Estudio sobre las enzimas microbianas producidas durante la fermentación bacteriana combinada y sus actividades biológicas ⅲ

Capítulo 3 Estudio sobre la actividad antioxidante de las enzimas

 

Se ha demostrado que muchas enfermedades humanas están relacionadas conoxígeno activo y radicales libres, comoinflamación, arteriosclerosis,envejecimiento, diabetes, cáncer, etc.Radicales libres excesivosEn el cuerpo puede causar desnaturalización de proteínas, daño celular y muerte, e incluso cambios patológicos en el cuerpo. Por lo tanto, muchos estudios en el hogar y en el extranjero están buscando alimentos ricos en ingredientes antioxidantes naturales para prevenir y regular enfermedades causadas por radicales libres a través de la dieta. Hoy, con el aumento del nivel de vida, las personas cambian gradualmente su enfoque a sus propios cuerpos, por lo que cada vez más productos de salud emergen en una corriente interminable. Sin embargo, no es fácil ser realmente útil. Las enzimas son un tipo de alimento que puede hacerse usted mismo en la vida de las personas. El costo no es muy alto y hay muchos beneficios.
Las enzimas microbianas tienen una variedad de funciones de salud, como antibacterianos y antiinflamatorios, promoviendo el metabolismo, la mejora de la inmunidad, el blanqueamiento y el antienvejecimiento, la desintoxicación y el cáncer. En la actualidad, hay relativamente pocos estudios sobre las propiedades antioxidantes de las enzimas microbianas en el hogar y en el extranjero, por lo que planeamos realizar investigaciones en profundidad sobre ellas. Este documento toma enzima de Apple como objeto de investigación, y utiliza el contenido total de fenol, reduciendo la potencia, DPPH · Radical libre, · OH Radical libre, superóxido Radical libre y la capacidad de eliminación de radicales libres ABTS como índices de determinación para realizar una investigación integral y sistemática de la enzima de manzana después de la fermentación durante 3 meses. Se estudió la composición y el contenido de los ingredientes activos antioxidantes, y se entendió su actividad antioxidante.

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3.1 Materiales y métodos

3.1.1 Materiales

(1) Materiales experimentales
Lave las manzanas frescas con agua estéril en condiciones estériles, secas naturalmente en una mesa de operación estéril, pelelas y córtelas para su uso posterior. Agregue azúcar blanca y manzanas en un frasco de vidrio esterilizado a una relación de masa de 1: 1. Active las bacterias requeridas para el experimento e inoculan en la enzima de acuerdo con el esquema óptimo (este paso de operación se omite en el grupo de control), sírelo y colóquela en un lugar fresco y seco. Después de 3 meses de fermentación de temperatura ambiente, tome una muestra para obtener todo el líquido enzimático que contenga la pulpa y filtrela. Tome el sobrenadante como la muestra experimental y centrifuge la muestra a 10000 rpm durante 15 minutos en una centrífuga de alta velocidad antes de determinar los datos relevantes. Vale la pena señalar que en el proceso de hacer enzimas, para evitar la contaminación innecesaria, todas nuestras operaciones se llevan a cabo en condiciones estériles.

(2) Instrumentos principales
Espectrofotómetro: V -1100, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory;
Baño de agua de temperatura constante: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. Otros instrumentos son los mismos que 2.1.3.

3.1.2 Métodos

(1) Determinación del contenido total de fenol [53]
① Preparación de la curva estándar:
Pesar con precisión {{0}}. 123 g de ácido gálico, disolverlo en una pequeña cantidad de agua destilada y transferirlo a un 5 0 0 ml de frasco volumétrico para compensar el volumen. Tome 8 limpieza 1 {{1 0}} ml de matraces volumétricos, agregue 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 y 1,4 ml de solución estándar de ácido gálico, respectivamente, se diluya a la marca con agua destilada, add 1 ml de reagente y 2 ml de 20% de solución estándar de 20% a cada uno. 1 min, enfríe y diluya a 20 ml, y colóquelo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Use un espectrofotómetro para medir la absorbancia A a una longitud de onda de 650 nm y dibuje una curva estándar con absorbancia A como el eje horizontal y la concentración de muestra como el eje vertical. ② Detección
Agregue agua destilada a 100 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl y 500 μl de soluciones de muestra a 46 ml, luego agregue 1 ml de reactivo de folin-fenol, mezcle uniformemente, reaccione para 3 minutos, luego agregue 3 ml de 20% de NACO3, se agite en un bañera de temperatura de temperatura de 25 grados para un baño de temperatura de 7 años, uso destilado por el agua en blanco y medir su absorción a un absorción de un absorción de un absorción de un absorción de un absorción de un augurio de 76 grados a un bañera de agua constante de 76 años a un agua de absorción de un agua de absorción de un absorción de un control de agua de 76 años. un espectrofotómetro. El contenido total de fenol se expresa como equivalentes de ácido gálico, y el contenido total de fenol se calcula de acuerdo con la ecuación de curva estándar.

(2) Ensayo de reducción [54]
Add 100μL, 200μL, 300μL, 400μL, and 500μL of sample to 2.5mL of phosphate buffer with a concentration of 0.2mol/L and a pH value of 6.6, then add 2.5mL of potassium ferricyanide (w/v) with a mass concentration of 1%, and react at 50 grados por 30 minutos. Luego agregue 2.5 ml de ácido tricloroacético (p/v) con una concentración de masa del 10%, y se centrifuge a 3000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga de alta velocidad. Inmediatamente después de sacar, tome 2.5 ml de sobrenadante en un matraz volumétrico, agregue 2.5 ml de agua destilada y 0.5 ml de cloruro férrico (p/v) con una concentración de masa de 0.1%. Use agua destilada como control en blanco y mida la absorbancia A a una longitud de onda de 700 nm usando un espectrofotómetro. La fuerza de la reducción del poder se puede juzgar por el valor de absorbancia. Cuanto mayor sea el valor de absorbancia, más fuerte es el poder reductor.

 

(3) Determinación del efecto de eliminación de radicales libres de anión superóxido [55]

Tome 4.5 ml de 0. 0 5 mol/l pH 8.2 TRIS-HCL tampón y precalúe en un baño de agua de 25 grados para 2 0 min. Agregue 1 ml de solución de muestra enzimática con concentraciones de 10%, 20%, 30%, 40%y 50%y 0,4 ml de solución de pirogalol de 25 mmol/L respectivamente. Mezcle bien y reaccione en un baño de agua de 25 grados durante 5 minutos. Agregue 1.0 ml de 8 mol/l de HCl para terminar la reacción. Use el tampón Tris-HCl como referencia y use un espectrofotómetro para medir la absorbancia A a una longitud de onda de 299 nm para calcular la velocidad de eliminación. Para el grupo de control en blanco, se usó 1 ml de solvente en lugar de muestra. La tasa de eliminación O 2- se calculó de acuerdo con la fórmula 3.1: o 2- tasa de eliminación (%)=(a 1- a2)/a1 × 100 (3.1) donde: a1 es la absorción del tubo en blanco; A2 es la absorbancia de la muestra.

(4) Determinación del efecto de eliminación sobre los radicales hidroxilo [56]

1 0 0 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl, 500 μl de solución de muestra se añadieron con agua a 2 ml, luego se agregó a 1,4 ml de peróxido de hidrógeno con una concentración de masa molar de 6 mmol/L, luego se agregó con 0,6 ml de salicilato de sodio con una concentración molar de masa molar con un concentración molar de mazas de frases y 2ML de frases de frases. 1.5 mmol/L, y calentado en un baño de agua de temperatura constante a 37 grados durante 1 h. Ajuste a cero con agua destilada y mida la absorbancia A a una longitud de onda de 562 nm usando un espectrofotómetro. Realice 3 réplicas para cada tratamiento. Calcule la tasa de eliminación de radicales hidroxilo de acuerdo con la fórmula 3.2: tasa de eliminación de radicales hidroxilo (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.2) donde: A1 es la absorbancia promedio del blanco; A2 es la absorbancia promedio de la solución de muestra. (5) Determinación del efecto de eliminación de radicales libres DPPH [57]

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Pipeta con precisión 2 ml de solución de muestra enzimática con concentraciones de 1 0%, 20%, 30%, 40%y 50%en un matraz volumétrico de 10 ml, luego agregue 2 ml de solución acuosa de etanol DPPH al 80%al matraz volumétrico. La concentración de masa molar es 2 × 10-4 mol/L. Después de mezclar, déjelo pararse a temperatura ambiente durante 30 minutos. Usando la solución de etanol al 80% como referencia, mida la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 517 nm, que se registra como A1. Mezcle 2 ml de solución DPPH y 2 ml de solución de etanol con una concentración de masa del 80% y mida su absorbancia a la misma longitud de onda, que se registra como A0. Mezcle 2 ml de solución enzimática y 2 ml de solución de etanol con una concentración de masa del 80% y mida su absorbancia a la misma longitud de onda, que se registra como A2. Calcule la tasa de eliminación de radicales libres DPPH de acuerdo con la Fórmula 3.3:
DPPH Libre Radical Radical Tasa (%) {{0}} [1- (a 1- a2)/a 0] × 100 (3.3) donde: a1 es la absorbancia de 2 ml dpph 80% ethanol aqueous aqueous aqueous sold enzyme s. A2 es la absorbancia de una solución mixta de 2 ml de solución enzimática y 2 ml de etanol al 80% por concentración de masa; A0 es la absorbancia de una solución mixta de 2 ml de solución DPPH y 2 ml de etanol al 80% por concentración de masa.

(6) ABTS Capacidad de eliminación de radicales libres [58]
Agregue una cierta cantidad de sulfato de potasio a una solución ABTS de 7 mmol/L hasta que la concentración final de la solución mixta sea de 2.45 mmol/L. Coloque la solución mixta en un lugar fresco y seco a temperatura ambiente durante 12 a 16 horas. 1 μl, 3μl, 5μl, 7 μl y 9 μl de solución de muestra se suplementaron a 10 μl con 5 mmol/L pH7.4 tampón fosfato, y luego se mezclaron uniformemente con 10 ml del sulfato de potasio anterior y la solución mixta ABTS, y se permitió reaccionar a una temperatura de reacción de 30 grados y un tiempo de reacción de 5min. Cero con agua destilada y mida la absorbancia A a una longitud de onda de 734 nm usando un espectrofotómetro. Calcule la tasa de eliminación de radicales libres ABTS de acuerdo con la fórmula 3.4:
ABTS Tasa de eliminación de radicales libres (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.4) donde: a1 es la absorbancia del grupo de control en blanco; A2 es la absorbancia del grupo experimental

 

3.2 Resultados y análisis

3.2.1 Contenido total de fenol

(1) Curva estándar
La curva estándar del contenido de fenol total se dibujó con la concentración de ácido gálico como el eje horizontal y el valor de absorbancia A como el eje vertical, como se muestra en la Figura 3.1.

 

Fig.3.1 La curva estándar del contenido total de fenol

De la Fig.

(2) Determinación de muestras

Los resultados de la determinación total del contenido de fenol de las enzimas de manzana en el grupo de control y el grupo experimental a diferentes concentraciones se muestran en la Fig.3.2.

 

 

 

Fig.3.2 La curva del contenido fenólico total

Como se muestra en la Fig.3.2, las enzimas de manzana tanto en el grupo control como en el grupo experimental tienen un alto contenido fenólico total, y ambos aumentan con el aumento de la cantidad de solución de muestra agregada. En el mismo gradiente de concentración, el contenido fenólico total de la enzima Apple en el grupo de control aumentó de 0. 673mg a 2.8 0 7mg, y el contenido fenólico total del grupo experimental aumentó de 0.961mg a 4.185mg. El contenido fenólico total del grupo experimental es mucho más alto que el del grupo de control, y la tendencia ascendente es más obvia. Según el contenido fenólico total, la actividad antioxidante general del grupo experimental es mayor que la del grupo de control.

 

3.2.2 Potencia reductora

Los resultados de la determinación de potencia reductora de las enzimas de manzana en el grupo control y el grupo experimental a diferentes concentraciones se muestran en la Figura 3.3.

 

Como se muestra en la Figura 3.3, la tendencia cambiante de reducir la potencia de las enzimas de Apple es similar a la tendencia cambiante del contenido total de fenol. El poder reductor del grupo experimental es mayor que el del grupo de control, y si es el grupo experimental o el grupo de control, dentro del rango de concentración presentado en el experimento, la potencia reductora muestra una tendencia creciente con el aumento de la cantidad de solución de muestra agregada. Los datos experimentales también confirmaron que en términos de reducción de la potencia, la actividad antioxidante del grupo experimental es mayor que la del grupo de control.

 

 

3.2.3 Capacidad de eliminación de radicales libres de anión superóxido

Los resultados de la capacidad de eliminación de radicales libres de anión superóxido de las enzimas de manzana en el grupo de control y el grupo experimental a diferentes concentraciones se muestran en la Figura 3.4.

Como se muestra en la Figura 3.4, hay una gran diferencia en la capacidad de eliminación de radicales libres de anión superóxido entre el grupo experimental y el grupo de control. Dentro del rango de concentración presentado en el experimento, la capacidad de eliminación de radicales libres de aniones de superóxido del grupo experimental cambia más significativamente cuando la concentración de la muestra es del 10%al 20%, y el cambio no es obvio después de que la concentración es superior al 20%; Cuando la concentración es del 50%, la capacidad de eliminación de radicales libres de anión superóxido es tan alta como 85.4%. La capacidad de eliminación de radicales libres de superóxido que se muestra por el grupo de control se puede ver claramente desde la tabla de tendencias. A medida que aumenta la concentración de enzimas, esta capacidad de eliminación de radicales libres también aumenta, cambia lentamente y gradualmente tiende a un estado estable. La capacidad de eliminación alcanza un máximo de 42.6%. El grupo experimental es casi el doble que el grupo de control.

 

 

3.2.4 Capacidad de eliminación de radicales libres de hidroxilo

Los cambios en la capacidad de eliminación de radicales libres de hidroxilo de las enzimas de manzana en el grupo control y el grupo experimental a diferentes concentraciones se muestran en la figura 3.5.

 

 

Fig.3.5 La curva de la eliminación de hidroxilo Radical libre

 

Se puede ver en la Fig. 3.5 que dentro del rango de concentración presentado en el experimento, la capacidad de eliminación de radicales libres hidroxilo de las enzimas en el grupo experimental y el grupo de control aumentó con el aumento de la cantidad adicional. La capacidad de eliminación de radicales libres de hidroxilo del grupo experimental fue menor que la del grupo de control, y funcionó muy mal a bajas concentraciones. A altas concentraciones, la capacidad de eliminación de radicales libres de hidroxilo aumentó significativamente. La razón puede ser que durante el proceso de fermentación, los tipos y el contenido de los microorganismos en las enzimas de manzana en el grupo experimental y el grupo control fueron diferentes, y el contenido de los metabolitos secundarios y los componentes de cada producto producido por la fermentación fueron diferentes, por lo que la capacidad antioxidante mostrada fue diferente.

 

3.2.5 DPPH · Capacidad de eliminación de radicales libres

En comparación con otros métodos de detección, DPPH · La capacidad de eliminación de radicales libres se usa ampliamente para evaluar la actividad antioxidante en un corto período de tiempo [59]. La capacidad de eliminación de radicales de DPPH · a diferentes concentraciones se trazó de acuerdo con los resultados del grupo de control y las enzimas de manzanas del grupo experimental, como se muestra en la Figura 3.6.

Como se muestra en la Figura 3.6, cuando la concentración de la enzima de manzana del grupo de control fue inferior al 30%, la capacidad de eliminación de radicales libres DPPH · fue inferior al 50%, pero la enzima de manzana experimental también mostró una mayor capacidad de eliminación de radicales libres DPPH · a bajas concentraciones. Los resultados experimentales muestran que la adición de Aspergillus oryzae, levadura, estreptococo termofílico y lactobacillus búlgaro es beneficiosa para la capacidad de eliminación de radicales libres de la enzima. Cuando la concentración de enzimas es del 50%, esta capacidad es tan alta como 91.4%, que es mucho más alta que el 69.8%del grupo de control a la misma concentración.

 

3.2.6 Capacidad de eliminación radical ABTS

Los resultados de la capacidad de eliminación radical de ABTS de las enzimas de manzana en el grupo de control y el grupo experimental a diferentes concentraciones se muestran en la figura 3.7.

Fig.3.7 La curva de la capacidad de eliminación radical ABTS
Se puede ver en la Fig. 3.7 que la tasa de eliminación de las enzimas de manzana en el grupo experimental es mayor cuando la cantidad de adición de enzimas es mayor de 5 μl. El estudio de Erel et al. demostró que la capacidad de eliminación de los radicales ABTS depende en gran medida de la mayor concentración de sustancias fenólicas [60]. Los resultados de la determinación total del contenido de fenol mostraron que el contenido total de fenol del grupo experimental fue mayor que el del grupo control. Los resultados experimentales en la Fig. 3.7 simplemente verificaron que la capacidad de eliminación de los radicales ABTS es mayor que la del grupo de control.

 

3.3 Resumen de este capítulo

Este capítulo estudia la relación entre la actividad antioxidante de las enzimas de manzana producidas por la fermentación con cuatro cepas seleccionadas de manzanas, la concentración de muestras de enzimas y la comparación de componentes activos antioxidantes y capacidad de eliminación de radicales libres entre el grupo experimental y el grupo control. Los resultados experimentales muestran que el contenido total de fenol de la enzima de manzana en el grupo de control es menor que el del grupo experimental, y su potencia reductora, los radicales libres de anión superóxido, los radicales libres DPPH y la capacidad de eliminación de radicales libres ABT son mejores que los del grupo control; La enzima en el grupo de control tiene una capacidad de eliminación particularmente buena para los radicales libres de hidroxilo.
En general, el grupo experimental mostró una mayor actividad antioxidante, lo que confirmó aún más la viabilidad de agregar cepas artificiales para hacer enzimas microbianas. De esta manera, los alimentos enzimáticos microbianos tienen más sustancias beneficiosas para la salud humana sobre la base de la fermentación natural original, y pueden desarrollarse mejor en la dirección esperada por las personas.