Cambios en la membrana de eritrocitos humanos expuestos a extractos acuosos y etanólicos de Uncaria tomentosa

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Resumen: Uncaria tomentosa (Willd.)DC es una especie trepadora leñosa originaria de América del Sur y Central que se ha utilizado en la terapia del asma, el reumatismo, la hipertensión y la purificación de la sangre. Nuestro estudio anterior mostró que U.tomentosaextractosalteración de la forma de los eritrocitos humanos, lo que podría deberse a la incorporación de los compuestos contenidos en los extractos a la membrana de los eritrocitos. El objetivo del presente estudio fue determinar cómo los compuestos contenidos en los extractos de UI.tomentosa se incorporan a la membrana de los eritrocitos humanos. El estudio ha evaluado el efecto de extractos acuosos y etanólicos de hojas y corteza de U. tomentosa sobre la resistencia osmótica del eritrocito humano, la viscosidad del interior del eritrocito y la fluidez de la membrana plasmática del eritrocito. Humanoeritrocitosse incubaron con los extractos estudiados en las concentraciones de 100,250 y 500ug/mL durante 2,5 y 24 h. Todos los extractos probados causaron una disminución en la fluidez de la membrana de los eritrocitos y aumentaron la sensibilidad osmótica de los eritrocitos. Los extractos etanólicos de corteza y hojas incrementaron la viscosidad de los eritrocitos. Los mayores cambios en los parámetros estudiados se observaron en las células incubadas con extracto etanólico de corteza. Consideramos que los compuestos del extracto de U. tomentosa se acumulan principalmente en la monocapa hidrófila externa de la membrana de los eritrocitos, protegiendo así a los eritrocitos contra los efectos adversos del estrés oxidativo.

Palabras clave: eritrocitos; fluidez de la membrana; resistencia osmótica; Uncaria tomentosa; extractos

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1. Introducción

Uncaria tomentosaextractosse utilizan comúnmente para apoyar el tratamiento de diversas enfermedades debido a suantioxidante[1-4] y actividades inmunoestimulantes [5,6]. También se ha demostrado que los extractos de U. tomentosa exhiben actividades anticancerígenas [7-9], antimutagénicas [10,11] y antiherpéticas [11].

Las encuestas etnomedicinales y otros estudios han mostrado numerosas aplicaciones de esta planta en la medicina tradicional de diferentes culturas, por ejemplo, el tratamiento de la inflamación, artritis, asma, cáncer, úlceras gástricas, enfermedades del tracto urinario y hemorragias [12,13]. Estas propiedades diversas se deben a que la composición química compleja de U. tomentosa se asocia principalmente con un alto contenido de varios metabolitos secundarios biológicamente activos, en su mayoría fenólicos y alcaloides [14].

Muchos artículos también han indicado la acción beneficiosa (sin efectos secundarios) de los extractos de UI.tomentosa (utilizados en dosis terapéuticas) en las células sanguíneas tanto en estudios in vivo [15,16] como in vitro [17-19]. Sheng et al. [20] no observaron ningún cambio en la presentación de la sangre tras la administración de altas concentraciones de extracto de U. tomentosa C-MED-100TM a voluntarios sanos. No observaron ningún cambio estadísticamente significativo, incluido el nivel de hemoglobina, el valor del hematocrito y el volumen medio de glóbulos rojos (RBC), lo que más bien excluyó la posible eliminación prematura de los RBC expuestos a los extractos de U. tomentosa.

De igual forma, los ensayos clínicos realizados por Piscoya et al. [21] en pacientes con artrosis de rodilla, con respecto a la evaluación de la eficacia de Uncaria gujanensis en la terapia de esta enfermedad, no mostró cambios en el hematocrito, el nivel de hemoglobina, así como el valor de la velocidad de sedimentación globular (VSG), en comparación con un grupo de pacientes que recibieron placebo. Sin embargo, se necesitan más estudios en cohortes humanas más grandes para excluir la posibilidad de eliminar la prematuridad.eritrocitosde la circulación de humanos expuestos a especies de Uncaria. Nuestros estudios anteriores han demostrado que los extractos etanólicos y acuosos de las hojas y la corteza de U. tomentosa, incluso en una concentración muy alta de 500 ug/ml, no eran tóxicos para los eritrocitos. También hemos observado que los extractos estudiados aliviaron la oxidación de la hemoglobina y la peroxidación lipídica, así como también redujeron la formación de ROS y la hemólisis inducida por un tóxico 24-diclorofenol (2,4-DCP)[17]. Además, encontramos un efecto protector de los extractos de U. tomentosa sobre la actividad de la catalasa en eritrocitos humanos incubados con 2,4-DCP y catecol [22].

La concentración fisiológica de polifenoles vegetales es difícil de evaluar. En la literatura, por lo general, se da la información sobre las dosis recomendadas de los preparados o las concentraciones de los compuestos probados (para humanos 210-500 mg/día o para animales 350-500 mg/kg de masa corporal) [23,24 ].

Algunos de los compuestos se absorben sin cambiar su forma, mientras que otros, especialmente en forma de glucósidos, durante la absorción se ven privados de todo o parte de los residuos de azúcar. La flora intestinal también participa en la transformación de los polifenoles vegetales.

La mayor parte de la dosis absorbida se excreta del cuerpo a través de la orina y las heces. Se estima que no más del 10-20 por ciento de la dosis ingerida de quercetina e isoflavonas (genisteína y daidzeína) se detecta en plasma después de 1-3 h de administración. Se considera que las antocianinas se absorben de manera menos eficiente: su absorción se estima en 1-2 por ciento de la dosis inicial [25]

El estrés oxidativo ocurre cuando el nivel de ROS en una célula supera el de la célula.antioxidantesistema de defensa. Los glóbulos rojos son particularmente susceptibles al estrés oxidativo debido al alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados presentes en su membrana y la autooxidación de la hemoglobina. La membrana de los eritrocitos humanos está compuesta por ácidos grasos saturados, ácidos grasos monoinsaturados, ácidos grasos poliinsaturados y ácidos grasos poliinsaturados N-3 de cadena larga [26]. Los agentes oxidantes cambian la rigidez de la membrana, alteran el potencial dipolar de la membrana y provocan la formación de complejos de espectrina-hemoglobina [27]. Para hacer frente al estrés oxidativo, los eritrocitos están equipados con un citoesqueleto especializado que proporciona la estabilidad mecánica y la flexibilidad necesarias para soportar las fuerzas que se producen durante la circulación. La membrana de los eritrocitos está compuesta por una bicapa lipídica, proteínas transmembrana y una red filamentosa de proteínas (como espectrina, actina F, proteína 4.1 y dominio de proteínas de unión a actina, aducina, tropomiosina y tropomodulina) que forman un esqueleto de membrana a lo largo de toda la superficie citoplásmica de su membrana [28]. Las ROS también son capaces de inducir la eriptosis por cambios en la translocación de la fosfatidilserina (PS) de la membrana [29]. El estrés oxidativo también puede provocar el agotamiento de los componentes reductores celulares y causar cambios estructurales y funcionales en la membrana de los glóbulos rojos: degradación de la fosfatidilserina y el ácido siálico, que son los componentes principales que establecen la carga negativa en el lado externo de la membrana [30].

Se ha comprobado que los polifenoles aislados de U.tomentosa exhiben propiedades antioxidantes muy fuertes. Varios informes han demostrado que los extractos acuosos y metanólicos obtenidos de diferentes partes de U. tomentosa protegen a las células de la producción de radicales libres y la peroxidación lipídica in vitro, así como también inhiben el daño del ADN inducido por los radicales libres y la muerte celular [2,3,31]. En nuestro estudio anterior, también demostramos que los extractos de UI.tomentosa en condiciones fisiológicas protegían a los eritrocitos contra la formación de ROS y la hemólisis. Además, demostramos que los extractos etanólicos de .tomentosa exhibieron los efectos protectores más fuertes [17].

Para averiguar si los compuestos probados pueden penetrar la membrana (ya qué profundidad se encuentran), se evaluó la fluidez de la membrana de los eritrocitos. Muchos factores físicos y químicos afectan la fluidez de la membrana [32,33]. Los agentes químicos incluyen xenobióticos que causan la oxidación de lípidos y proteínas y los compuestos que intercalan

en la membrana [34,35]. La incorporación de compuestos extraños a la estructura de la membrana puede alterar la disposición de sus elementos, lo que suele provocar un cambio en la fluidez de la membrana. Los cambios en la fluidez de la membrana pueden conducir a una disfunción de los eritrocitos, así como a alteraciones en las propiedades reológicas de los eritrocitos [36]. Por otro lado, las sustancias con propiedades antioxidantes que tienen la capacidad de penetrar la membrana pueden exhibir un papel protector hacia la célula [37]. Por lo tanto, para aclarar si los compuestos contenidos en los extractos de U.tomentosa pueden acumularse en la membrana interna y/o externa, evaluamos las alteraciones en la fluidez de la membrana en sus diferentes niveles, así como también evaluamos la resistencia osmótica y la viscosidad interna de los eritrocitos. Elegimos concentraciones relativamente altas (pero no tóxicas como se muestra en estudios previos) de los extractos probados para observar cambios potenciales en los parámetros estudiados, así como para determinar la ubicación de los componentes del extracto en la membrana de los eritrocitos.

2. Resultados

2.1.Fluidez de la membrana

2.1.1. Parámetro de pedido S

Después de 2h y 24h de incubación de los eritrocitos con extractos acuosos y etanólicos de corteza y hojas, estadísticamente se notaron cambios significativos en el parámetro de orden S La Figura 1 muestra los valores promedio y desviación estándar para cuatro (2 h de incubación) y cinco( 24 h de incubación) experimentos independientes. Después de 2 h de incubación, todos los extractos estudiados a 500 ug/mL provocaron un aumento en el parámetro de ordenación S en los glóbulos rojos humanos. Después de 24 h de incubación, estadísticamente, se observaron cambios significativos en el parámetro estudiado tanto a 250 ug/mL como a 500 ug /mL de todos los extractos examinados.

2.1.2. Correlación Tiempo TB y Tiempo TC

Después de 2 h de incubación, estadísticamente se observaron cambios significativos para la correlación tiempo TB y tiempo tc para los eritrocitos tratados solo con extracto etanólico a 500ug/mL. Después de 24 h de incubación, no se observaron cambios estadísticamente significativos en el tiempo y el tiempo Tc en los glóbulos rojos tratados con cualquier extracto probado (Tabla 1).

2.2. Viscosidad interna de los glóbulos rojos

Después de 2 h y 24 h de incubación de los glóbulos rojos con agua y extractos etanólicos de la corteza y las hojas en el rango de concentraciones de 100 a 500 ug/mL, no se observaron cambios estadísticamente significativos en la viscosidad relativa del interior del eritrocito (Figura 2) . Los gráficos muestran los valores promedio y desviación estándar para cuatro (2 h) y cinco (24 h) experimentos independientes.

Cabe señalar que después de 2 h, y particularmente después de 24 h de incubación de los eritrocitos con extractos etanólicos de la corteza, se pudo observar una tendencia al aumento de la viscosidad del eritrocito interno (los resultados no fueron estadísticamente significativos) (Figura 2) .

2.3. Fragilidad osmótica

La incubación de los eritrocitos con extractos acuoso y etanólico de corteza y hojas a una concentración de 100 ug/L se realizó durante 2 h, 5 hy 24 h. El diagrama de resistencia osmótica (Figura 3) presenta los resultados promedio de 5 experimentos independientes para cada tiempo de incubación. Para facilitar la lectura del gráfico, no se trazaron desviaciones estándar. Las gráficas de IC5o (Figura 4) muestran los valores de desviación estándar y promedio calculados para 5 experimentos independientes para cada tiempo de incubación.

Después de 2 h de incubación de los eritrocitos con los extractos analizados, no se observaron cambios en la sensibilidad osmótica de estas células y, por lo tanto, cambios en los valores de los parámetros ICs0 (Figuras 3 y 4). También se observó que los extractos probados después de 5 h de incubación aumentaron la sensibilidad osmótica de los eritrocitos humanos. Excepto por el extracto acuoso de hojas, los otros extractos sensibilizaron a los glóbulos rojos al daño por estrés osmótico. Los eritrocitos incubados con los extractos estudiados sufrieron hemólisis a concentraciones de NaCl más altas en comparación con los glóbulos rojos de control (Figura 3). Un aumento en los valores del parámetro IC50 también fue estadísticamente significativo para los eritrocitos incubados durante 5 h con extractos acuosos y etanólicos de corteza y extracto etanólico de hojas (Figura 4). Después de 24 h de incubación, se observó una mayor sensibilidad al estrés osmótico en los eritrocitos tratados con todos los extractos ensayados en comparación con los

glóbulos rojos de control (Figura 3). De manera similar, se observó un aumento estadísticamente significativo en los valores de IC en los eritrocitos incubados con todos los extractos de U. tomentosa estudiados (Figura 4).

3. Discusión

Un estudio anterior mostró que los extractos de U. tomentosa cambiaron la morfología de los eritrocitos humanos [19]. Se encontró la formación de esquistocitos, lo que indicó la incorporación de los componentes de los extractos a la monocapa externa de la membrana de los eritrocitos[38,39]. Otro estudio mostró que los compuestos contenidos en los extractos de U. tomentosa inhibían la fuga de hemoglobina (hemólisis) probablemente al sellar la membrana celular [17]. Una de las propiedades de la membrana biológica, resultante de su estructura y de la interacción entre sus componentes, es la fluidez de la membrana. La fluidez de la membrana es inversamente proporcional a su viscosidad.

Utilizando espectroscopía de resonancia paramagnética (EPR), se determinó la fluidez de la membrana de los eritrocitos incubados con etanol y extractos acuosos de corteza y hojas en dos niveles de 5 y 16 átomos de carbono del residuo de ácido graso.

Sobre la base de los espectros de EPR obtenidos para la 5-etiqueta de espín de ácido doxiesteárico (5-DSA), se calculó el parámetro de orden S, que proporcionó información sobre los cambios de fluidez al nivel de 5 átomos de carbono. del residuo de ácido graso. Para el parámetro de ordenación S, se observó un aumento estadísticamente significativo en su valor después de la incubación de eritrocitos con extractos etanólicos y acuosos de corteza y hojas de U. tomentosa, que mostró

una disminución en la fluidez de la membrana al nivel de 5 átomos de carbono de un residuo de ácido graso. Se observó un aumento estadísticamente significativo en el parámetro S después de 2-h de incubación de eritrocitos con extractos etanólicos de corteza, agua y extracto etanólico de hojas a 250 ug/mL y 500 ug/mL, mientras que el extracto acuoso de la corteza solo a 500 ug/mL provocó cambios en el parámetro en discusión (Figura 1A). La prolongación del tiempo de incubación hasta 24 h provocó un aumento estadísticamente significativo del parámetro S en los eritrocitos incubados con todos los extractos estudiados a partir de su concentración de 250ug/mL (Figura 1B). La disminución de la fluidez de la membrana al nivel de 5 átomos de carbono de un residuo de ácido graso puede estar relacionada con el efecto de los polifenoles en la estructura de la membrana plasmática, tal como lo describen Duchnowicz et al.[40]. La investigación de Koren et al.[37]implica un efecto beneficioso de los polifenoles sobre la capacidad antioxidante total de la sangre, especialmente de los eritrocitos. Postularon que los eritrocitos circulantes y posiblemente otras células sanguíneas podrían estar constantemente recubiertos por polifenoles de los nutrientes suplementados, que actúan como depósitos de antioxidantes y, por lo tanto, pueden comportarse como protectores contra las consecuencias dañinas del estrés oxidativo. Los compuestos polifenólicos determinados en U. tomentosa se clasifican como metabolitos secundarios que tienen un efecto positivo en el organismo humano. Exhiben actividad antioxidante, quelan iones metálicos (hierro, cobre) y apoyan las actividades de enzimas antioxidantes. El efecto protector de los polifenoles en el cuerpo humano se asocia principalmente con la protección celular contra el estrés oxidativo, que puede estar asociado con la prevención del desarrollo de diversas enfermedades, incluida la aterosclerosis o el cáncer [41,42]. La investigación realizada por Heitzman et al. [43] así como nuestro estudio[17] mostró la presencia de polifenoles en extractos de U.tomentosa. Los autores, mediante el análisis de varios extractos, determinaron el mayor contenido de polifenoles en el extracto etanólico de la corteza y el menor en el extracto acuoso de las hojas. Compuestos fenólicos presentes en UL. tomentosa están representados principalmente por taninos, derivados de flavonol, catequinas, taninos (incluidas catequinas y epicatequinas) y procianidinas. Los polifenoles debido a su estructura tienen diferente solubilidad en agua, pero todos se disuelven bien en solventes orgánicos. Por lo tanto, los extractos etanólicos de plantas suelen tener una composición más diversa y una mayor concentración de polifenoles que los extractos acuosos.

En el caso de la etiqueta de espín de ácido 16-doxil esteárico (16-DSA), se determinaron dos tiempos de correlación T y tc. Después de la incubación de los eritrocitos durante 2 h con extracto etanólico de la corteza a una concentración de 500 ug/mL, se observó un aumento en la correlación del tiempo tp y el tiempo Tc. Sin embargo, no se observaron cambios estadísticamente significativos en estos parámetros después de 24 h de incubación. Otros extractos probados no causaron cambios estadísticamente significativos en el tiempo de correlación de TB tanto después de 2 h como de 24 h de incubación. Se mostró una tendencia ascendente para este parámetro en los eritrocitos incubados (particularmente durante 24 h) con todos los extractos estudiados a 500 ug/mL (Tabla 1). Un aumento en los tiempos de correlación tB y tc indica un endurecimiento de la película al nivel de 16 átomos de carbono del residuo de ácido graso. Sin embargo, ningún cambio después de 24 h de incubación sugiere que este es un efecto temporal causado por los componentes del extracto, que inicialmente se incorporan a la membrana, pero después de un tiempo de incubación más prolongado, se eliminan fuera de la célula. Dichos efectos de los polifenoles se describieron en el estudio de Tarahovsky et al. [44]. Estos autores sugirieron que los flavonoides penetraron en el sitio hidrofóbico de la bicapa lipídica, particularmente en los compartimentos conocidos como balsas lipídicas, o en bolsas de proteínas hidrofóbicas. Los flavonoides después de formar complejos con metales, todavía tienen el potencial antioxidante, mientras que su lipofilia puede aumentar, lo que facilita la protección de los lípidos de la membrana contra la oxidación.

Sugerimos que los polifenoles del extracto de corteza de U. tomentosa no solo penetraron en los niveles más profundos de la membrana de los eritrocitos, sino que también se transfirieron al interior de la célula, lo que se confirmó por el aumento de la viscosidad interna de los glóbulos rojos. Uno de los parámetros clave que afectan la deformabilidad de los eritrocitos es su viscosidad interna [45]. En este estudio, los cambios en la viscosidad de los eritrocitos se evaluaron mediante marcadores de espín. No hubo cambios estadísticamente significativos en la viscosidad relativa de los eritrocitos tratados con extractos acuosos de U. tomentosa tanto después de 2-h como de 24-h de incubación, mientras que los extractos etanólicos indujeron cambios en el parámetro en discusión (Figura 2). Esto puede indicar que los polifenoles contenidos en muchos

concentraciones más altas en los extractos etanólicos penetraron intensamente en la membrana de los glóbulos rojos provocando cambios en la viscosidad del interior del eritrocito. Los eritrocitos incubados con extractos acuosos pudieron compensar fácilmente los cambios en su viscosidad, que fueron provocados por concentraciones más bajas de sustancias polifenólicas (Figura 6).

Sin embargo, se debe enfatizar que la ubicación de los polifenoles en las capas más profundas de la membrana celular y, en consecuencia, su penetración en la célula con la alteración simultánea de la viscosidad de los glóbulos rojos puede ocurrir solo a una concentración muy alta de estas sustancias que no se encuentran. en el cuerpo humano incluso después del tratamiento terapéutico con extractos de U. tomentosa. A bajas concentraciones, los polifenoles se localizan principalmente en la monocapa externa, como lo demuestran los cambios en el valor del parámetro S. Las alteraciones en la viscosidad del interior del eritrocito pueden estar asociadas con un cambio en la forma de los eritrocitos. Esto fue indicado por cambios en el parámetro del canal de dispersión frontal (FSC) obtenido del análisis de citometría de flujo y fotografías obtenidas de un examen microscópico de contraste de fase [19]. La formación de esquistocitos puede resultar de la ubicación de los polifenoles presentes en los extractos de U.tomentosa tanto en la región hidrofílica como en la región hidrofóbica de la monocapa de la membrana celular externa, como lo sugieren los cambios en el parámetro de ordenación S y los tiempos de correlación tB y Tc. Los cambios en la forma de los glóbulos rojos pueden estar asociados con la pérdida de agua y el aumento de la viscosidad dentro de las células. Además, pueden deberse a una disminución de la resistencia osmótica de los eritrocitos. La colocación de eritrocitos alterados en una solución isotónica de NaCl puede conducir a una lisis celular más rápida (en comparación con las células de control) debido al mayor efecto del agua y una posibilidad limitada de deformación de la membrana de los eritrocitos y, por lo tanto, cambios en la forma de la célula.

Los resultados mostraron que dependiendo del tiempo de incubación, los extractos de U, tomentosa pueden tener un impacto diferente sobre la fluidez de la membrana plasmática y la resistencia osmótica de los eritrocitos.

La resistencia osmótica de los eritrocitos es un parámetro que indica la sensibilidad de los glóbulos rojos a la acción de un ambiente hipotónico. Por la exposición de los eritrocitos al ambiente isotónico, se puede observar un pequeño movimiento osmótico de agua en la membrana celular, que no cambia el volumen y la forma de la célula. En el caso de un ambiente hipotónico, el agua ingresa a la célula, lo que hace que su volumen aumente, además de cambiar la forma de un disco de dos cóncavos a una forma de esfera. Las células pueden aumentar su volumen solo hasta cierto punto. Un aumento adicional en el volumen da como resultado una interrupción de la integridad de la membrana celular y la liberación del contenido celular por Ivsis osmótica. 3 y 4), así como cambios en el parámetro IC50. Sin embargo, después de 24- h de incubación, se observó una mayor sensibilidad osmótica de los eritrocitos y, por lo tanto, se observó un aumento del valor de ICso frente al control (Figuras 3 y 4). Se observaron efectos más fuertes después de la incubación de eritrocitos con extractos de etanol en comparación con extractos acuosos. Esto probablemente se deba al hecho de que los extractos de etanol tienen más compuestos polifenólicos y taninos [17]. Cambios similares (un aumento en el valor IC50) después de un tiempo de incubación más largo (90 min a 37 grados) de eritrocitos con catequinas fueron observados por Naparlo et al. [46]. Estos autores sugirieron que probablemente durante la incubación prolongada, las catequinas son absorbidas por los eritrocitos, lo que puede conducir a un aumento de la osmolaridad del interior celular y, por lo tanto, a una hemólisis más fácil en soluciones hipotónicas debido a una mayor diferencia de osmolaridad entre el interior y el exterior de la célula. La segunda explicación de tales cambios fue la sugerencia de que las catequinas generan ROS durante la incubación prolongada, por ejemplo, peróxido de hidrógeno, que puede dañar la membrana de los eritrocitos y aumentar su fragilidad, incluida la fragilidad osmótica.

La ubicación de los compuestos al nivel del carbono 5 de la cadena de ácidos grasos de los eritrocitos dio como resultado un aumento de la sensibilidad osmótica de estas células (desplazamiento de las curvas de resistencia osmótica hacia valores de concentración de NaCl más altos, aumento de los valores de IC50). Sin embargo, en experimentos previos realizados por Bors et al. [17] en condiciones isotónicas (0,9 por ciento de NaCl), los extractos de U. tomentosa inhibieron la hemólisis inducida por sustancias tóxicas, como 2,4-DCP y catecol. Estos investigadores también demostraron el papel protector de los extractos de U. tomentosa contra la acción oxidativa de 2,4-DCP en eritrocitos humanos que se manifiesta en la reducción de los niveles de metahemoglobina y ROS. Así, el efecto final de los extractos en el organismo es probablemente positivo. En el sistema in vivo, los extractos de U. tomentosa (en bajas concentraciones) se incorporan a la membrana (sin interferir con su estructura) y exhiben propiedades protectoras antioxidantes [12,47]. Los resultados de los estudios en ratas y en voluntarios sanos a los que se les administró U.tomentosa no mostraron cambios en la membrana de los glóbulos rojos ni otros cambios en los eritrocitos, lo que excluyó la posibilidad de una eliminación prematura de estas células de la circulación [ 20,48].

Afirmamos que la unión de polifenoles a la superficie de los eritrocitos puede ser responsable de sus propiedades protectoras (observadas en estudios anteriores). Los polifenoles, que son los más frecuentemente representados en los extractos de U. tomentosa, pueden interactuar directamente con las membranas biológicas, y también actúan como captadores de radicales libres e inhibidores de la peroxidación lipídica, aumentando la resistencia celular al daño oxidativo. Esto fue confirmado por las últimas investigaciones realizadas sobre membranas bioactivas. Kim y otros[49] agregó extracto de U. tomentosa en el proceso de formulación de membranas de alginato nanoestructurado para mejorar sus actividades biológicas. Los autores demostraron que los componentes que contienen membrana de U. tomentosa poseían una excelente actividad antioxidante, mostrando casi el 100 por ciento de la capacidad de reducción de radicales libres en 15 min.

La limitación de este estudio es la falta de evaluación del efecto de los extractos probados sobre la composición de ácidos grasos en la membrana de los eritrocitos. La membrana de los eritrocitos humanos está compuesta por ácidos grasos saturados (palmítico, esteárico), ácidos grasos monoinsaturados (palmitoleico, vaccénico, cis-oleico, trans-oleico), ácidos grasos poliinsaturados (cis-linoleico, transinoleico, linolénico, eicosanoide, eicosatrienoico, aracosatrienoico) , y ácidos grasos poliinsaturados N-3 de cadena larga (eicosapentaenoico, docosahexaenoico).

Sin embargo, en este estudio, los extractos se aplicaron a eritrocitos obtenidos de donantes sanos. Por lo tanto, se puede suponer que la composición lipídica de la membrana de los eritrocitos es típica de las células normales [26]. Dado que los eritrocitos humanos maduros no tienen núcleo, no sintetizan componentes celulares, incluidos los ácidos grasos. Por esta razón, la composición lipídica no debería cambiar a diferencia de los estudios in vivo: en el carcinoma de células escamosas de la piel [26] o durante la suplementación [50,51]. El proceso flip-flop, la oxidación de lípidos, el cambio de interacciones en los dominios lipídicos y su distribución son posibles, pero como no ocurre la biosíntesis de lípidos en los eritrocitos, la composición cualitativa y cuantitativa de los lípidos de la membrana de los eritrocitos bajo la influencia de los extractos probados agregó in vitro es muy poco probable que ocurra.

En resumen, los extractos de U. tomentosa se incorporan principalmente de forma temporal a la membrana, y exactamente en su monocapa exterior. Sin embargo, en concentraciones muy altas, pueden penetrar más profundamente en la membrana y, en última instancia, alterar la viscosidad de los eritrocitos. En base a los resultados obtenidos, así como a los datos de la literatura, consideramos que las bajas concentraciones fisiológicas de los compuestos contenidos en los extractos de U. tomentosa estarán en la monocapa externa de la membrana celular y protegerán a los eritrocitos contra el daño y el estrés oxidativo.

4. Materiales y Métodos

4.1. quimicos

5-Ácido doxilesteárico (5-DSA),16-ácido doxilesteárico (16-DSA),4-hidroxi-2,2,6,{{ 8}}tetrametilpiperidina-1-oxil(TEMPOL) se compraron de Sigma-Aldrich, Saint Louis, MI, EE. UU. Se obtuvieron otros productos químicos de Roth, Karlsruhe, Alemania, y Avantor Performance Materials Polonia, Gliwice, Polonia.

4.2.Material biológico

4.2.1.Planta

La materia prima (corteza y hojas) de U. fomentosa se originó en el Instituto Peruano de Investigaciones Fitoterapia Andina en Lima, Perú, fue gentilmente provista por Wilcaccora

Centro Lomianki, Polonia. Las características generales de este material fueron descritas previamente por Pilarski et al. [3].

Los materiales del comprobante se depositaron en el Laboratorio de Fitoquímica, Instituto de Química Bioorgánica, Academia Polaca de Ciencias, Poznan, Polonia.

Preparación de muestras: se extrajo un gramo de la materia prima (corteza y hojas) de U.tomentosa con un volumen de 10 mL de agua o etanol al 96 por ciento a 37 grados durante 8 h. Luego, los extractos se centrifugaron a 4000 rpm durante 15 min. Los sobrenadantes se evaporaron con Speed-Vac hasta secar la masa y luego se secaron con P2O5. En estas condiciones se cubrieron unos 111 mg de preparado por gramo de corteza y unos 158 mg de preparado por gramo de hojas en el caso de extracción acuosa. Durante la extracción con etanol al 96 por ciento se lograron 123 mg de preparación por gramo de corteza y 158 mg de preparación por gramo de hojas. Se obtuvieron cuatro extractos, a saber, extracto etanólico de corteza (Bet), extracto acuoso de corteza (Bag), extracto etanólico de hojas (Let), extracto acuoso de hojas (Lag). Las preparaciones en polvo se almacenaron en un refrigerador en recipientes herméticamente cerrados, a partir de los cuales se prepararon soluciones madre para cada experimento [19].

La composición cualitativa y cuantitativa de los alcaloides de oxindol contenidos en los extractos de U. tomentosa se determinó mediante análisis de huellas dactilares HPLC. Las características generales de los alcaloides cuantitativos de este material fueron descritas previamente por nosotros en la publicación de Bors et al. [18].

Se detectaron uncarina F, especiofilina, mitrafilina, pteropodina/isomitrafilina e isopteropodina en extractos de U. tomentosa. La mitrafilina y la pteropodina/isomitrafilina son alcaloides que dominan en los extractos de hojas, mientras que la pteropodina/isomitrafilina dominan en los extractos de corteza. Los extractos etanólicos se caracterizaron por un mayor contenido de alcaloides que los extractos acuosos (Figura 5).

Las características generales de la determinación cuantitativa de polifenoles en extractos de U. tomentosa fueron descritas previamente por nosotros [17]. El análisis HPLC/DAD reveló que los extractos etanólicos y acuosos de la corteza contenían principalmente procianidina B2 y C1, así como (-)-epicatequina. Los derivados del ácido cafeico solo se determinaron en extractos acuosos de hojas, mientras que el ácido clorogénico, los flavonoles y las proantocianidinas poliméricas se encontraron en todos los extractos estudiados. Las mayores concentraciones totales de fenoles libres se determinaron en los extractos etanólicos de la corteza. El alto contenido de compuestos fenólicos también se detectó en el extracto etanólico de hojas, mientras que la menor concentración fenólica se detectó en un extracto acuoso de corteza y extractos etanólicos de hojas (Figura 6).

Finalmente, todos los extractos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO). La solución obtenida se añadió en un pequeño volumen de 1 μL a 1 mL de suspensión de eritrocitos (la concentración de DMSO no influyó en la membrana celular). Los eritrocitos suplementados solo con DMSO se usaron como controles.

4.2.2.Aislamiento de eritrocitos

Se obtuvo una capa leucocitaria de leucocitos a partir de sangre recolectada en el Banco de Sangre en Lodz, Polonia. La capa leucocitaria leucocitaria se centrifugó (3000 rpm durante 10 min a 4 grados) y se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4).

Los eritrocitos aislados suspendidos en PBS se incubaron durante 2, 5 y 24 h con cuatro tipos de extractos (extractos etanólico y acuoso de la corteza y extractos etanólico y acuoso de las hojas) a las concentraciones de 100 ug/mL, 250 ug/mL y 500 ug/mL Estudios previos han demostrado que los extractos estudiados a estas concentraciones no causaron daño a los eritrocitos, mientras que exhibieron un efecto protector sobre los glóbulos rojos [17,19,22].

4.3. Fluidez de la membrana

La fluidez de la membrana de los eritrocitos se determinó mediante espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica (EPR) (espectrómetro Brucker 300, Alemania) usando 5-ácido doxilesteárico (5-DSA) y 16-ácido doxilesteárico ( Etiquetas giratorias 16-DSA). A partir de los espectros de EPR obtenidos para la etiqueta giratoria 5-DSA, se calculó el parámetro de ordenación S. Los tiempos de correlación TB y TC se calcularon a partir de los espectros EPR obtenidos para el marcador giratorio 16-DSA. El parámetro de ordenación Sa así como los tiempos de correlación TB y tc muestran la correlación inversa con la fluidez de la membrana. El parámetro de orden S y los tiempos de correlación tB y tc se calcularon como se describe en el estudio de Koter et al. [52].

4.4.Viscosidad interna de los glóbulos rojos

El spin-label TEMPOL se utilizó para determinar la viscosidad interna de los eritrocitos [53]. Se añadió solución de TEMPOL (20 mM) disuelta en solución salina tamponada (PBS) a la suspensión de eritrocitos con hematocrito al 50 por ciento. Después de 30-min de incubación, los eritrocitos se lavaron tres veces con solución de K3Fe(CN6) 80 mM para reducir la señal del spin-label ubicado en el espacio intercelular. Basado en el espectro obtenido para TEMPOL en agua y en eritrocitos , el tiempo de correlación rotacional se determinó según la fórmula:

-(2)"-1

(1)

donde: k: constante para la etiqueta de espín de nitróxido, k=6.5×10-9s mT-l, ho: la altura de la línea central, h_1: altura de la parte superior línea de campo, Wo: anchura de la línea central.

La viscosidad relativa se determinó a partir de la fórmula:

TR

_C

(2)"1 B

donde: TR: tiempo de correlación rotacional del marcador en eritrocitos, TB: tiempo de correlación rotacional del marcador en PBS, c: viscosidad interna del eritrocito, 1B: viscosidad PBS (se asumió el valor 1).

4.5. Fragilidad osmótica

Después de la incubación de los eritrocitos con extractos de U. tomentosa, las células se centrifugaron a 3000rpm durante 10 minutos a 4 grados. A continuación, las células se lavaron con solución de NaCl al 0,9 por ciento. Este paso se repitió dos veces. Después de eliminar el sobrenadante, los glóbulos rojos se suspendieron en una solución de NaCl en el rango de concentración de 0,2 a 0,9 por ciento (se seleccionaron 15 puntos). Las células se incubaron durante 30 minutos a 37 grados y luego se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos a 4 grados C. La densidad óptica del sobrenadante se midió a 540 nm (Adobe) utilizando un lector de absorbancia de microplacas (BioTek Elx808, BIOTEK).

La hemólisis en cada tubo se expresó como porcentaje, tomando la hemólisis en agua destilada como 100 por ciento (A100 por ciento):

×100 (3)

Porcentaje de hemólisis ( por ciento o)= Aole

A100

4.6. Análisis estadístico

Los resultados se presentaron como la media ± SD lograda de 4 a 6 experimentos individuales (4-6 donantes de sangre), mientras que para cada individuo (donante), el punto experimental fue un valor medio de 2-3 repeticiones. Las comparaciones múltiples entre las diferencias de medias entre grupos se analizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas para p<0.05. all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" statistica="" software(statsoft,="" inc,="" tulsa,="" va,="">

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