Sistema mediador de lacasa que utiliza un mediador natural como agente blanqueador para la decoloración de la melanina Parte 1

Abstracto: En este estudio, se desarrolló un sistema mediador de lacasa (LMS) que utiliza un mediador natural como agente blanqueador para la decoloración por melanina. Se utilizaron siete mediadores naturales para reemplazar a los mediadores sintéticos y superar con éxito el bajo potencial redox de la lacasa y el acceso limitado de la melanina al sitio activo de la lacasa. La actividad de decoloración de melanina de las lacasas de Trametes versicolor (lacT) y Myceliophthora thermophila (lacM) se mejoró significativamente usando mediadores naturales que incluyen acetosiringona, siringaldehído y acetovanillona, ​​que mostraron baja citotoxicidad. Los grupos metoxi y cetona de los mediadores naturales juegan un papel importante en la decoloración de la melanina. Las constantes de especificidad de lacT y lacM para la decoloración de melanina aumentaron en 247 y 334, respectivamente, cuando se usó acetosiringona como mediador. El LMS que usa encaje y acetosiringona también podría decolorar la melanina presente en la película de hidrogel de celulosa, que imita la condición de la piel. Además, LMS podría decolorar no solo los análogos de eumelanina sintética preparados por la oxidación de la tirosina, sino también la melanina natural producida por las células de melanoma.

Según estudios relevantes,cistanchees una hierba común que se conoce como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente escistanósido, que tiene varios efectos tales comoantioxidante, antiinflamatorio, ypromoción de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche yblanqueamiento de la pielreside en el efecto antioxidante de la cistancheglucósidos. Melaninaen la piel humana se produce por la oxidación de tirosina catalizada portirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contienecistanósido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, por lo queinhibiendo la producción de melanina.

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1. Introducción

Las lacasas (EC 1.10.3.2, bencenodiol: dioxígeno oxidorreductasas) son proteínas multicobre que catalizan la oxidación de diversos compuestos fenólicos y no fenólicos mediante un mecanismo de reacción catalizada por radicales mediante la reducción del oxígeno molecular [1,2]. Las lacasas se han utilizado como biocatalizadores para procesos de biodegradación, como la biorremediación de colorantes [3,4], productos farmacéuticos [5,6], herbicidas [7] y deslignificación [8–10]. Las lacasas también se han utilizado para catalizar la polimerización de precursores de colorantes y compuestos orgánicos [11]. En particular, sus propiedades atractivas, como la baja especificidad de sustrato, el uso de oxígeno como aceptor final de electrones, la generación de agua como subproducto y la no demanda (o no producción) de peróxidos, los hacen interesantes en biotecnología y campos ambientales [1,11,12].

Cuatro iones de cobre en el sitio activo están involucrados en la actividad catalítica de lacasa. El cobre "azul" (sitio T1) oxida el sustrato, y el grupo de cobre trinuclear (T2/T3) recibe los electrones del sitio T1 para reducir el oxígeno molecular [1,12,13]. En particular, el potencial redox del sitio T1 Cu se considera un factor importante para determinar la capacidad catalítica de las lacasas [14]. Las lacasas poseen un potencial redox relativamente bajo (0.4–0.8 V) en comparación con las peroxidasas ligninolíticas (más de 1 V) como la manganeso peroxidasa y la lignina peroxidasa. Las lacasas no pueden oxidar directamente sustratos no fenólicos con un potencial redox superior a 1,3 V [13,14]. Por lo tanto, para superar las limitaciones de la lacasa, los sistemas mediadores de lacasa (LMS) que utilizan compuestos moleculares pequeños, como 2,20 -azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS), { {24}}Se han sugerido hidroxibenzotriazol (HOBt), ácido violúrico (VLA), N-hidroxiftalimida (HPI), N-hidroxiacetanilida (NHA) y TEMPO, que actúan como mediadores redox [15–17].

Estos mediadores permiten la oxidación de compuestos voluminosos por diferentes vías de oxidación. El sistema lacasa-ABTS oxida sustratos generando un radical ABTS catiónico a través de un mecanismo de transferencia de electrones (ET). Los LMS con HOBt, VLA, HPI o NHA producen radicales nitroxilo a través del mecanismo de transferencia de átomos de hidrógeno (HAT) [1,12,17]. Además, los mediadores como TEMPO y sus análogos reaccionan a través de vías iónicas para generar iones de oxoamonio [1,12,18]. El uso de estos mediadores puede oxidar una amplia gama de compuestos en diversas aplicaciones, como la degradación de colorantes [3,4], la degradación de fármacos [5,6] y la degradación de lignina [8–10]. Sin embargo, las aplicaciones de los mediadores sintéticos en campos industriales han sido limitadas debido a su potencial toxicidad, alto costo y efecto de inactivación de enzimas. Recientemente, se han estudiado moléculas fenólicas derivadas de la lignina como mediadores naturales (p. ej., siringaldehído, acetosiringona, vainillina, acetovanillona, ​​vainillato de metilo, ácido ferúlico, ácido sinápico, ácido p-cumárico, etc.) para reemplazar a los mediadores sintéticos [1,12]. . Las ventajas de los mediadores naturales son el bajo costo y la baja toxicidad porque se obtienen de fuentes naturales y renovables [19].

La melanina es un grupo de pigmentos naturales producidos por la melanogénesis a través de la polimerización oxidativa de la tirosina por los melanocitos. La melanina natural se puede clasificar en cinco categorías: eumelanina, feomelanina, toda la melanina, feomelanina y neuromelanina [20]. Recientemente, se han estudiado diversas aplicaciones médicas y electroquímicas que utilizan melanina o precursores de melanina [20,21]. El color de la piel humana está determinado principalmente por la presencia de melanina. En la industria cosmética se ha propuesto la despigmentación directa de la melanina mediante enzimas para el desarrollo de agentes blanqueadores de la piel. Se han estudiado varias peroxidasas para decolorar la melanina. Woo et al. mostró que la melanina sintética puede ser decolorada directamente por la lignina peroxidasa de P. chrysosporium [22]. Los grupos de Keneko y Mohorˇciˇc también informaron sobre la decoloración enzimática de la melanina por la peroxidasa de manganeso aislada de hongos (Sporotrichum pruinose y Phlebia radiata) [23,24]. Kim et al. informaron que las mezclas de enzimas crudas que contenían peroxidasa de manganeso, peroxidasa de lignina y lacasa mostraron actividad despigmentante de melanina [25]. Cuando las peroxidasas decoloran la melanina, requieren peróxido de hidrógeno (H2O2) como cofactor que puede irritar la piel. Por lo tanto, para reducir el uso de H2O2, se introdujo glucosa oxidasa o lacasa en el sistema de combinación de enzimas [26,27]. Las lacasas pueden decolorar la melanina sin el uso de peróxido de hidrógeno. Khammuang y Sarnthima informaron que la lacasa de Lentinus polycarpous Lév mostró actividad de decoloración de melanina usando ABTS, vainillina y ácido vanílico como mediadores [28].

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales

2.2. Decoloración de melanina por LMS

La solución saturada de melanina (1,4 mg/ml) se preparó mediante la disolución de 3 mg de melanina sintética en 1,3 ml de NaOH 10 mM. La solución se centrifugó a 8500 rpm durante 5 min para eliminar la melanina no disuelta y el sobrenadante se diluyó con tampón de fosfato de ácido cítrico 0,1 M (pH 3, 4, 5, 5.5, 6 o 7) y se utiliza como solución de sustrato para LMS. La concentración de melanina en la solución de sustrato fue de 63 µg/mL y se confirmó espectrofotométricamente a 475 nm. Los 0.8 ml de solución de sustrato de melanina se mezclaron con 0.1 ml de solución de mediador (0–1 mM) en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. La reacción de decoloración de la melanina se inició añadiendo 0,1 mL de solución de lacasa (15,8 µg (0,6 U) lacT o 19,2 µg (1,8 U) lacM) a una mezcla de melanina y el mediador a 25 ◦C en un baño de agua con agitación a 120 rpm. . Después de la reacción, la mezcla de reacción se centrifugó y la absorbancia del sobrenadante se midió a 475 nm. El rendimiento de decoloración (porcentaje) se calculó usando la siguiente ecuación:

Decoloración (porcentaje) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. Estudio cinético de la decoloración de melanina por LMS

2.4. Citotoxicidad de los mediadores naturales

Se usó la línea celular de melanoma B16F10 (Korea Cell Line Bank, Seúl, Corea) para determinar la citotoxicidad de los mediadores naturales para LMS. Se realizó un ensayo de rojo neutro (NR) para medir la citotoxicidad de los mediadores [29]. NR mide la viabilidad de los lisosomas de células vivas. Se dispensaron células de melanoma con una concentración de 3 × 104 células en cada pocillo de una placa de 96-pocillos. Después de 24 h de cultivo, las células se trataron con mediadores naturales (1, 2, 5, 10, 22 y 46 mM). Después de un cultivo adicional durante 2 días, las células se trataron con una solución de NR de 50 µg/ml disuelta en DMEM y se incubaron durante 3 h. Después de eliminar el sobrenadante mediante succión, se usó una solución desorbente NR (1 por ciento de ácido acético glacial, 49 por ciento de etanol y 50 por ciento de agua destilada) para la extracción del color. Después del proceso de extracción, se midió el cambio de absorbancia a 540 nm.

2.5. Preparación y decoloración de la película de hidrogel de melanina/celulosa

Para medir la actividad de decoloración de LMS para la película de melanina/celulosa, la película de hidrogel preparada se cortó en una lámina de 1 × 2 cm. La película de hidrogel se sumergió en 4 ml de tampón de fosfato de ácido cítrico 0,1 M (pH 5,5); posteriormente, se añadieron al tampón 0,5 ml de acetosiringona 1 mM y 0,5 ml de solución de encaje (2,5 U). La reacción de decoloración se llevó a cabo en baño maría con agitación a 120 pm y 25 ◦C durante 3 h. Después de la reacción, la película se lavó con agua destilada y se adhirió al lado interno de la cubeta para medir el cambio en los espectros en el rango de 400 a 800 nm utilizando un espectrofotómetro UV/Vis. Las reacciones de control sin lacM o mediadores también se realizaron en las mismas condiciones. La liberación de la melanina de la película o el cambio de color de la película de melanina/celulosa no se detectó en las condiciones de reacción. Además, el cambio en los parámetros de color (valores L*, a* y b*) de la película de melanina/celulosa después de la reacción de decoloración por LMS también se registró utilizando un colorímetro (KONICA MI NOLTA, Tokio, Japón). Los valores de ∆L (diferencia de luminosidad métrica), ∆E (diferencia de color total), YI (índice de amarilleamiento) y WI (índice de blancura) se obtuvieron utilizando las siguientes ecuaciones [30–32]:

2.6. Preparación de Melanina Natural

La melanina natural se obtuvo a partir de células de melanoma B16F10. Las células se trataron con hormona estimulante de melanocitos alfa para producir melanina. Después de 4 días de incubación, las células se capturaron usando tripsina-EDTA y se sonicaron durante 10 min. El sobrenadante se obtuvo por centrifugación a 8000 rpm durante 10 min y luego se ajustó a pH 1,5 usando HCl 6 M. La solución se hirvió a 100 ◦C durante 4 h para hidrolizar las fracciones de proteína residual. La solución que contenía melanina natural se lavó con acetona, seguido de cloroformo y etanol, y luego se lavó con agua desionizada para eliminar residuos, como células, componentes de medios y fracciones de proteínas [33,34]. Todos los procesos de lavado se realizaron más de dos veces. Finalmente, la melanina natural se obtuvo mediante liofilización y se utilizó como sustrato para LMS.

3. Resultados y discusión

3.1. El efecto de los mediadores en la decoloración de melanina por LMS

El efecto de varios mediadores en la reacción de decoloración de melanina por LMS se investigó usando dos lacasas de T. versicolor (lacT) y M. thermophila (lacM) (Figura 1).Cuando se usó lacT sin un mediador para la decoloración de melanina, el rendimiento de decoloración fue solo del 1 por ciento después de 5 h de reacción. Cuando se usó HOBt como mediador para lacT, el rendimiento de decoloración aumentó ligeramente al 2 por ciento después de 5 h de reacción. El uso de varios mediadores sintéticos, como HOBt, ABTS, VLA y TEMPO, en la oxidación catalizada por lacasa de compuestos fenólicos o no fenólicos mejoró significativamente las velocidades de reacción [10,15]. Cuando el acceso de los compuestos objetivo al sitio activo de la lacasa está limitado por su impedimento estérico, los radicales mediadores formados por la lacasa pueden oxidar eficientemente los compuestos objetivo mediante el mecanismo de transferencia de electrones o de átomos de hidrógeno [12]. HOBt es uno de los mediadores sintéticos más utilizados en LMS debido a su alto potencial redox (1,1 V) [6]. Sin embargo, HOBt no es un buen ingrediente cosmético debido a su potencial toxicidad celular y capacidad para inactivar lacasa. Por lo tanto, seleccionamos siete mediadores naturales, acetosiringona, siringaldehído, ácido p-cumárico, vainillina, ácido vainílico, alcohol vanilílico y acetovanillona, ​​para la reacción de decoloración de melanina por LMS. Curiosamente, todos los mediadores naturales actúan como mediadores más eficientes que HOBt para la decoloración por falta de melanina. Cuando se utilizaron acetosiringona, siringaldehído y ácido p-cumárico, los rendimientos de decoloración fueron del 28 %, 22 % y 18 %, respectivamente, después de 5 h de reacción. Estos resultados demuestran la utilidad de los mediadores naturales para la reacción de decoloración de melanina por LMS. Los mediadores en el LMS son oxidados a radicales mediadores por lacasa, y los radicales mediadores inducen la oxidación y decoloración de la melanina. Cuando se utilizó la falta sin un mediador para la decoloración de melanina durante un tiempo de reacción suficiente, que podría alcanzar el estado de equilibrio, el rendimiento de decoloración fue del 7 por ciento después de 24 h de reacción. Los mediadores naturales, excepto el ácido vainílico, actúan como mediadores más eficientes que el HOBt para la decoloración de la melanina por lacT a las 24 h de reacción. El rendimiento de decoloración después de 24 h de reacción usando ácido vanílico como mediador fue menor que después de 5 h de reacción. Esto puede deberse a la baja estabilidad de la forma de radical oxidado del ácido vanílico. Cuando se utilizaron acetosiringona, siringaldehído y acetovanillona, ​​los rendimientos de decoloración fueron del 34 %, 30 % y 31 %, respectivamente, después de 24 h de reacción. El ácido p-cumárico fue más eficaz para mejorar la velocidad de reacción inicial que la acetovanillona, ​​mientras que la acetovanillona indujo un mayor rendimiento de decoloración en el estado de equilibrio que el ácido p-cumárico.

El efecto del mediador sobre la reacción de decoloración por LMS usando lacM también fue muy similar al obtenido por LMS usando lacT. Cuando se usó encaje sin un mediador para la decoloración de melanina, el rendimiento de decoloración fue solo del 2 por ciento después de 5 h de reacción. HOBt como mediador de lacM no mejoró el rendimiento de decoloración durante las 5 h de reacción. Todos los mediadores naturales, excepto el ácido p-cumárico y la vainillina, actuaron como mediadores eficientes de la decoloración de la melanina por lacM. Cuando se usaron acetosiringona y siringaldehído, los rendimientos de decoloración fueron del 25 por ciento y del 22 por ciento, respectivamente, después de 5 h de reacción. Se usaron ácido p-cumárico y vainillina como mediadores eficientes para cada uno, pero no pudieron mejorar de manera eficiente la tasa de decoloración en LMS usando encaje. Esto puede deberse a la menor especificidad de sustrato de lacM para el ácido p-cumárico y la vainillina. Los rendimientos de decoloración a las 24 h de reacción de lacM con ácido p-cumárico y vainillina fueron similares a los obtenidos por lacT. Esto indica que las formas oxidadas del ácido p-cumárico y la vainillina pueden decolorar eficazmente la melanina, aunque su tasa de oxidación por lacM fue mucho menor que la de lacT. Cuando se usó lacM sin mediador para la decoloración de melanina durante un tiempo de reacción suficiente, el rendimiento de decoloración fue del 5 por ciento después de 24 h de reacción. Los mediadores naturales, excepto el ácido vanílico, también actúan como mediadores más eficientes que el HOBt para la decoloración de la melanina por lacM después de 24 h de reacción. Cuando se usaron acetosiringona, siringaldehído y acetovanillona como mediadores para lacM, los rendimientos de decoloración fueron del 34 %, 28 % y 31 %, respectivamente, después de 24 h de reacción. Cuando se usó ácido vanílico como mediador tanto para lacT como para lacM, mostró el menor rendimiento de decoloración. Esto puede deberse a la baja estabilidad de la forma de radical oxidado del ácido vanílico. Khammuang y Sarnthima informaron que la vainillina y el ácido vainílico podrían usarse como mediadores para la decoloración de la melanina usando lacasa de Lentinus polycarpous [28]. Sin embargo, mostraron una actividad de decoloración mucho menor para la melanina que la acetosiringona cuando se usaron como mediadores para lacT y lace.

Estos resultados indican que los mediadores naturales son más eficientes para la decoloración de melanina por LMS que HOBt. HOBt ha sido considerado como un mediador sintético eficiente para la lacasa debido a su alto potencial redox y al papel catalítico del grupo N OH de HOBt [5]. La eficacia de los mediadores para oxidar los sustratos diana depende en gran medida de la capacidad para formar radicales estables, así como del impedimento estérico causado por los voluminosos sustituyentes alquilo, más que del potencial redox de los mediadores [19,35]. La baja estabilidad del intermedio oxidado de HOBt se ha determinado mediante voltamperometría cíclica [6]. Por lo tanto, el bajo rendimiento de decoloración por LMS usando HOBt puede deberse a la baja estabilidad de HOBt en las condiciones de reacción de lacasa. Aunque el potencial redox del siringaldehído fue menor que el del HOBt, el siringaldehído mostró una estabilidad relativamente mayor que el HOBt [6].

Como se muestra en la Figura 2, los mediadores naturales utilizados en este trabajo tienen varios sustituyentes (p. ej., hidroxilo, metoxi, carboxilo, cetona o aldehído) en diferentes posiciones en el anillo de benceno [12,19]. Los mediadores con dos grupos metoxi (acetosiringona y siringaldehído) mostraron mayores tasas de decoloración que aquellos con un grupo metoxi. La tasa de decoloración obtenida por el ácido p-cumárico sin grupo metoxi fue dependiente del tipo de lacasa. El ácido p-cumárico con lacT mostró una tasa de decoloración más alta que aquellos con un grupo metoxi, mientras que el ácido p-cumárico con lacM mostró la tasa de decoloración más baja en la reacción de 5 h. Fillat et al. también mostró resultados similares para la decoloración de tintas flexográficas por lacasas fúngicas con mediadores naturales [36]. Los mediadores naturales fenólicos (acetosiringona, jeringa de metilo y siringaldehído) con dos sustituyentes metoxi en el anillo fueron oxidados por lacasa más rápido que el ácido p-cumárico sin grupo metoxi. Esto indica que los grupos metoxi juegan un papel más importante como donantes de electrones que el doble enlace de la cadena lateral del ácido p-cumárico. Cuando se compararon los mediadores con un grupo metoxi, el rendimiento de decoloración aumentó en el siguiente orden: acetovainillona > vainillina > alcohol vanilílico > ácido vanílico. La acetovanillona, ​​que tiene un grupo cetona, mostró una mayor tasa de decoloración y rendimiento que los mediadores con grupos aldehído, hidroxilo y carboxilo. La acetosiringona con un grupo cetona también mostró una tasa de decoloración y un rendimiento más altos que el siringaldehído con un grupo aldehído.

En los siguientes experimentos, se seleccionaron acetosiringona, siringaldehído y acetovanillona, ​​que mostraron una alta capacidad de decoloración de la melanina, como mediadores para que LMS decolore la melanina. El efecto del mediador en la reacción de decoloración por LMS se investigó a lo largo del tiempo (Figura S1). La reacción de decoloración usando lacT con acetosiringona, siringaldehído y acetovanillona dio como resultado rendimientos de decoloración del 21 por ciento, 18 por ciento y 1 por ciento después de 1 h de reacción, respectivamente. La reacción de decoloración usando lacM con acetosiringona y siringaldehído dio como resultado rendimientos de decoloración del 19 por ciento y 18 por ciento después de 1 h de reacción, respectivamente. Ambas lacasas mostraron perfiles de reacción similares cuando se utilizó el mismo mediador. La acetosiringona y el siringaldehído mejoraron significativamente la tasa de decoloración durante la reacción inicial. Estos resultados muestran que la acetosiringona y el siringaldehído que contenían grupos dimetoxi eran más eficientes para mejorar la velocidad inicial de decoloración por LMS que la acetovanillona que contenía un grupo metoxi. Fillat et al. también informaron que los grupos metoxi en las estructuras de anillo de los mediadores actúan como aceleradores de la oxidación de los sustratos [36]. Por otro lado, el rendimiento de decoloración después de 24 h de reacción por acetovanillona fue similar al de siringaldehído, aunque la acetovanillona mejoró moderadamente la velocidad de reacción.

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