Capítulo 5 Cambios en la actividad enzimática durante la fermentación enzimática
Oct 29, 2024
Capítulo 5 Cambios en la actividad enzimática durante la fermentación enzimática
Proteasa, lipasa ysuperóxido dismutasa (SOD)son las principales enzimas funcionales deEnzimas microbianas alimentos saludables. Entre ellos,proteasajuega un papel enpromoviendo la hidrólisis de proteínas en los alimentosen el cuerpo humano. Además, también puede descomponer algunas células moribundas, eliminar la suciedad en la superficie de la piel y los poros, y desempeñar un papel en la exfoliación, por lo que se usa ampliamente en los productos de baño. La lipasa actúa sobre el enlace éster entre los ácidos grasos y el glicerol, y el sustrato de hidrólisis es generalmente aceites naturales. Por lo tanto, se observa en muchos alimentos para bajar de peso y productos de salud. Muchas mujeres están extremadamente preocupadas por el tema de la pérdida de peso, por lo que las enzimas se han vuelto rápidamente populares en todo el mundo.Las enzimas son ricas en lipasa, lo que significa que tienen un alto valor de investigación y perspectivas de aplicación.CÉSPEDes una enzima metálica especial que cataliza la reacción de dismutación deRadicales de anión superóxido, asíEliminación de radicales de aniones superóxidoen el cuerpo. Es una barrera protectora para los organismos, por lo que se usa ampliamente en el campo de la medicina.
Este capítulo toma la enzima Apple como ejemplo. A partir de la etapa inicial de la fermentación, elactividades de superóxido dismutasa, la amilasa, la lipasa, la proteasa y la celulasa en el grupo experimental y el grupo de control se midieron cada 15 días para reflejar integralmente y sistemáticamente la tendencia cambiante de la actividad enzimática durante todo el proceso de fermentación.
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5.1 Materiales y métodos
5.1.1 Materiales
(1) Materiales experimentales
Lave las manzanas frescas con agua estéril en condiciones estériles, secas naturalmente en una mesa de operación estéril, pelelas y córtelas para su uso posterior. Agregue azúcar blanca y manzanas a un frasco de vidrio esterilizado a una relación de masa de 1: 1. Active las bacterias requeridas para el experimento e inoculan en la enzima de acuerdo con el esquema óptimo (este paso de operación se omite para el grupo de control), séltelo y colóquela en un lugar fresco y seco. Después de 3 meses de fermentación de temperatura ambiente, tome una muestra para obtener todo el líquido enzimático que contenga la pulpa y filtrela. Tome el sobrenadante como la muestra experimental. Después de que la muestra se centrifuge a 10, 000 RPM durante 15 minutos en una centrífuga de alta velocidad, se utiliza para medir los datos relevantes. Vale la pena señalar que en el proceso de hacer enzimas, para evitar la contaminación innecesaria, todas nuestras operaciones se llevaron a cabo en condiciones estériles.
(2) Instrumentos principales
Los instrumentos requeridos para el experimento son los mismos que 3.1.1 (2).
5.1.2 Métodos
(1) Determinación de la actividad de superóxido dismutasa (SOD) [66]
La solución de pirogalol se precalentó en un baño de agua de temperatura constante de 25 grados durante un período de tiempo. Según la Tabla 5.1, se agregó una cantidad apropiada de tampón, agua destilada y el mismo volumen de ácido clorhídrico o solución de pirogalol al tubo de ensayo. El baño de agua de temperatura constante se estableció en 25 grados para 2 0 min. Después de que el líquido mixto se sacudió rápidamente, se inyectó inmediatamente en la cubeta. El valor de absorbancia A0 de la muestra se midió cada 30 segundos a una longitud de onda de 325 nm usando un espectrofotómetro.
TAB.5.1 Agregue la cantidad del reactivo de fenol de benceno adyacente para la determinación de la tasa de autoxidación
El método para determinar la actividad de SOD es básicamente el mismo que la operación anterior. La única diferencia es que antes de agregar PyroGallol, {{0}}. 5 ml de solución de muestra de enzima de diferentes concentraciones deben agregarse primero. Al mismo tiempo, se agrega el mismo volumen de agua destilada. La absorbancia medida es ASOD. La tasa de inhibición y la actividad de la enzima SOD se calculan de acuerdo con la fórmula 5.1 y la fórmula 5.2: tasa de inhibición (%)=(△ a 0- △ asod)/△ a 0 × 100 (5.1) Actividad de la enzima (U/ML) {{}}} (5.2) donde: V1 es el volumen total de la solución, ml; V2 es el volumen de la solución de muestra de enzima, ml; △ A0 es la tasa de autoxidación de pirogalol; △ ASOD es la tasa de cambio del valor de absorbancia de la muestra; n es la determinación de dilución múltiple (2) de la actividad de amilasa Este estudio utilizó el método colorimétrico de yodo-escenario para determinar la actividad de la amilasa. Los pasos de operación específicos se refieren al "procedimiento de operación de laboratorio clínico nacional" [67]. Se divide principalmente en los siguientes dos puntos:
① Preparación de la solución
Solución de almidón tamponado ({{0}}. 4g/l): pesa con precisión 9 g de cloruro de sodio, 22.6g de fosfato de hidrógeno anhidro de disodio y 12.5g de dihidrógeno de potasio anhidro, y calentan las soluciones en 5 0} {16}}} forúnculos; Pese con precisión 0,4 g de almidón soluble, disuelva en 10 ml de agua destilada, mezcle uniformemente y ajústelo a una pasta; Inyecte la solución de almidón ajustada a una pasta en la solución de ebullición anterior y lave el vaso de precipitados repetidamente hasta que el almidón se transfiera completamente a la solución de agua hirviendo. Después de revolver uniformemente con una varilla de vidrio, enfríe a temperatura ambiente, agregue 5 ml de una solución de formaldehído para el 37% del cabello y diluya a 1L con agua destilada. El valor de pH de la solución es 7.0 ± 0.1, y se coloca en el refrigerador para su uso.
Solución madre de yodo (0. 1 mol/l): pese con precisión 1.7835g yodato de potasio y 22.5g yoduro de potasio en un 500 ml limpio
El vaso de precipitados, agrega lenta y uniformemente de 4,5 ml de ácido clorhídrico concentrado, revolviendo continuamente durante el proceso de adición, se diluya a la escala con agua destilada y revuelva de manera uniforme. Póngalo en el refrigerador para su uso y guárdelo en una botella de reactivo marrón.
Solución de aplicación yodine ({{0}}. 01mol/L): tome una cierta cantidad de solución de yodo (0.1 mol/l), diluya 10 veces con agua destilada, colóquelo en el refrigerador para su uso y guárdelo hasta 1 mes.
② Pasos de operación experimentales
Tome la solución enzimática y diluya 10 veces con solución salina fisiológica y opere de acuerdo con la Tabla 5.2. Mezcle bien, la longitud de onda del espectrofotómetro es de 660 nm, y el camino de luz de la copa colorimétrica es de 10 mm. Cero con agua destilada y lea la absorbancia de cada tubo. Calcule la actividad de amilasa en función de la fórmula de cálculo básica 5.3.
Tab.5.2 Pasos de operación de determinación de amilasa
(3) Determinación de la actividad de la lipasa
El método de determinación se llevó a cabo de acuerdo con QB/T {{0}} [68]. Se preparó una solución de prueba de enzimas al 2% con 0. 0 25 mol/l de tampón fosfato (pH 7,5), se usó fenolftaleína como indicador y se tituló ácidos grasos con una solución estándar de hidroxido de sodio. La actividad de la lipasa se calculó en función del volumen de hidróxido de sodio consumido en el experimento. La regla es: a un pH de 7.5 y una temperatura ambiente de 40 grados, 1 ml de solución de enzima líquida hidroliza la lipasa durante 1 minuto para producir 1 μmol de ácido graso, que es una unidad de actividad de lipasa, expresada como U/ml. Luego, la actividad de la lipasa se calculó de acuerdo con la fórmula 5.4: actividad enzima (u/ml)=(ba) × c/0.05 × 50 × 1/15 × n=200/3 × (BA) × C × N (5.4) donde: B es el volumen de la solución estándar de sodio de sodio consumida, Ml; Ml; A es el volumen de solución estándar de hidróxido de sodio consumida en el grupo de control en blanco, ML; C es la concentración de la solución estándar de hidróxido de sodio, mol/L; 0.05 es el factor de conversión de la concentración de solución estándar de hidróxido de sodio; 50 es el contenido de ácidos grasos de la solución de hidróxido de sodio; 15 min es el tiempo de reacción; n es la dilución múltiple.
(4) Determinación de la actividad de proteasa
Consulte GB/T 23527-2009 [69] con ligeras modificaciones.
① Preparación de la curva estándar
Tome 1 ml de solución estándar de tirosina con diferentes concentraciones de masa, que son 0, 1 0, 20, 30, 40 y 50 mg/L, y agregan 5 ml de solución de carbonato de sodio 0.4mol/L y 1 ml de solución reagada folina a él. Reaccione durante 20 minutos a una temperatura de 40 grados. Una vez que se complete la reacción, elimine la solución de reacción y mida el valor de absorbancia de la solución a una longitud de onda de 680 nm usando un espectrofotómetro. Dibuje una curva estándar de tirosina con concentración de tirosina como el eje horizontal y el valor de absorbancia como el eje vertical.
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② Determinación de la actividad de proteasa
Grupo experimental: tome 1 ml de solución de caseína con una concentración de 10 g/L y mezcle de manera uniforme con 1 ml de la solución de muestra que se pruebe, y reaccione durante 10 minutos a una temperatura ambiente de 40 grados; Filtre y obtenga el filtrado después de estar de pie, tome 1 ml del filtrado, 5 ml de solución de carbonato de sodio y 1 ml de reactivo de folin, mezcle uniformemente y reaccione durante 20 minutos a una temperatura ambiente de 40 grados; Use un espectrofotómetro para medir el valor de absorbancia de la solución a una longitud de onda de 680 nm.
Grupo de control en blanco: tome 1 ml de la solución de muestra que se pruebe, agregue ácido tricloroacético, reaccione completamente para inactivar la proteasa y otros métodos de operación son los mismos que el grupo experimental.
Calcule la actividad de proteasa de acuerdo con la fórmula 5.5:
Actividad de proteasa (u/ml)=ak × 4/10 (5.5) donde: a es la absorbancia de la solución enzima en el grupo experimental; K es la cantidad de tirosina cuando la absorbancia es igual a 1; 4 es el volumen total de la solución de reacción, ml; 10 es el tiempo de reacción, min.
(5) Determinación de la actividad de la celulasa [70]
La actividad de la celulasa en las enzimas generalmente se expresa por la cantidad de glucosa liberada por una cierta cantidad de solución enzimática por unidad de tiempo. El principio de usar el método de papel de filtro para medir la actividad de la celulasa es que la celulasa puede descomponer la celulosa en el papel de filtro para producir metabolitos secundarios como la glucosa, y la glucosa puede reaccionar con 3, 5- ácido dinitrosalicítico para formar un complejo amarillo. El color de esta reacción es relativamente brillante, lo que puede determinar bien la cantidad de glucosa y otros azúcares reductores producidos.
①3, 5- agente colorimétrico de ácido dinitrosalicílico
Accurately weigh 10g of 3,5-Dinitrosalicylic acid with a melting point of 168-169 degree , dissolve it with distilled water, add 20g of sodium hydroxide and 200g of potassium sodium tartrate, continue heating until the solid is completely dissolved, dilute to 500mL with distilled water, add 2g of redistilled phenol and 0.5 g de sulfito de sodio anhidro, revuelva continuamente durante el proceso de adición hasta que se disuelva por completo, deje de calentar después de mezclar de manera uniforme, enfríe a temperatura ambiente, transfiera todo a un matraz volumétrico de 1000 ml, diluya a la marca con agua destilada, coloque a temperatura ambiente durante una semana, filtre, obtenga el sobrenatante y almacene en una botella de reagente marrón.② hidrólisis de metimática
Pipeta con precisión {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1.5, 2.0 ml de solución de muestra de enzima en 2 ml de solución de tampón de acetato de ácido acético-ácido acético con un valor de pH de 4.5. Después de 5 minutos de baño de agua de temperatura constante a 40 grados, agregue 6 piezas de papel de filtro de cromatografía con un área de 1 × 1 cm2 respectivamente, e inmediatamente comience a tiempo para que el tiempo de reacción sea preciso a 60 minutos. Transfiera inmediatamente al baño de agua hirviendo para reacción durante 10 minutos, y la celulasa pierde su actividad.
③ Reacción de color
Tome la solución de muestra de enzima, agregue 3 ml de 3, 5- agente colorimétrico de ácido dinitrosalicílico preparado en ①, calor en baño de agua hirviendo durante 15 minutos, elimine, se enfríe a temperatura ambiente, agregue 10 ml de agua destilada, mezcle de manera uniforme, use el espectrofotómetro en una longitud de onda de 550 nm, ajuste el grupo de control en blanco a cero y medir su valor de absorción.
④ Dibujo de la curva estándar de glucosa
Prepare una solución estándar de glucosa con una concentración de 1 mg/ml con precisión, y use agua destilada para hacer la solución estándar de glucosa con un volumen de 0, 0. 2, 0. 4, 0 de 3, 5- agente colorimétrico de ácido dinitrosalicílico preparado en ① para realizar la reacción de desarrollo de color. Trace la curva estándar con concentración de glucosa como el eje horizontal y la absorbancia como el eje vertical.
⑤calcululación
Use el valor de absorbancia A después del desarrollo del color con solución enzimática y luego calcule la cantidad de liberación de glucosa M de acuerdo con la curva estándar de glucosa, y calcule de acuerdo con la fórmula 5.6:
Actividad de celulasa (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) donde: m es la cantidad de liberación de glucosa, ug; t es el tiempo de hidrólisis enzimática, min; M es el contenido de enzimas en la reacción, ug/ml.
