Cambios en los perfiles de aminoácidos y compuestos bioactivos de los capullos de seda tailandeses afectados por la extracción de agua, parte 2

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2.8. Correlaciones

Se utilizó un análisis de correlación (prueba de Pearson) para hacer comparaciones (como coeficientes de correlación, r) entre los valores de contenido fenólico total, contenido total de flavonoides, DPPHactividad de eliminación de radicales, ABTS plus, ensayo FRAP, anti- -amilasa , anti- -glucosidasa y antiglicación de SPE en las cepas Nangsew y Eri (Tablas 5 y 6). Cada parámetro obtenido del estudio demostró fuertes correlaciones positivas entre TPC, TFC, DPPH, ABTS, FRAP anti- -amilasa, anti- -glucosidasa y antiglicación. Esto puede deberse a que los compuestos bioactivos presentes en el extracto de seda son capaces de eliminar varios radicales libres y anti- -amilasa, anti- -glucosidasa y antiglicación. Nuestros hallazgos también han demostrado que existe una correlación lineal altamente significativa entre los resultados de las dos cepas. Estos resultados coincidieron con los de Benzie y Stezo [29], quienes encontraron una fuerte correlación positiva entre el contenido fenólico total y el ensayo FRAP. También se encontraron resultados similares entre TPC y DPPH (R2=0.711) y FRAP (R2=0.948), respectivamente en calabaza amarga según lo informado por Kubola [30]. Kumar et al.[31] realizaron una evaluación de la actividad antioxidante y fenoles totales en diferentes variedades de hojas de Lantana Camara. Los extractos mostraron fuertes correlaciones entre el contenido fenólico y las actividades de eliminación de DPPH, FRAP y ABTS. La correlación más alta (r=0.998, R2=0.997) se encontró entre el contenido fenólico total y el ensayo de eliminación de ABTS. Además, Kaewseejan et al. informaron correlaciones positivas entre ABTS y TPC (R2=0.885) y DPPH (R2=0.999), respectivamente, en hojas de Gynura procumbens. [32].

Las correlaciones entre las propiedades biológicas y la actividad inhibidora se encontraron en la investigación de Quan et al.[33] quien investigó las propiedades antioxidantes y posibles inhibidoras de la diabetes de los extractos de corteza de C.tramdenum. Sus resultados también encontraron queantioxidanteLos ensayos (incluidos DPPH, ABTS, poder reductor y óxido nítrico) se correlacionaron fuertemente con el ensayo inhibidor de -amilasa y -glucosidasa en p<>

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3. Materiales y Métodos 3.1.Coc00ns de seda

Se recogieron cepas Nangsew y Eri de capullos de seda tailandeses. losCepa Nangsew(capullos amarillos) se obtuvo de Baan Hua Saban, distrito de Phutthaisong, provincia de Buriram, Tailandia. La variedad Eri (capullos blancos) proviene de la comunidad Nong Ya Plong, Mancha Khiri, provincia de Khon Kaen, Tailandia.

3.2. Sustancias químicas y reactivos

Todos los estándares se obtuvieron de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EE. UU.), incluidos los aminoácidos esenciales: fenilalanina, valina,triptófano, treonina, isoleucina, metionina, histidina, arginina, lisina y leucina. Los aminoácidos no esenciales estudiados fueron glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, glutamina, serina, tirosina, alanina y asparagina. Los reactivos para la determinación de la actividad antioxidante se obtuvieron de Sigma-Aldrich Co:Folin-Ciocalteu reactivo,2,2-difenil-1-picrilhidrazil(DPPH),2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ), 2,2'-y-bis(3-tilbenztiazolina-6-ácido sulfónico)(ABTS). Los disolventes y reactivos utilizados en el análisis HPLC se adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania). La -amilasa (de Aspergillus oryzae), -Glucosidasa (de Bacillus stearothermophilus), p-nitrofenil- -D-glucopiranósido (PNP-G), albúmina de suero bovino (BSA) y azida de sodio se adquirieron de Sigma-Aldrich. Co.

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3.3. Extracción con Agua Destilada

La extracción se llevó a cabo utilizando el método de Sangwong et al. [34]. Los capullos de seda se cortaron en trozos pequeños. Dos gramos de estas piezas se extrajeron con 200 mL de agua destilada a 100 grados por los tiempos de extracción especificados. Los extractos se centrifugaron a 5000 × g durante 10 minutos mediante centrífuga (Universal 320/320R, Hettich, Boucherville, QC, Canadá). Los extractos se filtraron a través de papel Whatman No.1 al vacío para eliminar el material insoluble, produciendo así el extracto de proteína de seda (SPE).

3.4. Determinación de proteínas

La determinación de proteínas se determinó descrita por el ensayo de Bradford [35]. Se añadió SPE (0,5 mL) a 1,0mL de solución de Bradford y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Se usó albúmina de suero bovino (BSA) como proteína de referencia estándar. La absorbancia de las muestras se midió a 595 nm con un espectrofotómetro visible (espectrofotómetro portátil DR 2700rM, Hach, Loveland, CO, EE. UU.).

3.5.Amin0-Contenido de ácido por LCMS/MS

El análisis de aminoácidos involucró un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo LC-MS-MS (Shimadzu LCMS-8030), un modo de ionización por electropulverización (ESI), seguido de un análisis en un sistema HPLC Shimadzu (Shimadzu, Kioto, Japón) (Chumroenphat et al. [36]. El análisis HPLC implicó un caudal de 0,2 ml/min; la temperatura del horno de la columna era de 38 grados y la del automuestreador de 4 grados. Las fases móviles se prepararon (A) ácido fórmico acuoso {{10}}.1 por ciento (o/o) y (B) el metanol-agua (50:50); luego el mezclador fue ácido fórmico 0.1 (o/v). La aguja del muestreador automático se purgó con metanol antes y después de la aspiración de la muestra. Los análisis se realizaron por triplicado.

3.6. Contenido fenólico total (TPC)

El contenido fenólico total en el extracto de proteína de seda se analizó siguiendo el método de Folin-Ciocalteu [30]. Brevemente, se mezclaron 0,3 ml de SPE con 2,25 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu al 10 por ciento disueltos en agua destilada. Después de 5 min de incubación, se añadieron 2,25 ml de solución de carbonato de sodio al 6 % (NazCO) y se dejó reposar la mezcla durante 90 min a temperatura ambiente. La absorbancia de las muestras de solución se midió a 725 nm utilizando un espectrofotómetro. El TPC en frijoles se expresó como mg equivalentes de ácido gálico (GAE) por g de peso seco (mg GAE/g DW). Los análisis se realizaron por triplicado.

3.7. Contenido total de flavonoides (TFC)

Los contenidos totales de flavonoides de SPE se determinaron según Kubota y [30], modificado. Brevemente,0.5 ml de cada solución de muestra se mezcló con 2.25 ml de agua destilada y 0.15 ml de solución de NaNO al 5 por ciento (p/v). Se dejó reposar la solución durante 6 minutos y luego se añadieron 0,3 ml de AlCl3 al 10 por ciento (p/v) a la solución. Después de 5 min, se añadieron 0,1 ml de solución de NaOH 1 M (w/ø) y luego se midió la absorbancia a 510 nm usando un espectrofotómetro. Los resultados se expresaron como mg de equivalentes de rutina (RE) por g de peso seco (mg RE/g DW).

3.8. Actividad de eliminación de radicales DPPH

Las actividades antioxidantes de la SPE se determinaron como la actividad depuradora del radical libre estable 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) según Brand-Williams et al.[37]. Se añadió extracto de proteína de seda 0,1 ml a 3 ml de 0,001 M DPPH en metanol. La mezcla se mantuvo durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. La absorbancia se determinó a 517 nm utilizando un espectrofotómetro. La ecuación para calcular la inhibición de DPPH fue la siguiente:

(1) Inhibición (porcentaje)=[(Control abs.- Muestra abs.)/Abs. mando]×100)

donde los Abs. la muestra es la absorbancia de la muestra y Abs. el control es la absorbancia del control.

3.9.Actividad antioxidante por ensayo ABTS

El método catiónico radical ABTS de Re et al. (1999) [22] fue modificado para evaluar los efectos de eliminación de radicales libres. La solución de trabajo de ATBS se preparó combinando ABTS 7,4 mM y persulfato de potasio 2,6 mM en una proporción de 1:1 (v/v), dejándola reaccionar en la oscuridad durante 12 h a temperatura ambiente y luego diluyéndola con agua desionizada. . La absorbancia se determinó a 734 nm usando un espectrofotómetro hasta que alcanzó 1.1 ±0.02. Luego se hicieron reaccionar 150 μL de SPE y 2850 μL de la solución de trabajo de ATBS en la oscuridad durante 2 h con mezclado, y el absorbancia a 734 nm usando un espectrofotómetro; se usó metanol al 100 por ciento como control. La ecuación para calcular la inhibición fue la Ecuación (1).

3.10. Ensayo de poder antioxidante/reductor férrico (FRAP)

El poder reductor de los extractos se basó en el ensayo FRAP [23]. El reactivo FRAP fresco se preparó mezclando 100 ml de tampón acetato (0,3 mol LI, pH 3,6), 10 ml de solución de TPTZ disueltos en 10 ml de 40 mmol L-1HC y 10 ml de 20 mmolL -1FeCl; en una proporción de 10∶1∶1 y, 120 ml de agua destilada a 37 grados. Brevemente, se agregaron 60 μL de SPE y 180 μL de agua desionizada a 1,8 mL de reactivo FRAP. La solución se agitó mediante mezcla vorticial. Después de incubar la solución en un baño de agua a 37 grados durante 4 min, se midió la absorbancia a 593 nm frente a un control. Los valores de FRAP se mostraron como mg FeSO4 por g de base seca (mg FeSO4/g DW).

3.11.Actividad Inhibidora frente a la Enzima -Amilasa

-La actividad inhibidora de la enzima amilasa se midió usando el método de Xiao et al. (2006)[38] con ligeras modificaciones. El sustrato se preparó hirviendo 100 mg de almidón de patata en 5 ml de tampón fosfato (pH 7,0) durante 5 min y luego enfriando a temperatura ambiente. Se mezclaron SPE (50 μL), sustrato (300 μL) y solución de amilasa de 5 ug/mL (20 μL) y la solución se incubó a 37 grados durante 15 min. La reacción se detuvo agregando 50 μL de HCl 1 M y luego se agregaron 50 μL de solución de yodo. La absorbancia se midió a 650 nm con un lector de microplacas. Se utilizó acarbosa como control positivo. El porcentaje de inhibición de x-amilasa se evaluó como la Ecuación (1).

3.12.Actividad Inhibidora frente a la Enzima -Glucosidasa

El ensayo de inhibición de la enzima -glucosidasa se realizó de acuerdo con el método de Wang y Zhao[39].SPE (2 mL disueltos en dimetilsulfóxido; DMSO) y 0.5 U/mL a-glucosidasa (40 mL) se mezclaron en 120 mL de tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,0). Después de 5 min de preincubación, se añadió solución de p-nitrofenil- -D-glucopiranósido 5 mM (40 ml) y la solución se incubó a 37 grados durante 30 min. La absorbancia se midió a 405 nm mediante un lector de microplacas de espectrofotómetro de absorbancia UV/Vis. El porcentaje de inhibición de -glucosidasa se evaluó como la Ecuación (1).

3.13.Evaluación de la Actividad de Formación de Anti-AGEs

Las capacidades inhibidoras de la formación de AGE de la proteína de seda y sus fracciones se midieron utilizando el método de Vinson y Howard [40]. El volumen total de la solución de reacción de glicación (2,5 mL) se preparó mezclando 5{{10}}0 μL de SPE, 500 μL de 20 mg/mL de BSA en tampón de fosfato, 500 μL de glucosa 0,5 M en tampón de fosfato y 1 ml de tampón de fosfato 0,1 M a pH 7,4 que contiene 0,02 por ciento (p/v) de azida de sodio. Esta mezcla se incubó a 37 grados durante 5 días en la oscuridad y luego se determinó el número de AGE fluorescentes formados usando un espectrómetro fluorescente con una longitud de onda de excitación de 330 nm y una longitud de onda de emisión de 410 nm. El porcentaje de formación de anti-AGE se calculó en función de la intensidad fluorescente (FI) resultante mediante la siguiente ecuación:(2) n =[1-(FImuestra - FImuestra en blanco)/(control-control en blanco )]×100 donde Flsample es la intensidad de fluorescencia de la muestra, el blanco de muestra es la intensidad de fluorescencia del blanco de muestra, el control es la intensidad de fluorescencia del control y el blanco de control FI es la intensidad de fluorescencia del blanco de control de muestra.

3.14. Análisis estadístico

Todos los datos fueron analizados por el software SPSS (IBM SPSS, Chicago, IL, EE. UU.). Los resultados se informan como la media ± desviación estándar (DE) de tres repeticiones y los datos se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de diferencia mínima significativa (LSD) para determinar la importancia relativa al control y la correlación de Pearson. prueba para evaluar las correlaciones entre las medias. En todos los casos p<0.05 was="" considered="">

4. Conclusiones

Nuestro estudio de los efectos de la extracción de proteína de seda implicó la extracción con agua destilada a 100 grados durante seis horas; este procedimiento proporcionó los valores más altos de contenido de proteínas, aminoácidos, contenido fenólico total (TPC), contenido total de flavonoides (TFC), actividad de eliminación de radicales DPPH, ensayo de capacidad de eliminación de radicales ABTS, ensayo FRAP, anti- -amilasa, anti-a-glucosidasa y anti-glicación en comparación con otros tiempos de extracción. Además, el SPE de las cepas Nangsew proporcionó mayores contenidos de todas estas sustancias nutricionalmente beneficiosas, en comparación con los extractos de las cepas Eri. Los resultados sugieren que Nangsew sería la cepa preferida para nuestros planes en curso para desarrollar un aditivo natural para alimentos funcionales, basado en la sericina extraída durante el tratamiento de capullo, que brinda oportunidades para una alternativa en la producción de bebidas funcionales.

Contribuciones de autor:Conceptualización, CBy SS; Metodología, CBy SS; Validación, CB y SS; Análisis Formal, CB y SS; Investigación, CB y SS; Redacción—Preparación del borrador original, CB y SS; Redacción: revisión y edición, CB y SS; Visualización, CBandS.S. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos:Esta investigación fue financiada por Thailand Science Research and Innovation (TSRI) y Siam Natural Products Co., Ltd.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:No aplica.

Declaración de consentimiento informado:No aplica. Declaración de disponibilidad de datos: No aplicable.

Expresiones de gratitud:El Centro de Equipos de Laboratorio de la Universidad de Mahasarakham por la cooperación y las ayudas científicas proporcionadas. Gracias también a Colin Wrigley, Universidad de Queensland, Australia, por la revisión en inglés.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Este artículo está extraído de Molecules 2021, 26, 2033. https://doi.org/10.3390/molecules26072033 https://www.mdpi.com/journal/molecules