo tanto, la cisteína, el pH y el tiempo de incubación son importantestérminos del modelo. El análisis reveló que el "Pred. R-Squared" de 0.8972 está en un rango razonableacuerdo con el "Adj. R-Squared" de 0.9315. Relación "Adeq. Precision" de 30.800 medidasla relación señal/ruido, ya que es deseable una relación superior a cuatro, el Adeq.Los resultados obtenidos del experimento CCD fueron analizados por ANOVA que arrojóla siguiente ecuación de regresión al nivel de producción de Taxol: ecuación modelo de primer ordentérminos de factores codificados: Taxol Conc.{{0}} más 11,47 más 1,60A más 2,43B más 0,67C. el tridimensionalcurvas de superficie de respuesta que muestran el efecto de las interacciones de los más significativosLos parámetros, cisteína, pH y tiempo de incubación se muestran en la Fig.4.
medio de extracto de malta modificado obtenido del RSM por diseño de Plackett-Burman. Despuésincubación cultural bajo condiciones estándar, Taxol fue extraído y cuantificado por TLCy HPLC. A partir de los resultados obtenidos (Fig. S1), no hay un efecto significativo en Taxol proconductividad después de la irradiación a las diferentes dosis.
Síntesis de AuNPs y Conjugación con Taxol de A. favus Mediada por - Radiación
polivinilpirrolidona(Se sintetizaron nanopartículas de oro cubiertas con PVP (AuNP)mezclando PVP con cloruro de oro (III), mediado por radiación gamma a dosis de{{0}}.25–10.0 kGy, y los PVP-AuNP desarrollados se evaluaron a partir de UV-Vis, FT-IR,y análisis XRD. Se mostró el croquis de la formación del consorcio Taxol-PVP-AuNPsen la Fig.5. Se controló el tamaño de las PVP-AuNP desarrolladas mediadas por rayos gamma de 1.0 kGypor DLS, y fue de unos 50 nm (Fig.5). A partir de la imagen HRTEM, el esperadola forma y el tamaño de las AuNP sintetizadas se demostró con partículas esféricas dentroel rango de nanoescala de 20 a 30 nm con el diámetro principal promedio de 25 nm (Fig.5). Se observaron resultados similares con PVP-AuNP mediados por radiación gamma.49, 50]. Las propiedades espectrales de los AuNP desarrollados en respuesta a diferentes dosis de gammalos rayos se evaluaron a partir del análisis UV-Vis, con el espectro de absorción máximo registradoen λ540nm a 1,5–3.0 kGy. Además, se monitoreó el desarrollo de AuNPsde la inspección visual, con un plausible color amarillento a marrón, revelando la formaciónde AuNP.
La conjugación química de Taxol y PVP-AuNP se ha comprobado a partir del espectro FT-IR.análisis, como lo revela el ligero cambio de la intensidad y la relación de transmisión delos grupos funcionales de los conjugados Taxol-PVP-AuNPs en comparación con Taxol como control.La intensidad del pico en 3393.3 cm−1asignado para el hidroxilo (OH) en Taxol-PVPEl consorcio de AuNPs se incrementó en aproximadamente 3 veces en comparación con Taxol nativo, lo que revela laestiramiento químico en los grupos hidroxilo (Fig.5). Así como la intensidad de los picos1661.0cm−1refiriéndose a la frecuencia de estiramiento de C=O se incrementó fuertemente en alrededor de 10se pliega tras la conjugación con PVP-AuNP, asegurando el estiramiento de los enlaces C=O. Ella intensidad del pico 2923.5 correspondiente al estiramiento de CH alifático fue bastante estable. Aligero cambio en la intensidad de los picos observados en 1452.0 cm−1y 1404,0 cm−1ha sidoobservado debido a la frecuencia de estiramiento de NH. La intensidad del pico 1109,0 cm−1dela frecuencia de estiramiento del grupo carbonilo-oxígeno se redujo ligeramente tras la conjugación conPVP-AuNP.
La estructura cristalina/física del Taxol tras la conjugación con PVP-AuNPs fueresuelta a partir del análisis XRD (Fig.5). Desde el XRD, el Taxol-PVP-AuNPs consortium tenía la misma configuración estructural, orientación cristalina y tamaño del nativoTaxol, asegurando la falta de efecto negativo en la estructura cristalina del Taxol nativo. Delos resultados, la estructura amorfa y cristalina de Taxol-PVP-AuNP en comparación conel Taxol nativo ha sido confirmado. A partir del análisis XRD, la conjugación de Taxol yPVP-AuNPs se ha resuelto como se revela a partir de las propiedades de difracción relacionadas con2ɵ=38.18 grados, 44,01 grados, 64,57 grados, 77,67 grados y 81,74 grados que describen las observaciones de Braggen (111), (200), (220), (311) y (222), respectivamente. Todos los picos estaban relacionados con el ideal.tarjeta del Comité Conjunto sobre Estándares de Difracción de Polvo (JCPDS) de AuNP (JCPDSnúmero de tarjeta 04–0784) [51]. Entonces, se mostró la fuerza de los cristales de las AuNP sintetizadas,proporcionando la estructura cristalina cúbica centrada en las caras (fcc). Además, hay un simplepico amorfo a 19,25 grados para Taxol que se incluye en la organización y permanencia deAuNP. El patrón XRD confirmó la conjugación exitosa de Taxol y PVP-AuNP.El tamaño medio de los cristalitos de las AuNP incorporadas se determinó a partir de Scherrer.ecuación [52], y fue de 20,2 nm para el consorcio Taxol-PVP-AuNPs mediado por gammarayos como se menciona en la ecuación:
donde D es el tamaño promedio de los cristalitos, es el ancho completo a la mitad del máximo, λ es la radiografíalongitud de onda, θ es el ángulo de Bragg,yk es una constante
Actividad anticancerígena de los conjugados Taxol-PVP-AuNPs
Elactividad antiproliferativa de Taxol-PVP-AuNPsconjugados se evaluó contraLíneas celulares HEPG-2 y MCF-7, normalizándose a Taxol nativo y AuNP, por separado. Delos resultados (Fig.6), la bioactividad de Taxol aumentó drásticamente tras la conjugacióncon AuNPs, en comparación con Taxol nativo como control. Según lo revelado por el IC50valores, Taxol-El consorcio PVP-AuNPs mostró una actividad signifcativa contra HEPG-2 (2.2 µg/ml) yMCF-7 (3,3 µg/ml) en comparación con Taxol nativo y AuNP por separado. Entonces, al conjugarcon AuNP, la actividad de Taxol aumentó dos veces hacia las líneas celulares probadas.En cuanto a la bioactividad de las AuNPs, laactividad antiproliferativade los Taxol-PVP-AuNPsel consorcio aumentó aproximadamente 4 veces en comparación con AuNP como control. Curiosamente,la actividad del consorcio Taxol-AuNPs fue plausiblemente consistente con el Taxol auténtico.
Taxol de actividad antimicrobiana y AuNP sintetizados contra diferentesmicroorganismos
La Aactividad antimicrobianade lo extraídoA. FavusConsorcio Taxol y Taxol-AuNPsfue evaluado contra varias bacterias y hongos multirresistentes (Tabla7). Al conjugarcon AuNP, la actividad antimicrobiana de Taxol se ha incrementado fuertemente en comparacióna Taxol nativo y AuNP por separado, como se revela a partir del diámetro de inhibiciónzonas de los microorganismos probados (Fig.6). Como se muestra en la figura.6, el consor Taxol-AuNPStium mostró la actividad más alta contraE. aglomerados(11 µg/ml),C. albicans (12 µg/ mililitros), yE. coli(14 µg/ml), en comparación con el nativoA. FavusTaxol y auténtico. Eluna mayor actividad de Taxol tras la conjugación con AuNP autentica la biodisponibilidad,solubilidad y eficacia de Taxol para unirse con la proteína tubulina diana in vivo.
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