Abstracto:Se ha informado que las raíces de Vitis amurensis tienen el potencial de blanquear la piel a través de la evaluación de la melanogénesis y las actividades inhibidoras de la tirosinasa. En este estudio, se utilizaron raíces de V. amurensis para seleccionar rápidamente los ingredientes blanqueadores usando LC-Q-TOF-MS junto con un ensayo inhibidor de tirosinasa, y para optimizar el proceso de extracción para su uso como material funcional para blanquear la piel mediante la metodología de superficie de respuesta. Los resultados mostraron que las raíces de V. amurensis exhibieron efectos inhibidores de tirosinasa por dos oligómeros de estilbeno, ε-vinifera (1) y vitamina B (2), según lo previsto por LC-Q-TOF-MS junto con bioensayo. Las condiciones de extracción óptimas (concentración de metanol del 66 %, volumen de disolvente de 140 ml y tiempo de extracción de 100 min) para los ingredientes blanqueadores de la piel se establecieron con rendimientos del 6,20 % y la actividad inhibidora de la tirosinasa fue del 87,27 %. La relación entre cada factor y su correspondiente respuesta fue confirmada por el análisis de correlación de Pearson. El volumen de solvente mostró una clara relación lineal con los rendimientos, y la concentración de metanol tuvo una fuerte relación lineal con la actividad inhibidora de tirosinasa para los compuestos 1 y 2, así como su combinación. En general, se demostró que la LC-Q-TOF-MS junto con el bioensayo tiene el potencial de encontrar de forma eficaz nuevos componentes activos, así como componentes activos conocidos; Las vitaminas se pueden proponer como un nuevo agente blanqueador potencial natural.

Según estudios relevantes,cistanchees una hierba común que se conoce como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente escistanósido, que tiene varios efectos tales comoantioxidante, antiinflamatorio, ypromoción de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche yblanqueamiento de la pielreside en el efecto antioxidante de la cistancheglucósidos. La melanina en la piel humana es producida por la oxidación de tirosina catalizada portirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contienecistanósido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, inhibiendo así la producción de melanina.

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Palabras clave:vitis amurensis; LC-Q-TOF-MS junto con ensayo inhibidor de tirosinasa; metodología de superficie de respuesta; correlación de Pearson

1. Introducción

La melanina es responsable del color de la piel y el cabello de los mamíferos y protege la piel de los rayos ultravioleta, pero la producción excesiva de melanina y la acumulación de melanina en la piel provocan trastornos cutáneos de hiperpigmentación como pecas, melasma, manchas de la edad, efélides y lentigos seniles. La tirosinasa, conocida como una enzima oxidasa que contiene cobre, tiene un papel crucial en la biosíntesis de melanina. La enzima catalizó dos reacciones de oxidación consecutivas: el primer paso, la hidroxilación de L-tirosina a 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA), y el segundo paso, la oxidación de L-DOPA a dopaquinona. La dopaquinona es una sustancia altamente reactiva que puede polimerizarse espontáneamente para generar melanina [1–3]. Por lo tanto, los inhibidores de tirosinasa se pueden usar como tratamientos para trastornos de la piel relacionados con la hiperpigmentación y como agentes para blanquear la piel.

Vitis amurensis, una especie de uva de crecimiento silvestre, se distribuye principalmente en Asia (Corea, China y Japón). Las frutas completamente maduras se consumen crudas y contienen abundantes nutrientes como sacarosa, glucosa, proteínas y vitaminas, por lo que se utilizan como material para vino, jugo, jaleas y mermeladas. Además, sus hojas se utilizan en una ensalada [4]. Sus raíces y tallos se han utilizado como medicina tradicional para el tratamiento del cáncer, el dolor neurálgico y el dolor abdominal [5,6]. Sus raíces consisten en estilbenos (un componente principal), procianidinas, flavonoides, triterpenoides y otros compuestos fenólicos. Hasta ahora, las composiciones químicas de la raíz se han estudiado con suficiente detalle. En particular, se informaron varios oligómeros de estilbeno, incluidos el resveratrol, la amurensina A, la vitamina A, ( plus )-ε-vinifera, las amurensinas C-M, la ampelopsina A, D y la ampelopsina E [6]. El extracto metanólico de la raíz exhibe un efecto anti-melanogénico contra la melanogénesis inducida por hormonas estimulantes de melanocitos en células B16F10 y en la oxidación de 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) a través de la tirosinasa de hongo [7]. Además, los extractos de V. amurensis y sus compuestos activos muestran efectos antioxidantes, antiinflamatorios, neuroprotectores y antitumorales [7–10].

LC-MS combinado con un bioensayo puede confirmar simultáneamente el perfil químico y la actividad biológica de los componentes en productos naturales sin necesidad de extracción y aislamiento. Por lo tanto, recientemente se ha utilizado para identificar de manera eficiente y rápida compuestos bioactivos en productos naturales [11-13].

La optimización es un proceso que permite la máxima eficiencia de los sistemas o productos experimentales. La metodología de superficie de respuesta (RSM), el análisis multivariante, el diseño de experimentos mediante técnicas matemáticas y estadísticas basadas en modelos empíricos, y la expresión de la correlación entre el diseño experimental y los resultados como una función polinomial, son algunas técnicas que proporcionan condiciones ideales de optimización con la máxima eficiencia. RSM es un método de optimización preciso y eficiente ampliamente utilizado en varios campos, incluido el procesamiento de alimentos, la química, la biología y la agricultura [14–16]. En las últimas décadas ha aumentado el interés por los productos farmacéuticos, cosméticos y alimentos funcionales que contienen productos naturales; en consecuencia, existe una investigación en curso tanto en la academia como en la industria destinada a desarrollar dichos productos [17,18]. El primer paso en estos estudios implica la extracción del componente bioactivo de los productos naturales. En este momento, dado que numerosos factores como el tiempo de extracción, la temperatura, la relación líquido-sólido y el volumen de solvente afectaron los componentes extraídos, se requiere una optimización para extraer al máximo los componentes bioactivos.

Hasta donde sabemos, los componentes inhibidores de la tirosinasa y la optimización de los extractos de raíces de V. amurensis rara vez se han informado [5,19]. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo obtener rápidamente el inhibidor de tirosinasa de las raíces de V. amurensis usando LC-Q-TOF-MS junto con el ensayo inhibidor de tirosinasa y optimizar las condiciones de extracción para ampliar la utilización de las raíces de V. amurensis como agente blanqueador de la piel. por RSM.

2. Resultados y Discusión

2.1. LC-QTOF MS acoplado con un ensayo inhibidor de tirosinasa utilizando el extracto de raíz de V. amurensis

El extracto de MeOH al 80 por ciento de la raíz de V. amurensis exhibió una actividad inhibidora significativa de la tirosinasa (80,7 ± 0,8 por ciento a 50 µg/mL, Tabla S1). Para identificar los compuestos inhibidores de tirosinasa en la raíz de V. amurensis sin aislamiento, se realizó LC-QTOF-MS junto con un ensayo inhibidor de tirosinasa. El perfil químico del extracto de raíz de V. amurensis se obtuvo en la primera ejecución (Figura S1), y los compuestos bioactivos se identificaron mediante un ensayo inhibidor de tirosinasa de fracciones recolectadas cada 30 s de la segunda ejecución (Figura 1). Hubo dos picos entre 19 y 22 min en el cromatograma de masas que se predijo que tenían una actividad inhibidora de tirosinasa significativa, y se identificó que sus estructuras eran dímero de estilbeno (1) y tetrámero de estilbeno (2) utilizando perfiles químicos (Tabla 1).

2.2. Identificación de los constituyentes inhibidores de la tirosinasa de la raíz de V. amurensis

En primer lugar, se aislaron de la fracción de EtOAc dos constituyentes que se esperaba que tuvieran actividad inhibidora de la tirosinasa y se evaluó su bioactividad. Las estructuras de los compuestos aislados 1 y 2 se identificaron como ε-vinifera (1) [20,21] y vitamina B ( -vinifera, 2) [21–23], respectivamente, utilizando 1H-NMR, 13C-NMR y ESI-MS (Figura 2, Figuras S2 y S3, y Tabla S2). En el ensayo inhibidor de tirosinasa, los valores de CI50 de los compuestos 1, 2 y ácido kójico fueron 3,51, 10,74 y 27,09 µM, respectivamente. Ambos compuestos mostraron mayores efectos inhibidores de la tirosinasa que el control positivo, el ácido kójico, que es el componente blanqueador de la piel conocido (Tabla 1 y Figura S4). En estudios previos, se informó que ε-vinifera (1) tiene actividad inhibidora de la tirosinasa [23]; sin embargo, la vitamina B (2) se identificó por primera vez en nuestro estudio.

En general, los resultados, correlacionados con los datos previstos de LC-MS junto con un ensayo inhibidor de tirosinasa y vitamina B (2), muestran potencial como un nuevo inhibidor de tirosinasa. Además, se realizaron estudios de acoplamiento molecular para respaldar el resultado de la importante actividad inhibidora de la tirosinasa de los dos oligómeros de estilbeno. Como se muestra en la Tabla 1, los compuestos 1 y 2 mostraron una puntuación de acoplamiento más alta que el control positivo, ácido kójico, de acuerdo con nuestros datos experimentales. Sin embargo, los resultados de acoplamiento de los compuestos fueron contrarios a nuestros resultados experimentales. Los modos de interacción de los compuestos 1 y 2 se describieron en la Figura 3. El compuesto 1 formó 4 enlaces de hidrógeno, 2 interacciones hidrofóbicas y 1 interacción de par pi-lone, y el compuesto 2 formó 11 enlaces de hidrógeno, 7 interacciones hidrofóbicas, 1 interacción de van der Waals. , y 3 interacciones de pares pi-lone. Como resultado, se confirmó que los compuestos pueden insertarse en el sitio activo de la proteína diana y unirse a residuos de aminoácidos catalíticos que pueden inhibir la actividad de la tirosinasa. Además, ε-vinifera (1) se reporta como un inhibidor competitivo que se une al mismo sitio que la L-DOPA se une a la tirosinasa [23]. Se observó que la vitamina B (2) se une al mismo sitio que ε-vinifera (1), lo que confirmó que la vitamina B (2) es un nuevo inhibidor competitivo.

2.3. Optimización de la extracción de raíz de V. amurensis usando RSM

Para utilizar las raíces de V. amurensis como un material funcional para blanquear la piel, las condiciones de extracción óptimas fueron diseñadas por el diseño de Box-Behnken (BBD) para maximizar el rendimiento de extracción y la actividad inhibidora de la tirosinasa. Los efectos de respuestas independientes tales como rendimiento de extracción, actividad inhibidora de tirosinasa, cantidad de compuesto 1, cantidad de compuesto 2 y cantidad de la suma de los compuestos 1 y 2, en las tres variables independientes (tiempo de extracción, concentración de MeOH/agua y volumen de solvente), se midieron (Tabla 2). El rango de variables se estableció como tiempo de extracción (40, 70 y 100 min), concentración de MeOH (40, 70 y 100 por ciento) y volumen de solvente ( 35, 87,5 y 140 ml) basado en un experimento preliminar de un solo factor (datos no mostrados). Los valores obtenidos de los experimentos diseñados se expresaron como polinomios de correlaciones entre variables usando análisis de regresión (Tablas S4–S13 y Figura S5). Como resultado de realizar la optimización individual para cada reacción (Tabla 3), se esperaba que el rendimiento representara el 6,21 % cuando se extrajo con 100.00 min, MeOH 64,78 %, 140.{{42} } ml. La actividad inhibidora de tirosinasa (porcentaje) se extrajo con 65,22 min, MeOH 100.00 por ciento, 140,00 ml, y se predijo que mostraría un valor de 90,37 por ciento. La cantidad de compuesto 1 a los 65,74 min, MeOH 100.00 por ciento, 35,00 ml se predijo como 37,45 µg/mg, y la cantidad de compuesto 2 a los 70,00 min, MeOH 70,00 por ciento y 92,24 mL se predijo como 86.77 µg/mg. Además, se esperaba que los contenidos totales de los compuestos 1 y 2 mostraran un valor máximo de 108,10 µg/mg cuando se extrajeron en condiciones de 75,20 min, MeOH al 100,00 por ciento y 35,00 ml. Los experimentos basados ​​en condiciones optimizadas produjeron 6,19 ± 0,36 %, actividad inhibidora de la tirosinasa 91,72 ± 3,48 %, contenido del compuesto 1 36,54 ± 1,78 µg/mg, contenido del compuesto 2 85,74 ± 16,57 µg/mg y la suma de los compuestos 1 y {{85} Se obtuvieron },10 ± 19,11 µg/mg, y las respuestas individuales para cada variable mostraron una diferencia del 5 por ciento o menos con respecto a los valores predichos teóricamente. Se realizó una optimización de respuesta múltiple para maximizar el rendimiento de extracción y la actividad inhibidora de tirosinasa (Tabla 3). Las condiciones optimizadas fueron las siguientes: tiempo de extracción, 100 min; concentración de MeOH, 66,38 por ciento; y volumen de disolvente, 140 ml. Usando estas condiciones, se determinó que el rendimiento era 5,95 ± 1,13 por ciento y la actividad inhibidora de tirosinasa era 85,93 ± 1,57 por ciento; estos valores fueron similares a los valores previstos, 6,20 y 87,25 por ciento, respectivamente. Adicionalmente, se analizó la correlación entre cada variable y la respuesta correspondiente mediante la correlación de Pearson (Tabla 4). El rendimiento de extracción mostró una clara relación lineal entre el tiempo de extracción y la concentración de MeOH y una relación lineal negativa con la cantidad del compuesto 1. Además, la actividad inhibidora de la tirosinasa mostró una fuerte relación lineal entre la cantidad del compuesto 2 y la cantidad de la suma. de los compuestos 1 y 2 y una clara relación lineal con el compuesto 1. Por lo tanto, la actividad inhibidora de la tirosinasa de la raíz de V. amurensis fue proporcional a los compuestos 1 y 2, pero exhibió una relación lineal más fuerte con la cantidad del compuesto 2 que con el compuesto 1.

3. Materiales y Métodos

3.1. Procedimientos Experimentales Generales

La cromatografía líquida de media presión (MPLC) se realizó utilizando un Biotage Isolera (Biotage AB, Uppsala, Suecia). Un sistema está equipado con una bomba de cromatografía flash de alto rendimiento (HPFC), un detector de longitud de onda dual variable y un colector. Los espectros de RMN se adquirieron utilizando un espectrómetro Bruker SPECTROSPIN de 300 MHz (Bruker Corporation, Billerica, MA, EE. UU.). El metanol-d4, un solvente de RMN, se adquirió de Cambridge Isotope Laboratories, Inc. El acetonitrilo (ACN), el agua y el metanol (MeOH) de calidad cromatográfica se adquirieron de ThermoFisher Scientific Korea Ltd. (Seúl, República de Corea). La L-tirosina, la tirosinasa de hongos, el ácido kójico y el ácido fórmico se compraron en Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, EE. UU.).

3.2. Material vegetal

La raíz de V. amurensis se obtuvo de Gyeongbuk, Corea, y también se compró de Omniherb (Daegu, República de Corea). Fueron identificados por el Dr. Prof. Ki Yong Lee, de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Corea. Se depositó una muestra comprobante (KUP-HD071) en el Laboratorio de Farmacognosia, Facultad de Farmacia, Universidad de Corea.

3.3. Espectrometría de masas LC-Q-TOF

La CL se realizó con una serie Agilent 1260 (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) que comprende una bomba binaria, un desgasificador en línea, un muestreador automático, un compartimento de columna controlado termostáticamente y un detector de matriz de fotodiodos. La separación cromatográfica se realizó con una columna Shiseido CapCell PAK C18 (5 µm, 4,6 mm, DI × 150 nm). La fase móvil consistía en agua (disolvente A) y ACN (disolvente B), ambos con 0,1 por ciento de ácido fórmico. Las condiciones del gradiente fueron las siguientes: 0–5 min, 10 % B, 5–30 min y aumento lineal de B del 10 al 90 %. La velocidad del compañero se fijó en 0,6 ml/min; Se inyectaron 5 µL y 20 µL de las muestras para análisis LC-Q-TOF-MS y LC-Q-TOF-MS junto con ensayo inhibidor de tirosinasa, respectivamente. La espectrometría de masas se realizó utilizando un espectrómetro de masas Agilent 6530 Q-TOF (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) con una interfaz de ionización por electropulverización (ESI) en modo negativo. Los datos del rango de masas de m/z 50–1000 se recopilaron en modo centroide. Los parámetros de masa fueron los siguientes: voltaje capilar, 4000 V; presión del nebulizador, 40 psi; voltaje de fragmento, 175 V; voltaje del skimmer, 65 V; temperatura del gas de secado, 325 ◦C; índice compañero de gas de secado, 12,0 l/min; energía de colisión 10, 20, 30 y 40 eV. El ajuste de los parámetros de adquisición y el procesamiento de datos se realizaron mediante LC-MS/MS Data Acquisition mediante Q-TOF de la serie 6530 (versión B.05.00) (software MassHunter Workstation, Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.).

3.4. LC-Q-TOF-MS junto con un ensayo inhibidor de tirosinasa

Se realizó LC-Q-TOF-MS junto con un ensayo inhibidor de tirosinasa utilizando el método establecido en el estudio anterior [24]. En resumen, el ensayo se realizó en dos tandas. En la primera corrida, el perfil químico de la muestra se obtuvo usando LC-Q-TOF-MS. En la siguiente ejecución, el eluido después de pasar por el sistema de LC en las condiciones de LC-Q-TOF indicadas se recogió en 96-placas de pocillos cada 30 s. La actividad inhibidora de tirosinasa de las fracciones recolectadas se evaluó usando un ensayo inhibidor de tirosinasa.

3.5. Aislamiento de compuestos inhibidores de tirosinasa de raíz de V. amurensis

Para el aislamiento de compuestos inhibidores de tirosinasa identificados mediante LC-Q-TOF-MS junto con el ensayo de inhibición de tirosinasa, se extrajo raíz de V. amurensis (3,01 kg) tres veces con 80 por ciento MeOH durante 60 min a temperatura ambiente usando ultrasonidos. El disolvente extraído se filtró y se concentró para obtener un extracto bruto (215,7 g), que se suspendió en agua y se repartió secuencialmente utilizando n-hexano, acetato de etilo (EtOAc) y n-BuOH. La fracción de EtOAc (25,85 g) se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice usando n-hexano:EtOAc en condiciones de gradiente (20:1 → 0:1) para producir siete fracciones (E1–E7). La fracción E4 se separó mediante MPLC y 100 g de SNAP KP-Sil, un cartucho de gel de sílice y diclorometano: MeOH en condiciones de gradiente (97:3 → 0:100) para producir siete subfracciones (E4–1 a E4–7) . El compuesto 2 (417,0 mg) se obtuvo de E4-5. La subfracción E4–4 se volvió a cromatografiar en MPLC utilizando SNAP 25 g Ultra, un cartucho de gel de sílice y cloroformo:MeOH:H2O en condiciones de gradiente (50:4:1 → 15:4:1) para producir siete fracciones ( E4–4–1 a E4–4–7). El compuesto 1 (396,0 mg) se obtuvo de E4–4–5, que se observó como una sola mancha en una placa de cromatografía en capa fina (TLC).

3.6. Ensayo inhibidor de tirosinasa

La actividad inhibidora de la tirosinasa se evaluó utilizando un método descrito previamente con una ligera modificación [25]. Los dos microlitros de muestra y 50 µL de 0.1 U/µL de tirosinasa de hongo se trataron en 96-placas de pocillos y se incubaron a 37 ◦C. Después de 15 min, se añadieron 50 µL de L-tirosina 1 mM y luego se hizo reaccionar a 37 ◦C durante 15 min. La cantidad de dopacromo formado se midió a 495 nm utilizando un lector de microplacas Spectra Max 19{{20}} (Molecular Devices, San Jose, CA, EE. UU.). La actividad inhibidora de tirosinasa se calculó mediante la siguiente ecuación: inhibición de tirosinasa (porcentaje)=[1 − (S − S0)/(C − C0)] × 100, donde S es la absorbancia de la muestra, la tirosinasa y L -tirosina; S0 es la absorbancia de la muestra y la L-tirosina; C es la absorbancia de tirosinasa y L-tirosina, y C0 es la absorbancia de L-tirosina. Se usó ácido kójico, un conocido inhibidor de la tirosinasa, como control positivo. Los valores de IC50 se calcularon utilizando GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE. UU.).

3.7. Estudios de acoplamiento molecular

El acoplamiento molecular se realizó utilizando el software SYBYL-X 2.1.1 (Tripos Ltd., St. Louis, MO, EE. UU.) con estructuras cristalinas de PPO3, una tirosinasa de Agaricus bisporus (Protein Data Bank (PDB) ID: 2Y9W). Se eliminaron todas las moléculas de agua de la proteína diana y la preparación del ligando se llevó a cabo mediante el protocolo de preparación de "desinfección" en SYBYL-X 2.1.1. La afinidad proteína-ligando se calculó mediante el campo de fuerza de Tripos y se expresó como puntuaciones totales. La pose acoplada del ligando del complejo proteína-ligando se visualizó en el programa Discovery Studio 2017 R2 Client (Biovia Co., San Diego, CA, EE. UU.).

3.8. Diseño Experimental y Análisis Estadístico

Se estableció una condición optimizada para extraer constituyentes con máxima actividad inhibidora de tirosinasa de la raíz de V. amurensis usando el BBD con tres variables y tres niveles (MINITAB Versión 14.12.0 Statistical Software). Con base en los resultados preliminares del experimento de un solo factor, se seleccionaron las variables independientes, incluido el tiempo de extracción (X1), la concentración de MeOH y agua (X2) y el volumen de líquido (X3), y un rango de sus variables (Tabla S3). Las variables para RSM se codificaron utilizando tres niveles, −1, 0 y 1. En total, se diseñaron 15 experimentos que incluían 3 réplicas en el centro del diseño (Tabla 2). Como respuestas independientes, se midieron el rendimiento (porcentaje), la actividad inhibidora de tirosinasa (porcentaje), la cantidad de compuesto (1) (µg/mg) y la cantidad de compuesto (2) (µg/mg). La actividad inhibidora de tirosinasa del extracto se evaluó a una concentración de 50 µg/mL. Cada respuesta se expresa utilizando la siguiente ecuación polinomial de segundo orden:

donde R denota la respuesta; 1, 2 y 3 son los coeficientes lineales; 12, 23 y 13 son los coeficientes de interacción entre tres variables; y 11, 22 y 33 son los coeficientes cuadráticos.
Además, se realizó el análisis de correlación de Pearson para determinar la existencia de una relación lineal entre cada variable y la respuesta. El coeficiente de correlación de Pearson tiene una fuerte relación lineal entre {{0}}.7 y 1.0, una clara relación lineal entre 0.3 y 0.7, una relación lineal débil entre {{10}}.1 y 0.3, y una relación lineal nula o insignificante entre 0.0 y 0.1. La correlación positiva y negativa se expresa dependiendo de si el coeficiente de correlación de Pearson es positivo o negativo.

3.9. Análisis cuantitativo de los compuestos inhibidores de tirosinasa 1 y 2

La cantidad de cada compuesto 1 y 2 en los extractos obtenidos usando las 15 condiciones experimentales diseñadas se midió usando las curvas de calibración (Tabla 2). Las curvas de calibración para los compuestos 1 y 2 se determinaron utilizando el área bajo la curva del cromatograma UV (330 nm adquiridos a concentraciones de 0,1–1000 µg/mL y 7,81–1000 µg/mL, respectivamente). La LC se realizó utilizando un sistema LC Waters 2695 (Waters, Santa Clara, CA, EE. UU.) con las mismas condiciones que las del sistema LC detalladas en Materiales y Métodos, espectrometría de masas LC-Q-TOF.

4. Conclusiones

La ε-viniferina (1) y la vitamina B (2) de las raíces de V. amurensis se caracterizaron como componentes blanqueadores de la piel mediante LC-Q-TOF-MS junto con un ensayo inhibidor de tirosinasa. En particular, la vitamina B (2) se identificó por primera vez como un compuesto inhibidor de tirosinasa en este estudio y ε-vinifera (1) y la vitamina B (2) mostraron efectos inhibidores de tirosinasa más altos que el control positivo, el ácido kójico. Las condiciones de optimización con el máximo efecto inhibidor de la tirosinasa y el rendimiento de las raíces de V. amurensis se establecieron utilizando el tiempo de extracción (100 min), la concentración de MeOH (66,38 %) y el volumen de líquido (140 ml). El resultado exhibió una buena correspondencia entre los valores experimentales y predichos. En consecuencia, la LC-Q-TOF-MS junto con el bioensayo ha demostrado el potencial para encontrar de forma efectiva nuevos componentes activos, así como componentes activos conocidos, vitamina B (2), que puede proponerse como un nuevo agente blanqueador potencial natural.

Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea, Figura S1: Cromatograma MS en modo de ionización negativa (A); Cromatograma UV a 280 nm (B) de extractos de raíces de V. amurensis, Figura S2: Espectros de RMN de 1H y 13C del compuesto 1 (300 y 75 MHz, CD3OD), Figura S3: Espectros de RMN de 1H y 13C del compuesto 2 (300 y 75 MHz, CD3OD), Figura S4: Gráfico sigmoidal e IC50 del control positivo, compuestos 1 y 2, Figura S5: Gráficos de superficie y contorno de respuesta que muestran el efecto de los parámetros de extracción (X1: tiempo de extracción, min; X2: concentración de MeOH, porcentaje; X3: volumen de disolvente, ml). (Un rendimiento; (B) actividad inhibidora de tirosinasa; (C) compuesto 1; (D) compuesto 2; (E) suma de los compuestos 1 y 2, Tabla S1. Actividad inhibitoria de tirosinasa de extractos de raíces de V. amurensis, Tabla S2: Datos de RMN de 1H y 13C de los compuestos 1 y 2 en CD3OD (δ en ppm), Tabla S3: Variables independientes y niveles para la metodología de superficie de respuesta, Tabla S4: Regresión estimada coeficiente de rendimiento, Tabla S5: Análisis de varianza para el rendimiento, Tabla S6: Coeficiente de regresión estimado para la actividad inhibidora de tirosinasa, Tabla S7: Análisis de varianza para la actividad inhibidora de tirosinasa, Tabla S8: Coeficiente de regresión estimado para el compuesto 1, Tabla S9: Análisis de varianza para el compuesto 1, Tabla S10: Coeficiente de regresión estimado para el compuesto 2, Tabla S11. Análisis de varianza para el compuesto 2, Tabla S12: Coeficiente de regresión estimado para la suma de los compuestos 1 y 2, Tabla S13: Análisis de varianza para la suma de los compuestos 1 y 2.
Contribuciones de autor: Conceptualización, KYL; metodología, K.-EO, HS y KYL; software, K.-EO y HS; validación, SA; análisis formal, K.-EO, y HS; investigación, K.-EO, HS, MKL y KYL; curación de datos, K.-EO, HS, BP y KYL; redacción: preparación del borrador original, K.-EO y HS; redacción—revisión y edición, HS, MKL, BP y KYL; supervisión, MKL, BP y KYL Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
Fondos: Esta investigación fue financiada por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiada por el Gobierno de Corea (NRF-2017R1A2B4003403 y NRF-2019R1A6A1A03031807) y una subvención del Proyecto de I+D de tecnología sanitaria de Corea a través del Desarrollo de la industria sanitaria de Corea Institute (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (HF20C0038).
Declaración de disponibilidad de datos: Los datos presentados en este estudio están disponibles en el material complementario.
Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Disponibilidad de muestras: No disponible

Referencias

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