Caracterización de nuevos aislados de probióticos a partir de dátiles Ajwa fermentados de Medina y su potencial antiinflamatorio

May 29, 2023

Abstracto:Se analizó un total de 20 cepas de Lactobacillus aisladas de dátiles fermentados para determinar su potencial probiótico comparando su estabilidad de pH, resistencia al pH bajo y capacidad para tolerar las sales biliares. De 20 cepas, 3 cepas denominadas Lactobacillus pentosus KAU001, Lactiplantibacillus pentosus KAU002 y Lactiplantibacillus plantarum KAU003 tenían una alta tolerancia a los ácidos y las sales biliares y la capacidad de adherirse a la pared intestinal. Además, los tres aislados fueron probados por sus propiedades antioxidantes, inhibidoras de la glucosidasa, reductoras del colesterol y antiinflamatorias. Entre ellos, las cepas KAU001 y KAU002 inhibieron la -glucosidasa, redujeron el nivel de colesterol, inhibieron la producción de óxido nítrico y mostraron una mayor capacidad antioxidante que fue significativamente mejor que la cepa KAU003. Ambas cepas también inhibieron significativamente la liberación de mediadores inflamatorios como TNF-, IL-6 e IL-10 inducida por LPS en macrófagos RAW 264.7 (p < 0,001). Los resultados indicaron que KAU001 y KAU002 tienen el mayor potencial probiótico, modulando potencialmente la salud metabólica y reduciendo las citocinas proinflamatorias en respuesta a las reacciones alérgicas.

El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y ​​aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y puede eliminar las especies reactivas de oxígeno y prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres, y también tiene un buen efecto de reparación sobre el daño del anión de radicales libres de timina.

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Palabras clave:Ajwa; Medina; probióticos; inflamación; alimentos

1. Introducción

Los probióticos son suplementos dietéticos que contienen cepas microbianas vivas capaces de colonizar el tracto gastrointestinal (permanente o transitoriamente) para mejorar la salud humana [1,2]. Los probióticos son beneficiosos cuando se altera la flora nativa del tracto gastrointestinal; los probióticos suplementados exógenamente podrían colonizar temporalmente el tracto y estabilizar el equilibrio de la microflora que finalmente restaura la función fisiológica vital [1–5]. El término "probióticos" generalmente se limita a las especies pertenecientes al género de bacterias del ácido láctico (BAL), como Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum, como probióticos importantes debido a su cepa- propiedades específicas que son beneficiosas para la salud [6-15]. La investigación actual en probióticos indica que las especies bacterianas deben cumplir requisitos específicos, incluida la resistencia a altas concentraciones de ácido y bilis, adhesión y establecimiento en el epitelio intestinal, producción de compuestos antimicrobianos y modulación de las respuestas inmunitarias [1,9,10,14,16 ,17].

Conocidos por su capacidad para secretar diversas sustancias antimicrobianas, incluidas las bacteriocinas, los probióticos facilitan la respuesta inmunitaria a través de la secreción de IgA para luchar contra patógenos potenciales, reducir las reacciones alérgicas, activar la barrera mucosa del colon, aumentar la estabilidad de la microflora comensal y disminuir la adhesión de patógenos, así como promover la recuperación [4,5,18–20]. Las bacteriocinas producidas por L. gasseri son las más conocidas de las cuales el gas sericina-A producido por L. gasseri LA39 se aísla de las heces de los lactantes [21]. Se informa que Verdenelli et al. aislaron L. rhamnosus IMC 501 de la materia fecal de un anciano italiano, exhibieron una alta adhesión al tracto gastrointestinal y desalentaron el crecimiento de patógenos, particularmente Candida albicans [22]. También se descubrió que otro probiótico aislado de koumiss, L. casei Zhang, tiene alta resistencia a los ácidos y las sales biliares, persistencia gastrointestinal, actividad antimicrobiana, así como propiedades reductoras del colesterol [23]. Debido al amplio valor comercial y los beneficios para la salud que aportan los probióticos, el aislamiento y la caracterización continuos de nuevas cepas se han convertido en una tendencia emergente ya que estas bacterias beneficiosas son actualmente los bioterapéuticos multifacéticos más potentes [1,9,10,14,18,24 –31].

Este estudio tuvo como objetivo evaluar el potencial probiótico de 20 cepas de Lactobacillus aisladas de dátiles fermentados, junto con su resistencia a altas concentraciones de ácido y bilis. Además, los aislados seleccionados fueron investigados por sus diversas propiedades funcionales, como la adhesión a la pared intestinal, la antioxidación, la inhibición de la actividad de la glucosidasa, la reducción del colesterol y la antiinflamación.

2. Materiales y métodos

2.1. Aislamiento e identificación de las cepas de Lactobacillus

Se aislaron un total de 20 cepas de bacterias del ácido láctico a partir de dátiles Ajwa fermentados usando agar BCP (bromocresol púrpura lactosa). Las cepas se cultivaron más en agar MRS (de Man, Rogosa y Sharpe), y las cepas de cultivo puro se almacenaron en glicerol al 60 por ciento (v/v) a -80 ◦C [32]. Antes de cada experimento, los cultivos se activaron cultivándolos dos veces en caldo MRS antes de su uso. El sobrenadante libre de células se preparó cultivando cada aislado de LAB en caldo MRS a 37 ◦C durante 24 h, seguido de centrifugación (10,000x g durante 10 min) y esterilización por filtración [7,8,18]. Las cepas sensibles a los antibióticos se enviaron para la secuenciación del gen 16S rRNA para su identificación [8].

2.2. Propiedades probióticas de aislamientos seleccionados en el modelo del tracto gastrointestinal

Jugo gástrico de supervivencia y sales biliares:

La resistencia de aislamientos de BAL seleccionados al jugo gástrico artificial y las sales biliares se probó según nuestro protocolo descrito anteriormente [18]. Brevemente, se preparó un inóculo con una concentración celular de 2,5 × 108 CFU/mL y se inoculó en jugo gástrico artificial y sales biliares. Para el jugo gástrico, la MRS se complementó con pepsina (1000 unidades/mL) a un pH final de 3. De manera similar, se preparó bilis artificial agregando pancreatina al 5 por ciento a la MRS con agalla de buey al 1 por ciento y el pH final se ajustó a 7.

2.3. Adhesión a HT-29 Células Intestinales 

Se usaron células HT-29 para determinar la capacidad de los aislados de LAB seleccionados para adherirse al intestino usando el método descrito por Kim et al. [33]. El número de células viables se determinó utilizando el método de la placa de extensión en agar MRS [34].

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2.4. Estudio In Vitro de las Propiedades Funcionales de las Cepas de Lactobacillus

Determinación de la actividad antioxidante:

Las actividades antioxidantes de aislados de BAL seleccionados se determinaron mediante la estimación de la capacidad de captación de radicales utilizando el ensayo 2,20 -casino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS), el ensayo férrico -reducción del poder antioxidante (FRAP) y el ensayo de 2,2-difenil- 1-picrilhidrazilo (DPPH). Los ensayos ABTS, FRAP y DPPH se realizaron siguiendo el método descrito en otro lugar [14,35–37].

2.5. Inhibición de la n -glucosidasa 

La inhibición de -GLU se realizó de acuerdo con el método descrito anteriormente [14, 32] usando -GLU de Saccharomyces cerevisiae (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) con algunas modificaciones [32]. Brevemente, se mezclaron 25 µL -GLU (0.17 U/mL) y 50 µL de tampón de fosfato de potasio con 10 µL de la muestra de prueba. PBS y MRS se usaron como controles. Luego, se añadió 5 mM de pNPG seguido de incubación a 37 ◦C durante 30 min. Finalmente, se detuvo la reacción enzimática añadiendo 100 µL de Na2CO3 0,2 M. La absorbancia se examinó utilizando una microplaca a 405 nm. El porcentaje de inhibición de -GLU para cada cepa se calculó siguiendo la Ecuación (1).

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2.6. Determinación de la actividad reductora del colesterol

La actividad reductora del colesterol se evaluó usando el método modificado descrito por Oh et al. [35]. El colesterol residual se determinó usando el kit de ensayo de colesterol total siguiendo el protocolo del fabricante. Para servir como control negativo, también se analizó el colesterol en el caldo estéril sin inocular.

2.7. Actividad antiinflamatoria de aislados de LAB en células macrófagas RAW 264.7

Se adquirió una línea celular de macrófagos murinos, RAW 264.7, del Korean Cell Line Bank (Seúl, Corea) y se cultivó en FBS al 10 % con penicilina al 1 % y estreptomicina a 100 U/mL y 100 µg/L, respectivamente, a 37 ◦ C con 5 por ciento de CO2 en una atmósfera humidificada. Las células se subcultivaron y se sembraron en placas con una confluencia del 80 al 90 por ciento. Tratamos células RAW 264.7 (1 × 106 células/mL) con dos concentraciones de LAB (7 u 8 Log CFU/mL) en medio DMEM sin antibióticos durante 12 h antes de exponer las células a 100 ng/mL LPS durante 18 h para evaluar su actividad antiinflamatoria. Se utilizó un medio sin antibióticos para disolver las muestras bacterianas, y luego se añadió directamente al medio de cultivo celular. Utilizando la reacción de Griess, se midió el NO en células inducidas por LPS. Se utilizó una PCR cuantitativa en tiempo real para determinar la expresión de ARNm de TNF-, IL-6 e IL-10 liberados.

2.8. Análisis estadístico 

Sobre la base de experimentos independientes realizados por triplicado, todos los datos se expresan como medias más desviaciones estándar (DE). Un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) analizó las diferencias estadísticas entre múltiples grupos utilizando la prueba de rango múltiple de Duncan. La prueba t de Student de una cola no pareada analizó las diferencias estadísticas entre los dos grupos. Los valores de p < 0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

3. Resultados

3.1. Detección y aislamiento de cepas bacterianas de dátiles Ajwa fermentados

Los dátiles Ajwa se adquirieron en un mercado local en Medina, Arabia Saudita. Las semillas se extrajeron y se molieron hasta convertirlas en polvo. Luego, el polvo de semillas se mezcló con los dátiles sin semillas y agua estéril a una concentración final del 5 por ciento y luego se almacenó en frascos de vidrio. Los recipientes se mantuvieron a temperatura ambiente durante 48 h, seguido de incubación a 10 ◦C durante 10 días para completar la fermentación. Se aislaron un total de 20 cepas de bacterias del ácido láctico (BAL) de los dátiles fermentados usando agar BCP de acuerdo con el método informado anteriormente [7,18]. Después de la selección preliminar, las tres cepas de LAB seleccionadas se identificaron como Lactobacillus pentosus KAU001, Lactiplantibacillus pentoses KAU002 y Lactiplantibacillus plantarum KAU003, y las secuencias se enviaron a GenBank con los números de acceso ON514175, ON514180 y ON514177, respectivamente.

3.2. Propiedades probióticas de las cepas de Lactobacillus en el modelo del tracto gastrointestinal

Los probióticos deben estar vivos en el tracto gastrointestinal para ejercer sus efectos beneficiosos. Por lo tanto, como suplemento, primero deben sobrevivir el paso a través de las zonas ricas en sales biliares y ricas en ácido (pH bajo) en el tracto gastrointestinal antes de colonizarlo. En los seres humanos y la mayoría de los animales, el hígado sintetiza ácidos biliares a partir del colesterol, los almacena en la vesícula biliar y los secreta en el intestino delgado después de una comida grasosa. Para calificar como probióticos, una nueva bacteria de ácido láctico debe ser capaz de soportar altas sales biliares y bajo pH en el intestino. Oxgall en polvo, un producto derivado de la bilis bovina, se ha utilizado comúnmente en lugar de la bilis humana para medir las capacidades potenciales de tolerancia a la bilis probiótica debido a su similitud con la composición de la bilis humana. Los tres aislamientos de Lactobacillus mostraron una alta tolerancia a un pH ácido hostil de 3.0, con una tasa de supervivencia del 92 % y 97 % en KAU002 y KAU003, respectivamente (Figura 1). De manera similar, a una concentración del 1 por ciento de sales biliares, los aislamientos exhibieron una tasa de supervivencia que varió del 91 por ciento al 97,4 por ciento después de la incubación durante 6 horas.

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Se probó la adherencia de los tres aislados a las células de adenocarcinoma de colon humano HT-29 como requisito previo para la colonización en el intestino humano. Las cepas KAU001 y KAU002 exhibieron capacidades adhesivas más altas (superando el 80 por ciento) en células de colon humano. Propiedades tales como una mayor tolerancia al pH ácido, capacidad de supervivencia en concentraciones más altas de sales biliares y una mayor tasa de adhesión a las células del colon califican a los aislados como posibles cepas bacterianas de ácido láctico probióticas.

3.3. Actividades antiinflamatorias de las cepas de Lactobacillus

Para determinar las propiedades antiinflamatorias, se utilizó un antígeno común, los lipopolisacáridos (LPS), para estimular las células de macrófagos RAW 264.7, y estas células se inocularon con aislamientos de Lactobacillus. Los ensayos de MTT no mostraron ningún efecto citotóxico de las cepas de lactobacillus en las células RAW 264.7 (datos no mostrados). Los aislados bacterianos (KAU001 y KAU002) en dos concentraciones, 107 y 108 CFU/mL, inhibieron significativamente la producción de óxido nítrico (NO) en comparación con las células de control estimuladas con LPS (Figura 2). Además, la cantidad de expresión de citocinas proinflamatorias de TNF-, IL-6 e IL-10 en RAW 264.7 estimulado con LPS se cuantificó mediante qRT-PCR. Las cepas de Lactobacillus KAU001, KAU002 y KAU003 redujeron significativamente la expresión de citoquinas proinflamatorias de una manera dependiente de la concentración (Figura 3).

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4. Discusión

Se sabe que los probióticos, compuestos principalmente por bacterias del ácido láctico, brindan beneficios específicos para la salud del huésped a través de la colonización del tracto gastrointestinal [38]. Para ejercer tales efectos bioterapéuticos, las cepas probióticas deben sobrevivir al paso por el tracto gastrointestinal y colonizar el intestino delgado y el colon durante un período suficiente [18,38]. Las cepas como KAU001 y KAU003 fueron las más tolerantes a los ácidos y la bilis, y su adhesión a las células HT-29 fue significativamente mayor.

Algunos aislamientos de LAB del ciego de pollo muestran una supervivencia limitada del 60 al 80 por ciento después de haber estado expuestos a un ambiente ácido con un pH de 2 a 2,5 durante 3 h [2,4,39–41]. Por el contrario, en este estudio se observó una tasa de supervivencia tan alta como 92,75~97,26 por ciento. El mecanismo de defensa humano natural contra los patógenos en el tracto intestinal es a través de la producción de ácido clorhídrico que reduce el pH del estómago. Por lo tanto, se cree que las cepas con tolerancia a los ácidos sobreviven al tránsito por el tracto gastrointestinal superior. Mientras que en el intestino delgado y el colon, una gran cantidad de sales biliares también es una barrera protectora para evitar la adhesión de bacterias patógenas, por lo que la supervivencia en la bilis se considera un factor crucial para que los probióticos colonicen el intestino [17]. El mecanismo de los probióticos para contrarrestar el efecto dañino de las sales biliares es a través de la producción de la enzima hidrolasa de sales biliares (BSH), que puede descomponer las sales biliares conjugadas, reduciendo así la toxicidad [23,40]. Otro requisito importante para las cepas probióticas es la capacidad de adherirse a las células epiteliales intestinales, lo que les permite colonizar el intestino, competir con los patógenos y conferir beneficios al huésped [42,43]. Entre todas las cepas probadas, KAU001, KAU002 y KAU003 demostraron una alta capacidad para sobrevivir en el tracto gastrointestinal y la adherencia a las células del colon, lo que las convierte en posibles candidatas a probióticos.

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Se encontró que KAU001 y KAU002 tienen un potencial antioxidante significativo, particularmente KAU001. Estos resultados respaldan que ambas cepas de LAB son altamente efectivas en la eliminación de radicales peroxilo. Los probióticos con alto potencial antioxidante pueden ayudar a reducir el daño oxidativo causado por los radicales libres, promoviendo así beneficios para la salud, como retrasar el envejecimiento celular, ya que el proceso de envejecimiento está altamente asociado con el estrés oxidativo acumulado. Además, KAU001 y KAU002 inhibieron la actividad de la -glucosidasa, que es uno de los factores determinantes importantes en enfermedades metabólicas como la diabetes y la obesidad.

La reducción de -glucosidasa podría indicar la capacidad de estas cepas para reducir la absorción intestinal de azúcar y, por lo tanto, reducir potencialmente el riesgo de diabetes. Además, ambas cepas también redujeron significativamente los niveles de colesterol, lo que puede ayudar a reducir el riesgo de niveles altos de colesterol y enfermedades cardiovasculares. Se postuló que la BSH producida por las cepas LAB es responsable de las propiedades anticolesterolemiantes a través de la desconjugación de las sales biliares. Las sales biliares desconjugadas se reabsorben menos en los intestinos y se excretan a través de las heces, por lo que la sustitución de nuevas sales biliares del colesterol reducirá el nivel de colesterol sérico [30].

En respuesta a la estimulación con LPS en los macrófagos RAW 264.7, las células produjeron NO como molécula de defensa tóxica para combatir los patógenos, y esto condujo a la inflamación. El tratamiento con cepas de Lactobacillus redujo la producción de NO en macrófagos estimulados por antígeno, en paralelo con el aumento de las concentraciones de Lactobacillus. Coherentemente, los niveles de expresión de TNF-, IL-6 e IL-10 también disminuyeron con el aumento de la concentración de KAU001 y KAU002, lo que justifica las propiedades antiinflamatorias de estas cepas. En una reacción alérgica estimulada por un antígeno, como la rinitis alérgica y la dermatitis atópica, la gravedad de la enfermedad puede aumentar con el tiempo con la exposición repetida y puede causar una inflamación descontrolada [41]. Por lo general, los medicamentos antiinflamatorios como los esteroides se usan para controlar estas enfermedades; sin embargo, los medicamentos se acompañan de muchos efectos secundarios. Los probióticos son una de las alternativas más seguras para contrarrestar estos problemas de hipersensibilidad ya que las bacterias beneficiosas tienen excelentes propiedades antiinflamatorias.

5. Conclusiones

En resumen, las cepas de Lactobacillus aisladas de los dátiles fermentados mostraron que las tres cepas, KAU001, KAU002 y KAU003 podían sobrevivir en el tracto GI y adherirse a la mucosa intestinal. Las cepas KAU001 y KAU002 fueron probióticos potenciales con un importante efecto promotor de la salud en el aspecto de la salud metabólica y las reacciones de hipersensibilidad debido a su capacidad para ejercer un efecto antioxidante, una inhibición de la actividad de la -glucosidasa y un efecto reductor del colesterol y anti -efecto inflamatorio. Estas cepas de origen vegetal deben considerarse para una mayor caracterización y comercialización en la industria alimentaria y láctea.

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Contribuciones de autor:Conceptualización, IAR; metodología, AAM, AF y HMA; software, S.-HY e IAR; validación, Y.-HP, IAR e Y.-YH; análisis formal, AAM; investigación, AAM; recursos, AF, HMA, S.-HY, Y.-HP e IAR; curación de datos, AAM; redacción—preparación del borrador original, AAM, IAR e Y.-YH; redacción—revisión y edición, Y.-HP, Y.-YH e IAR; visualización, Y.-HP; supervisión, IAR; administración de proyectos, AAM e IAR; adquisición de fondos, AAM y HMA Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada del manuscrito.

Fondos: Este proyecto fue financiado por el Decanato de Investigación Científica (DSR), Universidad Rey Abdulaziz, Jeddah, bajo la subvención No. (DF-552-130-1441). Los autores, por lo tanto, agradecen el apoyo técnico y financiero de DSR.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:No aplica.

Declaración de consentimiento informado:No aplica.

Declaración de disponibilidad de datos:Los datos generados se citan en el manuscrito.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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