3.2. Efecto de la concentración de mediador en la decoloración de melanina por LMS

Según estudios relevantes,cistanchees una hierba común que se conoce como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente es el cistanosido, que tiene diversos efectos comoantioxidante, antiinflamatorio, ypromoción de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche yblanqueamiento de la pielradica en el efecto antioxidante de los glucósidos de cistanche. La melanina en la piel humana se produce por la oxidación de la tirosina catalizada por la tirosinasa, y la reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contienecistanósido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, por lo queinhibiendo la producción de melanina.

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Se investigó el efecto de la concentración de mediador en el rendimiento de decoloración por LMS (Figura 3). El LMS que usaba lacT y acetosiringona 100 µM mostró el rendimiento de decoloración más alto, que fue 4.4- veces más alto que sin el mediador. El LMS que usaba lacM y acetosiringona 100 µM mostró el mayor rendimiento de decoloración, que fue 67- veces mayor que sin el mediador. Cuando se usó lacT para LMS, los rendimientos de decoloración con acetosiringona, siringaldehído y acetovanillona aumentaron con el aumento de la concentración y luego alcanzaron un máximo en concentraciones de 100, 50 y 200 µM, respectivamente (Figura 3a). La acetosiringona y el siringaldehído mejoraron más eficientemente el rendimiento de decoloración a una concentración más baja que la acetovanillona. Cuando se usó lace para LMS, el efecto de la concentración del mediador fue muy similar al resultado obtenido con lacT. Los rendimientos de decoloración con acetosiringona, siringaldehído y acetovanillona alcanzaron un máximo en concentraciones de 100, 50 y 200 µM, respectivamente (Figura 3b). Una concentración de mediador de más de 200 µM disminuyó significativamente el rendimiento de decoloración (datos no mostrados). Por lo tanto, se eligió un mediador de 100 µM como la concentración óptima para los siguientes experimentos. Lloret et al. informaron que se debe usar la concentración óptima de mediador porque la lacasa puede ser inactivada por una alta concentración de mediador [6], mientras que Khammuang y Sarnthima informaron que la actividad de decoloración de melanina de LMS usando vainillina y ácido vainílico no se vio significativamente influenciada por altas concentraciones de hasta a 10 mM [28]. La concentración óptima de mediador puede depender del tipo de mediador y del compuesto objetivo de la reacción catalizada por lacasa [5,6]. Cuando el LMS catalizó la degradación de isoproturon, el rendimiento de degradación aumentó con el aumento de las concentraciones de acetosiringona, mientras que las concentraciones de vainillina y siringaldehído no se relacionaron con el rendimiento de degradación [7].

3.3. Citotoxicidad de los mediadores naturales

Para utilizar mediadores naturales como ingredientes cosméticos para blanquear la piel, se investigó la citotoxicidad de los mediadores (acetosiringona, siringaldehído y acetovanillona) utilizando la línea celular de melanoma B16F10. Los mediadores naturales se trataron en las células cultivadas y la viabilidad celular se midió mediante el ensayo NR. Cuando se añadieron mediadores de más de 22 mM a las células cultivadas, redujeron considerablemente la viabilidad celular (Figura 4). Cuando la concentración del mediador fue superior a 5 mM, la viabilidad celular aumentó en el siguiente orden: acetosiringona > siringaldehído > acetovanillona. Además, los mediadores de menos de 1 mM no mostraron ningún efecto inhibidor sobre las células de melanoma B16F10. Estos resultados indican que la concentración óptima de mediador de 0,1 mM utilizada en este trabajo mostró una citotoxicidad insignificante.

3.4. El efecto del pH en la decoloración de melanina por LMS

La figura 5 muestra el efecto del pH en el rendimiento de decoloración de LMS. La falta de un mediador mostró el mayor rendimiento de decoloración a pH 4, y el rendimiento de decoloración disminuyó al aumentar el pH (Figura 5a). Este perfil es similar al efecto del pH sobre la oxidación de ABTS catalizada por lacasa [37]. En general, lacT tiene actividad óptima en condiciones ácidas de menos de pH 5, y su actividad disminuye con un aumento en el pH. A un pH más alto, los aniones de hidróxido se combinan con los cobres T2/T3 de lacT y perturban la transferencia de electrones y provocan una disminución de la actividad catalítica. Sin embargo, el efecto del pH en LMS es más complicado y puede verse influenciado por la actividad y la estabilidad de la lacasa y los mediadores oxidados [1,7]. El rendimiento de decoloración de lacT con acetosiringona aumentó al aumentar el pH hasta 7 (41 por ciento). Los rendimientos óptimos de decoloración de lacT con siringaldehído y acetovanillona fueron del 32 % y 42 %, respectivamente, a pH 6. Aunque la falta mostró una actividad catalítica más baja a pH más alto, la decoloración de melanina aumentó al aumentar el pH. Estos resultados podrían explicarse por la alta actividad y estabilidad de las formas oxidadas de los mediadores naturales a pH alto.

LacM sin mediador mostró el rendimiento de decoloración más alto a pH 6, y lacM mostró un rendimiento de decoloración más bajo en todos los rangos de pH en comparación con el último. El pH óptimo de encaje fue de aproximadamente 6 para la oxidación de ABTS [38]. Por lo tanto, el pH óptimo de lacM sin mediador fue similar al de lacM para la oxidación de ABTS. Cuando los mediadores naturales se usaron con lacM, los rendimientos de decoloración dependieron en gran medida del pH de la reacción (Figura 5b). El rendimiento de decoloración de lacM con mediadores naturales aumentó al aumentar el pH hasta pH 7. Los rendimientos máximos de decoloración de lacM con acetosiringona, siringaldehído y acetovanillona fueron del 40 %, 32 % y 33 %, respectivamente, a pH 7. El alto contenido de melanina La actividad de decoloración a pH neutro hace que el uso de LMS con mediadores naturales sea mejor para la piel porque el rango de pH óptimo es similar al de la piel normal (alrededor de 5,5).

3.5. Estudio cinético de la decoloración de melanina por LMS

Se investigó cuantitativamente un estudio cinético de la decoloración de melanina por LMS con acetosiringona para comprender el efecto potenciador de los mediadores naturales (Tabla 1). El valor de Km de lacT sin un mediador fue 10.6- veces mayor que el de lacT con acetosiringona. Esto significa que la afinidad por la melanina mejoró mucho mediante el uso de un mediador. El valor cat de lacT con el mediador fue 22.6-veces mayor que el de lacT sin mediador. Esto indica que el mediador aumentó significativamente la tasa de decoloración. La constante de especificidad (kcat/Km) de lacT se mejoró 247 veces usando acetosiringona como mediador. Estos resultados muestran claramente que el acceso limitado de la melanina al sitio activo de la lacasa fue superado por la acetosiringona. El valor Km de lacM sin un mediador fue 2.4-veces mayor que el de lacM con acetosiringona. La afinidad de la melanina se puede mejorar utilizando un mediador. Sin embargo, el efecto creciente de la afinidad por la melanina de lacM con acetosiringona fue menor que el de lacT con acetosiringona. El valor catalítico del encaje era aproximadamente el 26 por ciento del de los últimos tiempos. El encaje sin mediador mostró muy baja actividad para la decoloración de melanina. Sin embargo, el valor cat de lacM con el mediador fue 161-veces mayor que el de lacM sin mediador. El mediador aumentó significativamente la tasa de decoloración por lacM. Por lo tanto, la constante de especificidad de encaje se mejoró 334 veces usando acetosiringona como mediador. Estos resultados demuestran la utilidad de la acetosiringona como mediador de las lacasas para la decoloración de la melanina.

3.6. Decoloración de la película de melanina/celulosa por LMS

Se preparó una película de hidrogel compuesto de melanina/celulosa para imitar la melanina en la piel. La película de hidrogel de melanina/celulosa podría prepararse mediante la co-disolución de melanina y celulosa en [Emim][Ac], seguida de regeneración con agua. La película obtenida exhibió un color marrón oscuro transparente. La decoloración de la película de hidrogel de melanina/celulosa se realizó mediante lacM con acetosiringona en tampón de fosfato de ácido cítrico 0,1 M (pH 5,5). El color de la película de melanina/celulosa cambió de marrón oscuro a marrón pálido después de la reacción catalizada por LMS (Figura 6a). Cuando se midió la absorbancia de la película de melanina/celulosa después de la reacción de decoloración en el rango de 400 a 700 nm, la absorbancia de la película de melanina/celulosa disminuyó significativamente en todo el rango de longitud de onda (Figura 6b). La decoloración de la melanina también se confirmó mediante la medición de los valores de color (L*, a* yb*) de la película de melanina/celulosa utilizando un colorímetro. Los valores de ∆L, ∆E, YI y WI se calcularon a partir de los parámetros de color (Tabla 2). Después de la reacción de decoloración de melanina por LMS, el valor L* (luminosidad) de la película de melanina/celulosa aumentó considerablemente, mientras que los valores a* (rojez) y b* (amarillez) disminuyeron ligeramente. El valor de ∆E que representa la diferencia de color entre las muestras fue 31,1. Un valor de ∆E superior a 12 indica que los colores de la película antes y después de la reacción son bastante diferentes entre sí [31]. La amarillez (YI) de la película disminuyó de 209 a 92 después de la reacción de decoloración, mientras que la blancura (WI) aumentó de 16 a 43. Łopusiewicz et al. informaron que el YI de la película de poli(ácido láctico)/melanina aumentó con el aumento del contenido de melanina, mientras que el WI de la película disminuyó [32]. Por lo tanto, los cambios en las propiedades de color explican cuantitativamente la decoloración de la melanina en la película de hidrogel de melanina/celulosa. Estos resultados muestran que LMS puede decolorar de manera eficiente la melanina en un entorno de hidrogel de celulosa.

3.7. Decoloración de la melanina natural producida por las células de melanoma

La melanina natural de la piel humana se divide en eumelanina (de negra a marrón) y feomelanina (de amarilla a roja), mientras que la melanina sintética preparada por la oxidación de la tirosina con peróxido de hidrógeno es un análogo de la eumelanina. Por lo tanto, en este trabajo también se investigó la decoloración de la melanina natural producida por las células de melanoma. La decoloración de la melanina sintética y la melanina natural por LMS con encaje y acetosiringona se comparó midiendo la absorbancia en el rango de 400 a 700 nm (Figura 7). La absorbancia de la melanina sintética disminuyó rápidamente al aumentar el tiempo de reacción en todas las longitudes de onda. Sin embargo, la absorbancia de la melanina natural decolorada mostró un patrón diferente al de la melanina sintética decolorada. La absorbancia de la melanina natural decolorada disminuyó a longitudes de onda superiores a 450 nm, mientras que la absorbancia aumentó a longitudes de onda inferiores a 450 nm. Se requieren más estudios para comprender el aumento en la absorbancia de la melanina natural decolorada.

4. Conclusiones

En este estudio, la decoloración de la melanina se logró utilizando el sistema "O2/laccasa/mediador", ya que la lacasa mostró una baja actividad catalítica para la oxidación directa de la melanina debido a su bajo potencial redox y acceso limitado de la melanina al sitio activo de la lacasa. Se usaron con éxito siete tipos de mediadores naturales para reemplazar los mediadores sintéticos (HOBt) para la decoloración de melanina por LMS usando lacT y lace. Entre los mediadores naturales probados, la acetosiringona y el siringaldehído, que contienen dos grupos metoxi, mostraron altas tasas de decoloración y rendimiento. La acetovanillona que contiene un grupo metoxi y un grupo cetona también mostró un alto rendimiento de decoloración en el estado de equilibrio. El LMS con mediadores naturales mostró una alta actividad de decoloración al pH de la piel normal, y la citotoxicidad de los mediadores naturales fue muy baja. Un estudio cinético de LMS usando acetosiringona para la decoloración de melanina mostró que la acetosiringona superó de manera eficiente las limitaciones de lacT y lacM al aumentar la afinidad por la melanina y la actividad de decoloración. LMS con acetosiringona decoloró la melanina presente en la película de hidrogel de celulosa, que imita la piel. Además, LMS con acetosiringona podría decolorar no solo los análogos de eumelanina sintética preparados por oxidación de tirosina, sino también la melanina natural producida por las células de melanoma. Por lo tanto, el LMS que usa mediadores naturales puede usarse como un agente efectivo para blanquear la piel en la industria cosmética.

Materiales complementarios:Los siguientes están disponibles en línea, Figura S1: La decoloración de melanina por LMS usando lacasa de T. versicolor y M. thermophila, Figura S2: La tasa inicial para la reacción de decoloración de melanina por lacasa de T. versicolor y M. thermophila.

Contribuciones de autor:Conceptualización, SP, DJ y SHL; Curación de datos, SHL; Análisis formal, SP; Adquisición de fondos, SHL; Investigación, SP, DJ y HD; Metodología, SP, DJ y HD; Administración de proyectos, SHL; Recursos, SHL; Software, JY, DL y SH; Supervisión, SHL; Validación, JY, DL, SH y SHL; Visualización, JY, DL y SH; Redacción: borrador original, SP y DJ; Redacción: revisión y edición, SHL Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos:Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Konkuk en 2018.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:No aplica.

Declaración de consentimiento informado:No aplica.

Declaración de disponibilidad de datos:No aplica.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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