Dirigirse a la lactato deshidrogenasa A con catequina vuelve a sensibilizar las células de cáncer gástrico SNU620/5FU al 5-fluorouracilo Parte 1

Por favor contactaroscar.xiao@wecistanche.compara más información

Resumen:La resistencia a la terapia contra el cáncer se produce prácticamente en todos los tipos de cáncer y se convierte en una dificultad importante en el tratamiento del cáncer. Aunque el 5-fluorouracilo (5FU) es la opción de primera línea de terapia contra el cáncer para el cáncer gástrico, su eficacia es limitada debido a la resistencia a los medicamentos. Recientemente, el metabolismo alterado del cáncer, incluido el efecto Warburg, una preferencia por la glucólisis en lugar de la fosforilación oxidativa para la producción de energía, se ha aceptado como un mecanismo fundamental que regula la resistencia a la quimioterapia. Por lo tanto, investigamos el mecanismo detallado y la posible utilidad de los agentes antiglucolíticos para mejorar la resistencia al 5FU utilizando líneas celulares de cáncer gástrico establecidas, SNU620 y SNU620/5FU. deenzimas relacionadas con la glucólisis, como la lactato deshidrogenasa A (LDHA), que las de las células originales SNU620. Para limitar la glucólisis, examinamos la catequina y sus derivados, que se conocenantiinflamatorioy productos naturales anticancerígenos porque el galato de epigalocatequina se ha informado previamente como un supresor de la expresión de LDHA. La catequina, el compuesto más simple entre ellos, tuvo el mayor efecto inhibitorio sobre la producción de lactato y la actividad de LDHA. Además, la combinación de 5FU y catequina mostró citotoxicidad adicional e indujo apoptosis mediada por especies reactivas de oxígeno (ROS) en células SNU620/5FU. Por lo tanto, en base a estos resultados, sugerimos la catequina como candidata para el desarrollo de un nuevo fármaco adyuvante que reduce la quimiorresistencia al 5FU al restringir la LDHA.

Palabras clave:5-fluorouracilo;quimiorresistente; glucólisis; lactato deshidrogenasa; catequina

Por favor haga clic aquí para saber más

1. Introducción

Se ha logrado un progreso notable en el tratamiento del cáncer gástrico con resección quirúrgica del tumor primario y quimioterapia combinada basada en 5-fluorouracilo (5FU), como epirubicina, cisplatino y fluorouracilo y docetaxel, oxaliplatino y 5FU[1 ,21 Hasta la fecha, el 5FU, un análogo del uracilo que bloquea la síntesis de ADN mediante la inhibición de la timidilato sintasa [3], sigue siendo un fármaco de quimioterapia de uso común para el tratamiento del cáncer gástrico [1, A4]. Sin embargo, la eficacia clínica de la quimioterapia ha sido insatisfactoria debido a la recaída del cáncer primario o metastásico relacionado con la resistencia a los medicamentos [1,5].

Cistanche puede mejorar la inmunidad

Varios procesos celulares se consideran mecanismos clave subyacentes a la quimiorresistencia, incluida la activación o inactivación de fármacos, la maquinaria de reparación del daño del ADN, las modificaciones en los objetivos de los fármacos, la inactivación de las vías apoptóticas y el aumento de la autofagia [6,7]. El cáncer es heterogéneo y varios cánceres utilizan tanto la glucólisis como la fosforilación oxidativa para el metabolismo energético [8]. Sin embargo, se ha informado que la reprogramación metabólica, especialmente la glucólisis aeróbica anormal, juega un papel clave en el desarrollo de resistencia a los fármacos quimioterapéuticos, incluido el 5FU, en el cáncer gástrico [9]. La lactato deshidrogenasa A (LDHA) y la piruvato deshidrogenasa quinasas (PDK) son reguladores clave de la glucólisis aeróbica que produce lactato a partir de piruvato [10,11]. La combinación de dicloroacetato, un inhibidor establecido de PDK, restaura la sensibilidad hacia el 5FU [12]. Además, se ha informado que la LDHA, una enzima clave que cataliza la conversión de piruvato en lactato, es un objetivo potencial para el tratamiento del cáncer gástrico [13,14]. La eliminación de la expresión de LDHA en las células cancerosas inhibe la tumorigenicidad mediante el aumento de la respiración mitocondrial y la reducción de la viabilidad celular [15]. Varios inhibidores de LDHA, como FX11, PSTMB y GSK 2837808A, disminuyen los niveles de ATP y generan estrés oxidativo, y finalmente causan la muerte celular apoptótica [16-18]. Aunque un estudio demostró que la inhibición de LDHA por microARN-34a recuperó la resistencia al 5FU en el cáncer de colon [19], ningún estudio previo ha informado los efectos de los inhibidores genéticos o farmacológicos de LDHA sobre la quimiorresistencia.

Los polifenoles del té verde, que incluyen catequina (CA), epicatequina (EC), galocatequina (GC), epigalocatequina (EGC), epicatequina-3-galato (ECG) y epigalocatequina-3-galato (EGCG), promueven la salud mediante la prevención y el tratamiento de varias enfermedades, como la inflamación, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares y el cáncer maligno [20,21]. Entre los polifenoles, el EGCG mejora la quimiosensibilidad al 5FU en células de cáncer colorrectal y carcinoma hepatocelular al activar las vías de AMPK y restringir la troncalidad del cáncer [22,23]. Además, se ha informado que EGCG inhibe la LDHA al reprimir sus expresiones en las células de cáncer de mama y de páncreas [24,25].

En este estudio, planteamos la hipótesis de que CA podría ser un candidato para un fármaco adyuvante para reducir la resistencia al 5FU en las células de cáncer gástrico. Se examinó que el efecto inhibitorio de CA, y/o su combinación con 5FU, sobre la actividad de LDHA indujo así especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales y muerte celular apoptótica en células resistentes a 5FU.

2. Resultados

2.1. Características glicolíticas de las células resistentes a 5FU

La proliferación mejorada es una característica de la quimiorresistencia, incluidas las células cancerosas resistentes al 5FU [26,27]. Primero, confirmamos la resistencia a 5FU y las tasas de crecimiento a largo plazo de las células SNU620 y SNU620/5FU. Cuando estas células se cultivaron con las concentraciones indicadas de 5FU durante 48 h, la dosis estimada que causó una inhibición del crecimiento del 50 por ciento (Gl50) en células SNU620/5FU (100,63 uM) fue mucho mayor que la que causó GIso en sus células SNU620 parentales (28,88 μM) ）（Figura 1A y Figura Suplementaria S1）. Además, las tasas de crecimiento de las células SNU620/5FU fueron más rápidas que las de las células SNU620 (Figura 1B y Figura complementaria S2). Dado que la quimiorresistencia y las características de rápido crecimiento podrían estar relacionadas con propiedades glucolíticas elevadas en las células de cáncer gástrico [28], se midieron las tasas de acidificación extracelular (ECAR) y las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en ambas células en presencia de oxamato, un conocido inhibidor de la glucólisis, o no. Los resultados demostraron que las células SNU620/5FU secretaron significativamente más lactato que el secretado por las células SNU620 y posteriormente acidificaron el medio de cultivo (Figura 1C y Figura complementaria S3). Sin embargo, no se observó ningún cambio significativo en OCR entre estas celdas (Figura 1D). Se midieron los niveles de expresión de mRNA y proteína de LDHA. La expresión de LDHA fue mayor en las células SNU620/5FU que en las células SNU620 (Figura 1E, F). Además, examinamos los niveles de expresión de ARNm y proteínas de los isotipos de PDK y descubrimos que los de PDK2 y PDK3 eran más altos en las células SNU620/5FU que en las células SNU620 (Figura complementaria S4A, B). También se evaluó la fosforilación de la subunidad E1 de la piruvato deshidrogenasa (PDHA1), que aumentó con las PDK, y se encontró que era más alta en las células SNU620/5FU que en las células SNU620 (Figura complementaria S4C). Además, usamos oxamato como inhibidor de LDHA para superar la resistencia a 5FU en células SNU620/5FU. Este compuesto inhibió el crecimiento celular en las células SNU620 y SNU620/5FU (Figura complementaria S5). Además, el cotratamiento con oxamato y 5FU suprimió el crecimiento celular, en comparación con el tratamiento individual con oxamato o 5FU en células SNU620/5FU (Figura 1G). Estos datos sugieren que las células SNU620/5FU expresan mucho LDHA, y la inhibición de la actividad de LDHA puede superar la resistencia de las células SNU/5FU a 5FU.

Figura 1. Según los resultados,5-las células resistentes al fluorouracilo (5FU) tienen una característica glucolítica elevada:(A)Las células SNU620 y SNU620/5FU se trataron con las concentraciones indicadas de 5FU durante 48 h. La viabilidad de estas células se evaluó mediante el ensayo MTT; (B) los niveles de crecimiento de las células SNU620 y SNU620/5FU se midieron cada día durante 4 días con el ensayo MTT; (C,D) las células SNU620 y SNU620/5FU se trataron con oxamato ( 5 mM) o no durante 24 h, y los valores de ECAR y OCR se evaluaron mediante el analizador Seahorse XF; (E, F) las expresiones de LDHA en células SNU620 y SNU620/5FU se detectaron mediante qRT-PCR y análisis de transferencia Western; (G) Las células SNU620 y SNU620/5FU se trataron con oxamato (25 mM) y/o 5FU (10 μM) durante 48 h. Los resultados se muestran como media ± SEM. ** p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA suprime la actividad de LDHA

La producción de lactato se analizó con CA y sus derivados, incluidos EC, GC, EGC y EGCG, en células SNU620/5FU. En comparación con estos derivados, CA redujo la producción de lactato de manera más efectiva (Figura 2A). Además, in vitro, se confirmó el ensayo de actividad de LDHA y CA mostró un efecto inhibidor más fuerte sobre la actividad de LDHA que los de sus derivados (Figura 2B). Los efectos inhibitorios de CA sobre las actividades in vitro de LDHA y LDHB se midieron de manera dependiente de la dosis. CA inhibió la actividad de LDHA sin afectar la actividad de LDHB (Figura 2C, D). Además, las actividades de LDHA y LDHB se midieron con EGCG, que se sabe que inhibe la actividad de LDHA, y se encontró que había disminuido en función de la dosis (Figura complementaria S6A, B). Además, las actividades intracelulares de LDHA y LDHB se evaluaron con las concentraciones indicadas de CA en células SNU620/5FU. CA inhibió la actividad de LDHA de manera dependiente de la dosis en los resultados in vitro, pero no la actividad de LDHB (Figura 2E, F). Los niveles de expresión de proteínas de p-PDHA1, PDK2, PDK3 y LDHA también se midieron en células SNU620/5FU después del tratamiento con CA (Figura complementaria S7), y observamos que no se vieron afectados por este tratamiento. Estos resultados sugieren que la CA regula la actividad de LDHA sin afectar su expresión.

2.3. Modo de acción de la inhibición de LDHA por CA

Para analizar el mecanismo de inhibición de la actividad de LDHA en CA y sus derivados, realizamos el modelado molecular de la interacción de unión entre LDHA recombinante humana y CA (Figura 3A,B). Los resultados mostraron que CA puede interactuar con los residuos de T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 y T247 de LDHA. Entre ellos, R105, S136 y R168 son críticos para la unión al sustrato (piruvato). Por lo tanto, asumimos que CA podría interferir con los sitios de unión al sustrato. Por el contrario, EGCG está vinculado a LDHA a través de un sitio diferente. Para verificar adicionalmente el modo de acción de la inhibición de LDHA por CA, se confirmaron los gráficos de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk con diversas concentraciones de piruvato y CA. La actividad de LDHA aumentó de manera dependiente de la dosis de piruvato. Sin embargo, fue revertida por el aumento de CA. Por lo tanto, los resultados de los gráficos de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk mostraron que la CA es un inhibidor no competitivo de la LDHA (Figura 3C, D). Además, los datos de la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) demostraron que la CA se une físicamente a la LDHA por valor de 197 uM (Figura complementaria S8). Estos resultados proporcionan información de que CA suprime la actividad de LDHA al unirse al sitio de unión al sustrato de LDHA.

2.4. CA vuelve a sensibilizar la resistencia a 5FU mediante la reducción de la actividad de LDHA

Evaluamos los efectos citotóxicos de CA en células SNU620 y SNU620/5FU y encontramos que CA suprimió el crecimiento en ambos grupos de células (Figura 4A). Para verificar que la inhibición del crecimiento estaba relacionada con la supresión de la actividad de LDHA, la expresión de LDHA se eliminó mediante ácido ribonucleico de horquilla corta (shRNA) para LDHA (shLDHA) y su expresión se recuperó mediante transfección de plásmido que expresa LDHA (Figura complementaria S9A, B ). En células SNU620/5FU transfectadas con shLDHA, la producción de lactato y la viabilidad celular no cambiaron notablemente por el tratamiento con CA, en comparación con las células transfectadas de forma simulada (Figura 4B, C). Además, el efecto inhibidor del crecimiento de CA fue incrementado por la recuperación de la expresión de LDHA en células SNU620/5FU de eliminación de LDHA (Figura 4D). Además, las células SNU620 y SNU620/5FU se examinaron después del tratamiento de CA y 5FU individualmente o la combinación de ambos. El cotratamiento con CA y 5FU inhibió significativamente el crecimiento de células SNU620/5FU (Figura 4E). Además, se examinaron los efectos combinados de CA y 5FU en varias otras líneas celulares, como AGS de cáncer gástrico humano, Panic-1 de cáncer de páncreas, MIA PaCa-2 y células LS174T y RKO de cáncer de colon, en comparación con SNU620 y SNU620/5FUceldas. La producción de lactato y la expresión de LDHA mostraron una buena correlación entre sí, y estas propiedades glucolíticas son relativamente altas en SNU620/5FU, AGS y RKO (Figura complementaria S10A, B). Además, el tratamiento combinado de CA y 5FU redujo significativamente la viabilidad de las células, en comparación con un solo tratamiento de 5FU en células glucolíticas que incluyen AGS y RKO (Figura complementaria S10C). Sin embargo, el cotratamiento con CA y 5FU no inhibió significativamente el crecimiento en células SNU620, Panic-1, MIA PaCa-2 y LS174T, que mostraron expresiones bajas de LDHA. Estos resultados sugirieron que el efecto sensibilizador de CA a las células resistentes a 5FU podría estar relacionado con su efecto inhibitorio sobre la actividad de LDHA.

Figura 2. La catequina (CA) inhibe la actividad de LDHA pero no su expresión: (A) se midió la producción de lactato de SNU620/5FU después del tratamiento con derivados de CA (10 μM) durante 24 h; (B) se evaluó la actividad de LDHA in vitro durante el tratamiento con derivados de CA (10 uM) y oxamato (20 mM); (C, D) in vitro, las actividades LDHA y LDHB se estimaron con las concentraciones indicadas de CA; (E, F) las células se trataron con las concentraciones indicadas de CA durante 24 h. Las actividades intracelulares de LDHA y LDHB se midieron utilizando los lisados ​​celulares como fuente de enzima. Los resultados se muestran como media ± SEM. **pags<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Figura 4. La viabilidad celular se inhibió mediante el tratamiento conjunto con catequina (CA) y 5-fluorouracilo (5FU) en células resistentes a 5FU: (A) se evaluaron las viabilidades de las células SNU620 y SNU620/5FU después del tratamiento con las concentraciones indicadas de CA durante 48 h; (B) Las células SNU620/5FU-pLKO.1 y SNU620/5FU-shLDHA se trataron con CA (10 μM) durante 24 h. La producción de lactato se midió en los medios de cultivo de células SNU620/5FU-pLKO.1 y SNU620/5FU-shLDHA;(C, D)SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA más EV , y las células SNU620/5FU-shLDHA más LDHA#2 se trataron con las concentraciones indicadas de CA durante 48 h. La viabilidad celular se midió usando un ensayo MTT; (E) Las células SNU620 y SNU620/5FU se trataron con CA (10 μM) y/o 5FU (10 μM) durante 48 h. Las viabilidades de estas células se midieron mediante ensayo MTT. Los resultados se muestran como media ± SEM.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Este artículo está extraído de Int. J. Mol. ciencia 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms