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Palabras clave:Aspergillus favus · Jojoba · Hongos endófitos · Nanopartículas de oro · Taxol · -Irradiación · Optimización nutricional

Introducción

Taxol es uno de los de amplio espectro más comercializados.medicamentos contra el cancer[1]. La actividad de Taxol se elabora a partir de su especificidad única para unirse con el heterodímero de subunidades de tubulina celular, promoviendo la polimerización de tubulina, interrumpiendo así la división mitótica de las células tumorales [2]. Taxol mostró una fuerte actividad contra los cánceres de mama, pulmón, cabeza y cuello, útero y formas avanzadas de sarcoma de Kaposi [3]. Taxol se produjo en primer lugar a partir de la corteza de los árboles de tejo Taxus brevifolia "familia Taxaceae" [4, 5]; sin embargo, el menor rendimiento de Taxol que siendo<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as asma,inflamación, ycáncer[32]. Por lo tanto, el objetivo principal de este trabajo fue explorar un nuevo hongo aislado de la planta de jojoba con una estabilidad metabólica única para la producción de Taxol, evaluar los diferentes enfoques para maximizar su rendimiento en Taxol y mejorar la actividad antiproliferativa de los compuestos de Taxol extraídos. vía conjugación con nanopartículas de oro, mediada por radiación gamma.

Material y métodos

Aislamiento y Cultivo de Hongos Endófitos

Se recolectaron diferentes partes de jojoba (Simmondsia chinensis) como hojas, cortezas, ramitas y brotes de la Facultad de Agricultura de la Universidad de El Cairo, y se usaron como fuente de hongos endófitos. Las partes de la planta se recolectaron y lavaron con agua corriente del grifo, se esterilizaron superficialmente con etanol al 70 por ciento durante 1 minuto y luego se enjuagaron con agua estéril [28]. Las partes de la planta esterilizadas en la superficie se cortaron en trozos pequeños en condiciones estériles y se colocaron en placas de medio de agar papa dextrosa (PDA), Czapek's-Dox y medio de agar de extracto de malta [33-36], y las placas se incubaron a 30 grados durante 10 días. La efectividad de la esterilización superficial de las partes de la planta se evaluó centrifugando el agua de enjuague, luego se agregaron 500 ul de agua estéril al precipitado y se sembraron en medio PDA [37]. Los aislados de hongos endófitos purificados se inocularon en inclinaciones de PDA durante 7 días y se almacenaron a 4 grados.

Detección, extracción y cuantificación de taxol a partir de hongos endófitos

Los hongos endófitos recuperados que habitan en la jojoba se seleccionaron para la producción de Taxol cultivándolos en caldo de papa dextrosa (PDB) [38]. Se inoculó un tapón de cada uno de los aislados de hongos de 7 días de edad en 100 ml de PDB/250 ml de tareas de Erlenmeyer, se incubaron durante 15 días a 30±1 grados, en condiciones de agitación (120 rpm). Después de la incubación, los cultivos se filtraron y el filtrado se modificó con bicarbonato de sodio al 0,2 por ciento para precipitar los ácidos grasos. El taxol se extrajo con diclorometano, la fase orgánica se recogió y se evaporó hasta sequedad y los residuos se volvieron a disolver en metanol [17, 39]. El taxol se separó e identificó por TLC utilizando placas de gel de sílice pre-recubiertas de Merck de 1 mm (20 × 20 cm) (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Alemania), detectadas por iluminación UV a 254 nm [39]. Las supuestas manchas de Taxol se rasparon de las placas de gel de sílice de TLC y se disolvieron en metanol, se agitaron vigorosamente durante 10 min y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min. Se eliminaron las partículas de sílice precipitadas y se tomó el sobrenadante para cuantificación de taxol y control de pureza por HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 más Quaternary Pump, Corea) de columna de fase inversa C18 (Eclipse Plus C18 4).6 ×150 mm, 3,5 μm, n.° de catálogo 959,963–902). La fase móvil utilizada fue metanol/acetonitrilo/agua (25:35:40, v/v/v) a un caudal de 1,0 ml/min durante 20 min [40], y las fracciones de Taxol se midieron a 227 nm, y su la identidad química y las concentraciones se confirmaron a partir del tiempo de retención y el área del pico de absorción en comparación con la muestra auténtica.

Identificación morfológica y molecular de los hongos endófitos recuperados

Los aislados fúngicos endofíticos se identificaron en sus niveles de especie en función de sus características macro y micromorfológicas al crecer en PDA, Czapek's-Dox y medios de extracto de malta de acuerdo con las claves de referencia [33–36]. La identidad de los aislados fúngicos productores de taxol más potentes se confirmó molecularmente en función de la secuencia del espaciador transcrito interno (ITS) [41, 42]. El ADN genómico fúngico (ADNg) se extrajo pulverizando el micelio (~0,2 g) en nitrógeno líquido y luego dosificándolo en 1 ml de tampón de extracción CTAB (2 % de CTAB, 2 % de PVP40, { {21}}.2 por ciento de 2-mercaptoetanol, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M en Tris-HCl 100 mM, pH 8,0). Los conjuntos de cebadores de PCR fueron ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ e ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. La reacción de PCR contiene 10 ul de mezcla maestra 2xPCR (i-Taq™, Cat. No. 25027), 2 ul de gDNA, 1 ul de cada cebador (10 pmol/ul), y se completa hasta 20 ul con agua destilada estéril. agua. La PCR se programó para una desnaturalización inicial a 94 grados durante 2 min, desnaturalización a 94 grados durante 30 s, hibridación a 55 grados durante 10 s, extensión a 72 grados durante 30 s durante 35 ciclos y extensión final a 72 grados durante 2 mín. Los amplicones de PCR se analizaron con gel de agarosa al 1,5 % en tampón TBE 1x (Ambion Cat# AM9864), utilizando una escala de ADN de 1 kb (Cat.# PG010-55DI) y se visualizaron mediante un sistema de documentación de gel. Los amplicones se purificaron y secuenciaron mediante Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, versión 6.0 con los mismos conjuntos de cebadores. Las secuencias obtenidas se buscaron con BLAST de forma no redundante en la base de datos NCBI, se importaron al software MEGA 6.0 y se alinearon con el algoritmo muscular Clustal W [43] y el árbol filogenético se construyó con el método de unión de vecinos de MEGA 6.0 [44].

Estructura química del taxol extraído

Las supuestas manchas de Taxol se rasparon de las placas de gel de sílice de TLC y se purificaron, y la pureza y la concentración se determinaron mediante análisis UV-Vis a λ 227 nm (RIGOL, serie Ultra-3000) en comparación con Taxol auténtico [39]. Se usaron medios en blanco en las mismas condiciones como línea de base negativa para los análisis espectrofotométricos. El espectro FT-IR de las muestras de Taxol purificado se analizó con un espectrofotómetro JASCO FT-IR 3600. La muestra de Taxol se molió con gránulos de KBr, se presionó en discos al vacío y la absorción se midió en la región de 400 a 4000 cm−1 [3], en comparación con la auténtica. La estructura química del Taxol extraído se confirmó a partir de la espectroscopia HNMR (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) en comparación con el Taxol auténtico. Las muestras se disolvieron en CDCl3, los desplazamientos químicos se dan en ppm (escala δ) y las constantes de acoplamiento se expresan en hercios (Hz).

Efecto de diferentes tipos de medios en la producción de taxol

Se inocularon por triplicado dos tapones de agar (9 mm) de cultivos de 7 días de edad de cada aislado fúngico en 100 ml de medio/250 ml de matraz Erlenmeyer de papa dextrosa (PDB), Czapek's-Dox (CZD), M1D y extracto de malta (ME ) medio de caldo. Los controles no inoculados de cada medio que están libres de esporas fúngicas se usaron como control negativo, se incubaron a 30 grados durante 15 días en las mismas condiciones. Después de la incubación, se filtraron los cultivos fúngicos y se extrajo y determinó Taxol como se mencionó anteriormente.

Optimización de Bioprocesos de las Condiciones Nutricionales para Maximizar el Rendimiento de Taxol

La optimización de la composición del medio para maximizar el rendimiento de Taxol por parte del aislado fúngico potente se llevó a cabo mediante la metodología de superficie de respuesta utilizando el diseño de Placket-Burman seguido de un diseño compuesto central [17–20, 45]. A partir de los diseños de RSM, las variables positivas y significativas que afectan la producción de Taxol por parte del aislado fúngico potente se evaluaron utilizando el paquete de software estadístico de Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, EE. UU.). Cada experimento se realizó en tres réplicas biológicas y se consideraron los valores medios. Después de la incubación en las condiciones deseadas, se filtró la biomasa fúngica y se extrajo y cuantificó Taxol por TLC y HPLC como se describe anteriormente.

Tapeta‑Diseño birmano

El diseño de placket-Burman se ha utilizado con frecuencia para la optimización del componente del medio para el crecimiento fúngico y la producción de metabolitos secundarios bioactivos, evaluando las variables significativas que afectan la producción de Taxol [18, 20, 46]. La elección del factor se basó en los medios utilizados en el cribado cualitativo y cuantitativo. Se han incluido once factores; extracto de malta, peptona, sacarosa, soja, glutamina, extracto de carne de res y temperatura, pH, tiempo de incubación y valores y factores de velocidad de agitación se variaron en dos niveles, y se seleccionaron los rangos de niveles mínimo y máximo. Se utilizó el Design-Expert 7.0 estadístico para generar un conjunto de 12 experimentos. Para cada experimento, se determinó la producción de Taxol en tres réplicas biológicas y se consideró el rendimiento promedio de Taxol.

El análisis de regresión de los datos se realizó utilizando software estadístico. Se calculó el efecto de cada variable (Biometrika, 2020), utilizando la siguiente ecuación:

donde E es el efecto de una variable de prueba, M plus y M− son la concentración de Taxol de las pruebas en las que el parámetro estaba en sus niveles más alto y más bajo respectivamente, y N es el número de experimentos que se llevaron a cabo. El efecto de cada variable sobre la producción se determinó calculando sus respectivos valores E.

Donde Tot alto es el total de respuestas en el nivel alto, Tot bajo es el total de respuestas en el nivel bajo y No es el número de intentos.

Diseño compuesto central e interacciones entre factores que afectan la producción de taxol

Los factores positivos más significativos que afectan la producción de Taxol por parte del aislado fúngico seleccionado se optimizaron utilizando un diseño experimental de modelo CCD de tipo de superficie de respuesta [47]. Mediante el uso de CCD se optimizaron las concentraciones de los componentes del medio y se utilizaron sus interacciones estudiadas para generar un total de 20 experimentos para las tres variables. Para determinar los niveles óptimos de las variables para la producción de Taxol a partir del aislado fúngico potente, se trazaron curvas de superficie de respuesta tridimensionales (3D) para estudiar la interacción entre los diversos factores y determinar la condición variable de cada factor que afecta la producción de Taxol. Los gráficos 3D se realizaron manteniendo las constantes de tres factores en un nivel ideal y trazando la respuesta obtenida del rendimiento de Taxol para niveles variables de los otros dos factores.

Efecto de la irradiación gamma sobre el rendimiento de taxol

Los aislados endófitos potentes que producen Taxol se expusieron a irradiación con una fuente de 60cobalto (célula gamma 4000-A-India) a diferentes dosis de radiación gamma (0.25–3.0 kGy) en comparación al control del cultivo no irradiado; una tasa de dosis de 1,2 kGy/h en el momento de los experimentos. Los medios optimizados fueron inoculados por el cultivo irradiado en condiciones de cultivo estándar, en comparación con el inóculo de esporas no irradiadas como control. Los cultivos se incubaron a 30±2 grados durante 15 días en un agitador rotatorio (120 rpm). Después de la incubación, los cultivos se filtraron y Taxol se extrajo, purificó y cuantificó por TLC y HPLC como se describe anteriormente.

Síntesis y Caracterización de Nanopartículas de Oro (AuNPs); Conjugación con Taxol

Actividad anticancerígena de Taxol

La actividad de los conjugados de Taxol y Taxol-PVP-AuNP purificados contra el carcinoma de hígado (HPG2) y el carcinoma de mama (MCF7) se determinó mediante 3- (4,5-dimetiltiazol- 2-il) -2,5-ensayo de bromuro de difeniltetrazolio (MTT) [48]. La 96-placa de pocillos se sembró con 103 células por pocillo y se incubó durante la noche a 37 grados, luego se añadieron diferentes concentraciones del fármaco y las placas se incubaron de nuevo durante 48 h. Se añadió el reactivo MTT (25 ul), se incubó durante 2 hy se midió el color púrpura del complejo de formazán desarrollado a λ570 nm. El valor IC50 se expresó por la cantidad de fármaco que reduce el crecimiento del 50 por ciento de un número inicial de células tumorales que se normalizan al control positivo.

Actividad antimicrobiana de taxol y conjugados de Taxol-AuNP

La actividad antimicrobiana de los conjugados Taxol y Taxol-AuNP se evaluó frente a diferentes aislados bacterianos; Bacillus subtilis ATCC 6633 y Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Enterobacter agglomerans, además de Candida albicans. Las células bacterianas analizadas se suspendieron en agua con peptona estéril para obtener un inóculo estándar de ~0,5 McFarland (1–1,5) × 1{{10}}8 CFU/ml a λ6{{18 }}0 nm. La inhibición del crecimiento (mm) del crecimiento de patógenos microbianos se evaluó mediante el método de difusión en disco de agar. Se usaron discos de antibióticos estándar estériles con un diámetro de 6,0 mm como controles positivos. Se cargaron discos de antibiótico estériles (6,0 mm) con 20 ul de metanol y amoxicilina-ácido clavulánico (AMC) como control negativo y positivo. Los discos se cargaron con la misma concentración de Taxol, Taxol-PVP-AuNP y AuNP (1,0 ug/ml). Se prepararon tres réplicas biológicas. Las placas se incubaron a 37 grados durante 24 h y se midieron las zonas de inhibición. Se utilizaron amoxicilina, ácido clavulánico (AMC) y nistatina para normalizar la actividad antimicrobiana de Taxol. La zona de inhibición del crecimiento se determinó con un pie de rey (mm).

Análisis estadístico

Identificación Morfológica y Molecular de los Potentes Productores de Taxol

Las características morfológicas del aislado fúngico potente que produce Taxol se examinaron de acuerdo con las claves descriptivas macroscópicas y microscópicas, como se describe en Materiales y Métodos, y revelaron su proximidad morfológica con A. favus (Fig. 2). El aislado fúngico se cultivó en PDA a 30 grados durante 10 días y las características macroscópicas y microscópicas revelaron su identidad, como cabezas conidiales, modo de ramificación, identidad del estigma, ontología conidial y formación de cuerpos fructíferos, de acuerdo con el estándar universal. claves morfológicas [33], y se encontró que eran idénticas a Aspergillus favus. El potente aislado productor de taxol A. favus se identificó además en función de sus secuencias ITS, utilizando gDNA como plantilla. Los amplicones de PCR (~550 pb) de A. favus se resolvieron, purificaron y secuenciaron (Fig. 2). La secuencia ITS de A. favus se buscó de forma no redundante en la base de datos del NCBI, mostrando un 99 % de similitud con A. favus, con cero valores de E. y una cobertura de consulta del 95 %. Por lo tanto, a partir de los análisis microscópicos y moleculares, el aislado objetivo se confirmó como A. favus y se depositó en GenBank con el número de acceso MW485934.1, y el aislado se depositó en el Centro Micológico de la Universidad de Assiut (AUMC), Egipto con un número de depósito AUMC13892. El aislamiento actual tenía una similitud del 99 % con los aislamientos de A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Fig. 1 Vista morfológica de la planta de jojoba. B Cultivos en placa de los potentes hongos endófitos productores de Taxol; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) y A. oryzae Bd (25) en PDA después de 8 días de incubación a 30 grados. Los aislados fúngicos se cultivaron en PDB, se incubaron en las condiciones estándar y se extrajo el taxol y se controló mediante TLC (C). D Cromatograma de HPLC de Taxol de los potentes aislados fúngicos. E Rendimiento de Taxol cuantificado a partir de HPLC. F, análisis espectral UV-Vis de Taxol extraído de los aislados fúngicos. Análisis G FT-IR de Taxol extraído en comparación con uno auténtico

Fig. 2 A Características macromorfológicas de A. favus un endófito de jojoba después de 3, 5 y 8 días de crecimiento en PDA. Rasgos micromorfológicos, cabeza conidial de A. favus por aumento de 400X. C PCR amplicón de la región ITS de A. favus de 500 pb, normalizándose a una escala de 1 kb (Cat.#. SM0312). D Análisis filogenético de ITS A. favus por método de máxima verosimilitud [44]