Caracterización del riesgo de rechazo renal previo y posterior al trasplante mediante la secuenciación del repertorio inmunitario de células B

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El estudio del repertorio inmunitario en el contexto del trasplante de órganos proporciona información importante sobre cómo la inmunidad adaptativa puede contribuir y modular el rechazo del injerto. Aquí caracterizamos el repertorio inmunológico de sangre periférica de individuos antes y despuésriñóntrasplante utilizando la secuenciación del receptor de células B en un estudio clínico longitudinal. Las personas que desarrollan rechazo después del trasplante tienen un repertorio inmunitario más diverso antes del trasplante, lo que sugiere una predisposición al riesgo de rechazo posterior al trasplante. Además, durante 2 años de seguimiento, los pacientes que desarrollan rechazo muestran un conjunto específico de clones expandidos que persisten después del rechazo. Si bien hay una reducción general de la diversidad de células B periféricas, probablemente debido a una mayor exposición general a la inmunosupresión en esta cohorte, la detección del uso del gen IGHV específico en todos los pacientes que rechazan respalda que un conjunto común de antígenos inmunogénicos puede impulsar el rechazo posterior al trasplante. Nuestros hallazgos pueden tener implicaciones clínicas para la predicción y el manejo clínico del rechazo del trasplante renal.

RiñónEl trasplante es el tratamiento preferido de la enfermedad renal en etapa terminal (ESRD) y crónicariñónenfermedad. A pesar de que ha habido mejoras significativas en las tecnologías y la coincidencia de tejidos basada en pruebas de histocompatibilidad para antígenos leucocitarios humanos (HLA) del donante/receptor, la predicción del resultado del injerto sigue siendo un problema sin resolver. El desajuste de tejido medido en otros loci23 menores que no son HLA también puede conducir a una lesión aloinmune con rechazo agudo y crónico, lo que resulta en malos resultados del injerto a largo plazo4. Además, alrededor del 50 por ciento deriñónlos aloinjertos, sin discrepancias importantes de HLA, aún se pierden dentro de los 10 años posteriores al trasplante². Anteriormente hemos planteado la hipótesis de que los loci no HLA pueden influir en la respuesta inmunitaria del receptor contra suriñóndonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 anticuerpos diferentes0, lo que les permite reconocer una amplia gama de antígenos extraños. Los BCR humanos o Ig consisten en dos cadenas pesadas idénticas (I) formadas por cinco isotipos: IgM, IgD, IgA, IgE e IgG, y dos cadenas ligeras. El anticuerpo intacto contiene un dominio variable y uno constante. La unión del antígeno se produce en el dominio variable, que se genera mediante la recombinación de un conjunto de segmentos génicos variables (V), de diversidad (D) y de unión (J) que forman el repertorio inmunitario de las células B, y su diversidad se concentra principalmente en el región determinante complementaria 3 (CDR3). Durante el proceso de maduración por afinidad, se produce una hipermutación somática (SHM) en la región variable. Una potente respuesta inmunitaria adaptativa depende de la expansión de los clones de células B y de un proceso denominado maduración por afinidad, durante el cual se introducen mutaciones somáticas en los reordenamientos del gen Ig y se seleccionan las células B con mayor afinidad por un antígeno dado.

El estudio del repertorio inmunológico en el trasplante de órganos es crucial para comprender qué desencadena y mantiene el proceso de rechazo y cómo puede acelerar el camino hacia el fracaso del injerto. Con los avances de la secuenciación de próxima generación y los enfoques computacionales robustos, podemos estudiar la región VDJ con gran detalle12. Hasta la fecha, el análisis del repertorio inmunitario de células T enriñónel trasplante se ha llevado a cabo en un número muy limitado de pacientesl3-15, y aunque BCRSeq se ha aplicado a otras enfermedades y respuestas inmunitarias humanas, como la esclerosis múltiple6, la vacuna contra la gripel7o los trastornos de inmunodeficiencia8, faltan estudios en trasplante rechazo. en unriñóntrasplante, BCRSeq solo se ha realizado en el contexto de tolerancia, HLA sensibilizadoriñóncandidatos a trasplante sometidos a terapia de desensibilización20 e infiltración de células B comparando la expansión clonal en sangre e injerto2l. Otra aplicación de BCRSeq en el trasplante se publicó previamente en una pequeña cohorte de 12 receptores de trasplante de corazón.

Reconociendo la importancia del brazo humoral de la respuesta inmunitaria en el rechazo tardío del trasplante y el fracaso crónico del aloinjerto, caracterizamos el repertorio inmunitario de la sangre periférica utilizando BCRSeq en un estudio longitudinal prospectivo. Encontramos que la diversidad del repertorio inmunitario antes del trasplante es mayor en aquellos individuos que rechazan elriñónmostrando también la expansión de ciertos clones y genes IGHV a lo largo de los 24 meses de seguimiento. Estos resultados pueden ayudar a predecir el riesgo de rechazo antes del injerto y pueden tener implicaciones clínicas en la detección de antígenos particulares que provocan el rechazo.

Cistanche es bueno para la función renal

Resultados

Materias de estudio. Realizamos BCRSeq en 83 muestras de sangre periférica de 27 pacientes únicos y ejecutamos el proceso analítico que se muestra en la figura 1. En este estudio se consideraron tres grupos de fenotipos clínicos, definidos por lecturas ciegas de patología central de biopsias seriadas de aloinjertos puntuadas según los criterios de Banff23,24 y la puntuación del índice de daño crónico del aloinjerto (CADI): No progresores (NP; n=10) tenían una puntuación CADI no incremental baja sin rechazo agudo, los progresores sin rechazo (PNR; n=10) ​​tenían una puntuación CADI incremental durante 2 años sin rechazo, y los progresores con rechazo (PR; n=7) tenían Puntuaciones CADI altas incrementales a lo largo de 2 años con episodios de rechazo. Demografía, causas deriñónel fracaso y el uso de inmunosupresores se proporciona en la Tabla 1. Es importante resaltar algunas características de estos pacientes. El estudio principal en el que se inscribieron estos pacientes tuvo una tasa general baja (17 por ciento) de rechazo agudo confirmado por biopsia (promedio{min, max}=12 {6,24}meses de tiempo de rechazo). Todos estos pacientes tenían un riesgo inmunológico bajo de rechazo (estado de sensibilización de anticuerpos reactivos del panel máximo<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">

Secuenciación del repertorio inmunitario de células B. BCRSeq se realizó en muestras de ADN genómico (ADNg) extraídas de coágulos de sangre en 81 muestras de 27riñónreceptores de trasplantes en tres momentos (0, 6, 24 meses). La secuenciación obtuvo un número total de 327 703 lecturas (media de 4045/muestra) después del control de calidad (consulte la sección de métodos). Para la validación de los resultados y una mayor evaluación de cada isotipo, extrajimos adicionalmente ARN de PBMC coincidentes que estaban disponibles para 55 muestras, recolectadas al mismo tiempo que el coágulo de sangre, y realizamos una secuenciación complementaria de ADN (ADNc) a mayor profundidad obteniendo 1 773 330 lecturas para IgD (media 31 667/muestra), 1 708 227 lecturas para IgM (media 30 504/muestra), 973 444 lecturas para IgA (media 17 383/muestra), 139 7345 lecturas para IgG (media 24 953/muestra) y 29,{{27 }} lee IgE (media 5178/muestra) (Fig. 1 complementaria). Las bibliotecas para cada isotipo se amplificaron por separado y luego se agruparon para la secuenciación; por lo tanto, el análisis comparativo de isotipos cruzados no es factible.

Como se muestra en la Fig. 1b, definimos un clon como un grupo de células que descienden de una molécula ancestro común que tiene el mismo segmento IGHV e IGHJ, la misma longitud de CDR3 y un 90 por ciento de identidad de nucleótidos entre CDR3 como se definió previamente en estudios de B adaptativo -respuestas celulares'8. Esta definición permite estudiar la diversidad, los conos compartidos o comunes y la expansión clonal en el contexto de la aloinmunidad enriñóntrasplantes La cantidad de conos únicos por individuo en cada punto de tiempo se muestra como un gráfico de barras en el material complementario (Fig. 1 complementaria). Para la rigurosidad del análisis de datos, descontamos muestras con<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">riñóntrasplante, caracterizado por la proliferación de Epstein Barr

Fig. 1 Proyecto general del estudio.a Representación esquemática de la estructura del anticuerpo y el proceso de recombinación de VDJ responsable de la diversidad producida en el repertorio inmunitario. b Clon de células B definido como células de un ancestro común y c proceso analítico del estudio: células B secuenciación para gDNA y cDNA, análisis de diversidad considerando el número de clones (riqueza) y la frecuencia de cada clon (entropía de Shannon), análisis de redes y análisis clonal y de genes IGHV

Células B infectadas por el virus (EBV). Observamos un mayor número de clones en el tiempo 6 en este paciente, con una menor diversidad clonal antesriñóntrasplante y a los 24 meses del trasplante renal. Dado que las bibliotecas se amplificaron a partir de una cantidad invariable de plantilla, una fracción más alta de células B en la sangre puede haber resultado en una mayor cantidad de clonotipos representados en los productos secuenciados. Debido al proceso patológico distintivo y único de este paciente, esta muestra se excluyó de futuros análisis.

La diversidad de células B antes del trasplante está asociada con el rechazo. Como se muestra en la Fig. 1c, examinamos la diversidad del repertorio inmunitario de células B teniendo en cuenta la riqueza de especies (número de clones únicos) y la entropía de Shannon (ecuación (1) de los métodos) en puntos de tiempo y resultados clínicos utilizando un modelo de regresión lineal considerando el número de clones o entropía como variable dependiente y resultado clínico o SHM como variable factor independiente. El repertorio antesriñónel trasplante en PR fue significativamente más diverso que en el NP (riqueza: valor P=0.005, entropía: valor P=0.01) con la misma tendencia persistente a los 6 meses despuésriñóntrasplante (riqueza: valor P=0.02, entropía: valor P=0.02), y sin diferencias de grupo distinguibles a los 2 años posteriores al trasplante (Fig. 2a y Fig. 2 complementaria). Los datos de secuenciación de cDNA posteriores al trasplante mostraron la misma tendencia en una mayor diversidad de repertorio a los 6 meses después del trasplante, predominantemente para los isotipos de IgD (riqueza: valor P=0.02, entropía: valor P=0. 03) (Fig. 2b y Fig. 2 complementaria). No hubo efectos de confusión en los datos de diversas variables demográficas y clínicas, como la edad del receptor, el sexo, la raza, la fuente del donante, el tipo de inmunosupresión, la incompatibilidad de HLA y la causa de la insuficiencia renal. Dado que la respuesta de las células B de un niño de 1-años (la edad mínima en los datos) y de 19-años (la edad máxima en los datos) puede ser muy diferente, realizamos una prueba de sensibilidad el análisis excluyó a estos dos pacientes y los resultados siguieron siendo significativos (NP frente a PR en el tiempo 0: riqueza: valor de P=0,01, entropía: valor de P=0,03). En otra medida de la diversidad del repertorio inmunitario, evaluamos la SHM, definida como la frecuencia de mutaciones en cada segmento del gen V, y encontramos una tendencia a un mayor número de SHM para PR antes del trasplante, y una tendencia a una mayor SHM en el isotipo IgD. en PR a los 6 meses postrasplante (P-valor=0.06).

La diversidad de células B cambia a lo largo del tiempo según el resultado clínico. Para averiguar si la diversidad del repertorio inmunitario cambia a lo largo del tiempo según el resultado clínico, modelamos los datos longitudinales utilizando modelos lineales de efectos mixtos considerando la interacción entre el resultado clínico y el tiempo. Encontramos que NP y PR se comportaron de manera diferente a lo largo del tiempo después del trasplante, mostrando un aumento en la diversidad en NP y una disminución en la diversidad en PR, mientras que para PNR la diversidad permaneció invariable a lo largo del tiempo. Esto se observó para gDNA (riqueza: valor P=0.007, entropía: valor P=0.001, Fig. 3a) y todos los isotipos para cDNA, siendo las diferencias más significativas en entropía para isotipos IgM e IgD (IgA: valor P=0.07, IgD: valor P=0.02, IgG: valor P=0.05, IgM: valor P=0.04, Figura 3b). Los gráficos de riqueza con los valores P correspondientes se muestran en la Fig. 3 complementaria. Como se observa en los gráficos, un individuo tiene una muestra adicional a los 32 meses, lo que podría sesgar los resultados, por lo que se realizó un análisis de sensibilidad excluyendo esta muestra de el análisis y observando resultados similares excepto para los isotipos IgG e IgM donde se pierde la significación (gDNA-entropía: valor P=0.004. cDNA- entropía: IgA: valor P=0.1 , IgD: valor P=0.05, IgG: valor P=0.08, IgM: valor P=0.1).

Las medidas de diversidad pueden verse afectadas por el muestreo biológico y técnico. La diversidad de una muestra puede diferir notablemente de la diversidad general de un repertorio, ya que solo se representa una fracción de miles de millones de células, lo que se conoce como el problema de las especies faltantes. El muestreo técnico puede existir porque cada muestra puede variar en la profundidad de secuenciación y cierto grado de errores experimentales. Para abordar el problema de las especies faltantes, utilizamos la herramienta Recon (reconstrucción de clones estimados a partir de números observados)29, que estima la distribución general del tamaño de los clones. Recon genera estimaciones precisas y sólidas de un conjunto de medidas de diversidad, incluidas la riqueza y la entropía, lo que permite comparaciones sólidas de diversidad entre individuos. Para lidiar con la profundidad de secuenciación y cierto grado de errores experimentales, realizamos una estrategia de reducción de muestreo; una estrategia muy bien utilizada en el análisis del repertorio inmunológico11,17,30. En el análisis Recon (Figura complementaria S4: A–E), tanto la riqueza como la diversidad se replicaron para los datos de gDNA. En los datos de ADNc, el isotipo IgD del tiempo 6 muestra la tendencia pero no alcanzó significación aunque se replicaron los resultados longitudinales para los isotipos IgA, IgD e IgG. En el análisis de reducción de muestreo (Figura complementaria S4: F–J), todo se replica, pero el tiempo es 0 para los datos de ADNg. Esto podría ser una consecuencia de la restricción que la reducción de muestreo

Fig. 2 Gráficos de violín que muestran el número de clones (riqueza) en los tres resultados clínicos. varios clones en los tiempos 0, 6 y 24 de muestras de ADNg. b Número de clones en el tiempo 6 para el isotipo IgD de muestras de ADNc. Los valores de P se obtienen del ajuste de un modelo de regresión lineal considerando el número de clones como variable dependiente y el resultado clínico como variable factor independiente (n=27 muestras). Los diagramas de violín representan la densidad de probabilidad de los datos en cada valor. El marcador de puntos representa el valor de la mediana con el rango intercuartílico. Los datos de origen se proporcionan como archivo de datos de origen

Fig. 3 Datos longitudinales trazados con la línea ajustada para cada resultado clínico. a Diversidad medida por la entropía de Shannon representada en puntos de tiempo por los tres resultados clínicos (NP, PNR, PR) en gDNA. b Diversidad medida por la entropía de Shannon representada en puntos de tiempo por los tres resultados clínicos (NP, PNR, PR) por isotipos en cDNA. Los valores P corresponden al término de interacción definido por tiempo × resultado clínico ajustando un modelo lineal de efectos mixtos (n=27 muestras). Cada punto representa la entropía por muestra a lo largo del tiempo con su línea ajustada e intervalo de confianza. Los datos de origen se proporcionan como archivo de datos de origen

estrategias implícitas, especialmente en los datos de gDNA donde el número de secuencias es mucho menor que para los datos de cDNA. En gDNA, restringimos el análisis a individuos con al menos 1000 clones para conservar suficientes secuencias. Se realizó un muestreo descendente a un mínimo de 1062 clones en comparación con 62.173 clones en cDNA. A pesar de esta limitación, observamos la tendencia para el tiempo 0, conservamos la significancia para el análisis longitudinal en gDNA y replicamos todas las asociaciones en cDNA. En ambos análisis (recon y downsampling), replicamos los resultados, a pesar de algunas limitaciones destacadas aquí, lo que demuestra la validez de los resultados informados anteriormente.

Las redes de células B muestran diferencias en la expansión clonal. El repertorio de células B se puede representar naturalmente como una red basada en la diversidad de secuencias31. En nuestros datos, desarrollamos una red visual para cada muestra (Fig. 4 y Figs. Suplementarias 5-7) donde cada vértice representaba un BCR único, y el número de BCR idénticos en función de sus secuencias de nucleótidos definía el tamaño del vértice. Existe un borde entre los vértices cuando pertenecen al mismo clon, por lo que los grupos de células B se pueden mostrar como grupos de vértices interconectados que forman un clon. Para cuantificar la red, usamos el índice de Gini, que es una medida de desigualdad que se aplicó a las distribuciones de vértice y conglomerado. Cuando se aplica al tamaño del vértice, Gini (V), se representa la naturaleza clonal general. Si Gini(V) está más cerca de 1, los vértices son desiguales mostrando expansión de algunos de ellos, y más cerca de 0 en caso contrario. Cuando se aplica al tamaño del conglomerado, Gini(C), se representa la dominancia clonal. Si está más cerca de 1, los clústeres son desiguales y, por lo tanto, representan clones dominantes; si está más cerca de 0, todos los clústeres tienen el mismo tamaño.

En la Fig. 4 mostramos un ejemplo de las marcadas diferencias visuales y cuantitativas entre los repertorios de células B representativos de cada uno de los tres grupos de resultados clínicos, en los tres puntos de tiempo diferentes (antes del trasplante y después del trasplante, 6 y 24 meses) . En el repertorio de PR, hay una gran cantidad de secuencias de células B que forman más grupos de clones y más grandes en comparación con NP, mientras que PNR se encuentra en el medio. A lo largo del tiempo, el grupo PR muestra una disminución en el número de BCR y clones únicos en comparación con NP. Las redes detalladas de células B de cada individuo en el estudio se proporcionan en las figuras complementarias. 5–7. Es interesante observar el patrón muy diverso de la red de células B en el individuo que desarrolló PTLD en el grupo NP (Fig. 5 complementaria), sin expansión de células B antes del trasplante, seguido de un aumento de células B después de 6 meses y una clara expansión clonal acompañada de una disminución de la diversidad a los 24 meses postrasplante.

En una evaluación adicional de la medida del Índice de Gini (Fig. 5), el grupo PR mostró consistentemente medidas significativamente más altas tanto para el vértice como para el grupo sobre el grupo NP, lo que sugiere que los pacientes del grupo PR tenían una mayor expansión clonal al inicio del estudio.

Fig. 4 Redes de repertorio de células B de tres individuos que representan los tres resultados clínicos a lo largo de los puntos de tiempo. Cada vértice representa un BCR único siendo el tamaño del vértice definido por el número de BCR idénticos considerando las secuencias de nucleótidos. Existe una arista entre los vértices cuando pertenecen al mismo clon definido anteriormente, por lo que los clusters son grupos de vértices interconectados que forman un clon. Cada muestra muestra el índice de Gini obtenido para el tamaño del vértice (Gini(V)) y el tamaño del conglomerado (Gini(C)). BCR refleja el total de receptores de células B para esa muestra específica y los clones reflejan el número total de clones únicos. Los datos de origen se proporcionan como archivo de datos de origen

y una mayor expansión posterior al trasplante de un subconjunto de clones dominantes (valor P [regresión lineal] <0.05, fig.="" 5).="" el="" grupo="" pnr="" cae="" entre="" np="" y="" pr="" como="" se="" mostró="" anteriormente,="" aunque="" este="" tiempo="" es="" significativamente="" diferente="" al="" grupo="" np="" en="" el="" tiempo="" 24="" (valor="" p="" [regresión="" lineal]="">< 0,05).="" aunque="" los="" datos="" para="" la="" fig.="" 5="" se="" generaron="" a="" partir="" de="" los="" datos="" de="" gdna,="" el="" isotipo="" igm="" para="" cdna="" mostró="" las="" mismas="" diferencias="" (valor="" p="" [regresión="" lineal]="0.05)" (fig.="" 8="">

Ciertos clones y genes de IGHV están implicados en el rechazo.

Aunque nuestro enfoque principal fue caracterizar el repertorio de células B por grupos de resultados clínicos, brindando una imagen global de la respuesta inmune antes y después del trasplante, nuestros datos también nos permitieron realizar análisis específicos de secuencias de Ig en el clon y el IGHV. nivel de gen.

Para el análisis clonal, evaluamos la asociación de la presencia o ausencia de cada clon particular (118 223 clones totales) con el resultado clínico (PR, PNR, NR) en cada momento. Al aplicar la prueba exacta de Fisher, encontramos 8, 4 y 21 clones nominalmente asociados con resultados clínicos en cada uno de 0, 6 y 24 meses, respectivamente (Tabla complementaria 1). Si bien ninguno pasó la corrección de múltiples pruebas, principalmente debido a la falta de potencia ya que tenemos un tamaño de muestra limitado en el análisis con miles de parámetros (clones), pudimos observar que los pocos clones que se acercaron a la significación (valor P < {{="" 11}}.05)="" se="" compartieron="" entre="" pacientes="" solo="" en="" el="" grupo="" pr="" y="" se="" enriquecieron="" a="" los="" 24="" meses="" posteriores="" al="">

También consideramos si algunos clones persistieron durante el tiempo de muestreo, más que otros, dentro de cada resultado clínico (Figura 9 complementaria). Damos cuenta de dos medidas diferentes: (1) el número de clones persistentes y (2) la expansión clonal. Observamos que los clones que fueron persistentes en el PR estaban significativamente más expandidos (P-valor [regresión lineal]=0.01, PR vs. NP) y mostraron una tendencia de mayor número de clones persistentes (P- valor [regresión lineal]=0.09). Además, examinamos si estos clones persistentes también se compartieron entre diferentes individuos dentro de cada resultado clínico. De los 263 clones persistentes detectados, 23 se compartieron entre individuos. Cinco se compartieron dentro del mismo PNR y seis dentro del grupo PR y no se compartieron clones entre el grupo NP. En total, 12 clones compartidos fueron comunes en ambos grupos de pacientes con lesión por trasplante crónica progresiva y fibrosis a lo largo del tiempo (PR y PNR). La lista de clones compartidos entre individuos se proporciona en el material complementario (Tabla complementaria 2).

A continuación, realizamos un análisis del gen IGHV, analizando el uso del gen IGHV por muestra, definido como el número de veces que se ha utilizado cada gen IGHV, normalizado por el número de clones (para evitar el sesgo de muestreo de ciertos genes IGHV), filtrando los genes de baja expresión.

Fig. 5 Índice de Gini de vértice representado frente al índice de Gini de grupo. El diagrama de dispersión representa cada muestra en los momentos 0, 6 y 24. Los diagramas de caja muestran las diferencias de Gini(V) y Gini(C) en el momento 24. Los valores P se obtienen del ajuste de un modelo de regresión lineal considerando el Gini(V) y el Gini(C) como variable dependiente y el resultado clínico como variable factor independiente para cada punto de tiempo (n=27 muestras). En el gráfico de caja, solo se muestra el tiempo 24, pero el tiempo 0 y el 6 también son significativos para NP frente a PR: tiempo 0: P (Gini (V))=0.1, P ( Gini(C))=0.05; tiempo 6 P (Gini(V))=0.02, P (Gini(C))=0.01; tiempo 24: P (Gini(V))=0.003, P (Gini(C))=0.01. La banda dentro del cuadro representa el valor de la mediana, el cuadro define el rango intercuartil (IQR) y los bigotes definen el primer y tercer cuartil ± 1,5 × IQR. Los datos de origen se proporcionan como archivo de datos de origen

(uso del gen IGHV > {{0}}.05 en al menos el 10 por ciento de las muestras), y aplicando un modelo de regresión lineal para encontrar aquellos genes que estaban asociados con cada resultado clínico, en cada momento. De los 27 genes IGHV que pasaron el filtro de baja expresión, encontramos genes significativos entre el grupo PR y NP (valor P <0.05) con="" tres="" genes="" en="" el="" tiempo="" 0,="" 7="" en="" el="" tiempo="" 6="" y="" 16="" en="" el="" tiempo.="" tiempo="" 24="" (fig.="" 6a-c).="" de="" estos="" genes,="" 1="" (ighv3-11)="" en="" el="" tiempo="" 0,="" 5="" genes="" (ighv3-7,="" ighv3-15,="" ighv3-21,="" ighv3-23,="" ighv{="" {22}})="" en="" el="" momento="" 6="" y="" 16="" genes="" (ighv1-8,="" ighv1-18,="" ighv1-46,="" ighv2-="" 5,="" ighv3-7,="" ighv{{="" 30}},="" ighv3-15,="" ighv3-23,="" ighv3-30,="" ighv3-33,="" ighv3-48,="" ighv3-74,="" ighv{{37="" }},="" ighv4-59,="" ighv4-61,="" ighv5-51)="" en="" el="" momento="" 24="" pasó="" la="" corrección="" de="" prueba="" múltiple="" de="" tasa="" de="" detección="" falsa="" (fdr).="" curiosamente,="" encontramos="" que="" ighv3-23="" era="" el="" gen="" más="" significativo="" y="" abundante="" en="" los="" tres="" puntos="" de="" tiempo="" en="" la="" comparación="" np="" vs.="" pr="" (tiempo="" 0:="" valor="" p="0.04," tiempo="" 6:="" p-="" valor="0.003," tiempo="" 24:="" valor="" p="0.02)" (fig.="" 6d).="" además,="" evaluamos="" si="" las="" secuencias="" ighv3-23="" estaban="" sobrerrepresentadas="" entre="" las="" secuencias="" compartidas="" del="" análisis="" clonal="" anterior.="" descubrimos,="" usando="" un="" análisis="" de="" enriquecimiento="" con="" la="" prueba="" exacta="" de="" fisher,="" que="" las="" secuencias="" ighv3-23="" estaban="" significativamente="" sobrerrepresentadas="" en="" ambos,="" los="" clones="" persistentes="" compartidos="" entre="" individuos="" (tabla="" complementaria="" 2)="" (valor="" p="">< 2.2="" ×="" 10="" −="" 16="" )="" y="" los="" clones="" asociados="" con="" el="" resultado="" clínico="" en="" el="" momento="" 24="" (tabla="" complementaria="" 1)="" (valor="" p="">< 2,2="" ×="" 10-16).="" observamos="" que="" el="" individuo="" 9="" en="" el="" grupo="" nr,="" que="" se="" había="" encontrado="" que="" compartía="" algunos="" clones="" persistentes="" con="" los="" progresores="" en="" los="" análisis="" anteriores,="" se="" clasificó="" con="" el="" grupo="" pr="" en="" todos="" los="" puntos="" de="" tiempo.="" no="" hubo="" efectos="" de="" confusión="" en="" los="" datos="" de="" diversas="" variables="" demográficas="" y="" clínicas,="" como="" la="" edad="" del="" receptor,="" el="" sexo,="" la="" raza,="" la="" fuente="" del="" donante,="" el="" tipo="" de="" inmunosupresión,="" la="" incompatibilidad="" de="" hla="" y="" la="" causa="" de="" la="" insuficiencia="" renal.="" además,="" también="" se="" encontró="" que="" este="" gen="" es="" significativo="" en="" los="" isotipos="" igm="" (valor="" p="" [regresión="" lineal]="0.008)" e="" igd="" (valor="" p="" [regresión="" lineal]="0.05)." basado="" en="" cdna="" a="" los="" 24="" meses="" después="" del="" trasplante,="" en="" concordancia="" con="" los="" resultados="" anteriores="" que="" muestran="" consistencia="" con="" estos="" dos="" isotipos="" siendo="" los="" más="" enriquecidos="" en="" el="" grupo="" pr.="" solo="" se="" encontraron="" otros="" tres="" genes="" significativos="" en="" el="" análisis="" de="" cdna,="" y="" todos="" fueron="" 24="" meses="" después="" del="" trasplante="" en="" los="" isotipos="" igd="" e="" igm="" (ighv3-15="" e="" ighv4-="" 61="" en="" igd="" e="" ighv4-39="" en="">

Discusión

La diversidad es una característica esencial del sistema inmunitario y, en humanos sanos, es fundamental contra los patógenos para hacer frente a las enfermedades. En el trasplante de órganos, la manipulación terapéutica deliberada se instituye clínicamente para permitir que el sistema inmunitario del propio paciente ignore o acepte activamente el órgano extraño para que no genere una respuesta aloinmune que conduzca al rechazo. Las células B son un componente importante de este proceso y nuestro grupo y otros han demostrado que son fundamentales tanto en la presentación de antígenos32,33 como en la producción de aloanticuerpos34,35. En este trabajo, hemos utilizado la secuenciación de células B de alto rendimiento para comprender mejor la diversidad y la clonalidad de las células B en elriñóncirculación del receptor del trasplante, tanto antes del injerto como después de 24 meses de seguimiento, con una evaluación longitudinal del repertorio inmunitario de células B. En general, nuestro análisis muestra una mayor diversidad de células B antes del injerto, diferencias longitudinales con una disminución en la diversidad acompañada de expansión clonal y un aumento en el uso de ciertos genes IGHV entre aquellos que rechazan los injertos.

Una necesidad clínica clave no satisfecha de un trasplante de órganos es la falta de predicción no invasiva, sensible y precisa de la lesión del trasplante y los malos resultados. Esta tarea se complica por el hecho de que existen diversos factores que influyen en la supervivencia del injerto36. En este estudio, encontramos que los individuos estables tenían una diversidad reducida del repertorio inmunitario de células B antes del trasplante en comparación con aquellos que rechazaron el órgano. El próximo paso debe ser demostrar el valor predictivo de la diversidad del repertorio de células B, proporcionando mejores biomarcadores potenciales para la predicción del rechazo antes del injerto, y la posibilidad de implementarse en la atención clínica y las opciones de inmunosupresión antes y después.riñóntrasplante. Si esta característica es el resultado de algún factor que contribuya a la disminución de la diversidad en individuos estables, como factores ambientales o genéticos, no solo podríamos predecir el rechazo sino también prevenirlo. De hecho, hallazgos muy recientes mostraron que la variación en el sistema inmunológico está impulsada por factores ambientales, mentales y genéticos37,38. En nuestro estudio, no pudimos encontrar ninguna asociación con ninguna característica demográfica y clínica del paciente (edad, sexo, raza, inmunosupresión, origen del órgano, discrepancias HLA y ESRD). En este sentido, necesitamos un nuevo análisis para corroborar si factores específicos afectan la diversidad del repertorio de células B y los resultados del trasplante.

Otro hallazgo interesante en nuestro estudio muestra que el repertorio inmunológico se comporta de manera diferente a lo largo del tiempo dependiendo del grupo de resultados clínicos. Para aquellos que muestran rechazo del órgano después del trasplante, la diversidad de células B es inicialmente más alta y luego disminuye con el tiempo, mientras que la tendencia de diversidad inversa se observa en pacientes que no desarrollan rechazo o lesión crónica del injerto. Aunque todos los individuos recibieron la misma carga de inmunosupresión después del trasplante, alguna posible explicación de la diversidad reducida en los pacientes que desarrollan rechazo puede relacionarse con el hecho de que estos pacientes reciben una carga de inmunosupresión temporalmente mucho mayor para el tratamiento del rechazo y luego se mantienen en la línea de base más alta. Aunque esto podría explicar la reducción en la diversidad de células B con el tiempo, y explicar la diferencia a los 24 meses después del trasplante, es poco probable que esta sea la causa, ya que la diversidad reducida en el grupo PR es

Fig. 6 Mapa de calor y diagrama de caja para el análisis de uso de genes IGHV. Mapa de calor que muestra los genes IGHV seleccionados como nominalmente significativos (valor P < 0.05)="" en="" el="" momento="" 0="" (a),="" 6="" (b)="" y="" 24="" (c)="" para="" np="" contra="" relaciones="" públicas="" la="" escala="" de="" color="" rojo="" representa="" la="" expresión="" de="" cada="" gen="" en="" las="" muestras.="" las="" bandas="" en="" la="" parte="" superior="" muestran="" el="" resultado="" clínico="" y="" la="" causa="" de="" la="" esrd.="" diagrama="" de="" caja="" que="" muestra="" la="" expresión="" ighv3-23="" a="" lo="" largo="" de="" los="" puntos="" de="" tiempo="" para="" np="" frente="" a="" pr="" (tiempo="" 0:="" valor="" p="0.04," tiempo="" 6:="" valor="" p="0.003," tiempo="" 24:="" p="" -valor="0.02)" (d).="" la="" banda="" dentro="" del="" cuadro="" representa="" el="" valor="" de="" la="" mediana,="" el="" cuadro="" define="" el="" rango="" intercuartil="" (iqr)="" y="" los="" bigotes="" definen="" el="" primer="" y="" tercer="" cuartil="" ±="" 1,5="" ×="" iqr.="" los="" valores="" de="" p="" se="" obtienen="" del="" ajuste="" de="" un="" modelo="" de="" regresión="" lineal="" considerando="" los="" genes="" v="" como="" variable="" dependiente="" y="" el="" resultado="" clínico="" como="" variable="" independiente.="" (n="12" muestras).="" los="" datos="" de="" origen="" se="" proporcionan="" como="" archivo="" de="" datos="" de="">

también se observa a los 6 meses después del trasplante, en un momento en que los pacientes aún no han desarrollado rechazo, lo que sugiere que es probable que estén involucrados otros procesos activos. La observación de expansión clonal selectiva con clones más dominantes solo en pacientes que desarrollan rechazo y/o enfermedad crónica progresiva.riñónlesión por trasplante, sugiere una selección, persistencia y expansión biológicamente relevante impulsada por aloantígenos de ciertos clones a lo largo del tiempo, lo que explica la reducción general en la diversidad temporal. Aunque podemos plantear la hipótesis de que la expansión de estos clones probablemente esté relacionada con una lesión aloinmune en el injerto, la evidencia directa de que la expansión de estos clones es aloinmune requiere estudios adicionales in vitro y en animales.

El rechazo agudo sigue siendo el factor negativo más fuerte para la supervivencia del injerto a largo plazo a pesar de las rápidas mejoras en las terapias de inmunosupresión39,40. Este estudio también encuentra una asociación del uso de algunos genes IGHV con el rechazo, aunque el vínculo causal debe explorarse en estudios futuros. El IGHV3-23 es el gen más interesante en el análisis de gDNA, ya que se usa significativamente más en pacientes que desarrollan rechazo en todos los puntos de tiempo medidos y está sobrerrepresentado en los clones persistentes compartidos entre individuos y los clones enriquecidos entre pacientes rechazados a los 24 meses postrasplante. Este gen también se valida a los 24 meses después del trasplante en los isotipos IgD e IgM en el análisis de ADNc. El IGHV3-23 se ha asociado ampliamente con un mal pronóstico en la leucemia linfocítica crónica41 y se ha demostrado que la gran mayoría de las secuencias del IGHV3-23 conservan la capacidad de mediar en las interacciones de los superantígenos42. Los superantígenos de células B son producidos por virus y bacterias, conocidos por unirse a inmunoglobulinas fuera de los sitios de unión de antígenos convencionales43. Se ha demostrado que los encuentros de células B con un superantígeno inducen proliferación, activación, migración y eliminación44. En el trasplantadoriñón, existe la posibilidad de una exposición continua al virus y a los antígenos bacterianos, relacionada con una etiología de reflujo vesicoureteral primario como causa de ESRD o reflujo urinario secundario después de la reimplantación del uréter trasplantado, o reflujo después de una infección del tracto urinario, el riesgo de que aumenta con la exposición a la inmunosupresión crónica después del trasplante. Ajustamos los resultados de los análisis por la causa de la insuficiencia renal, entre otros factores clínicos y demográficos; los resultados discutidos previamente siguen siendo significativos, aunque nos dimos cuenta de que el paciente NP mal clasificado en el análisis (Fig. 6) tenía una enfermedad por reflujo. Chen et al. también encontraron previamente que los clones en tejido de biopsia de receptores de trasplante renal infiltrados por células B tenían un predominio del gen IGHV3-23 entre otros45. Grover et al.46 demostraron que los anticuerpos para este gen en particular no reconocían los antígenos HLA del donante sino que eran específicos para E. coli y Modena et al.47 demostraron que la carga del número de bacterias en la orina era mucho mayor en pacientes con fibrosis intersticial y atrofia tubular que aquellos con injertos que funcionaban bien. Ampliamos estos hallazgos demostrando que el uso del gen IGHV3-23 es significativamente mayor en pacientes con rechazo múltiple en sangre periférica y puede implicar antígenos comunes particulares en la conducción del rechazo. En el futuro, la expresión de IGHV3-23 podría usarse potencialmente para monitorear la respuesta inmune hacia los trasplantadosriñón.

Ampliando nuestro estudio mediante secuenciación de cDNA, pudimos replicar la mayoría de nuestros resultados en dos de los isotipos (IgM e IgD), mostrando menor diversidad pretrasplante en el NP, siendo los dos más significativos en el análisis longitudinal con mayor expansión y dominio. clones en el análisis de redes y también replicando el gen IGHV3-23. Los primeros anticuerpos que se producen en una respuesta inmune humoral son siempre IgM y progresan rápidamente a la producción de todos los diferentes isotipos, IgD, IgA, IgG e IgE, pero requiere especial interés el isotipo IgD48. La IgD se coexpresa con la IgM y la IgD secretada existe y tiene una función en la sangre, las secreciones mucosas y en la superficie de las células efectoras inmunitarias innatas, como los basófilos49. Los basófilos son glóbulos blancos que combaten virus, bacterias, parásitos y hongos, y están implicados en enfermedades renales y rechazo de trasplantes50. Así, otra evidencia que relaciona las respuestas de las células B al proceso de rechazo con virus y bacterias.

Se necesitan estudios futuros para demostrar que esta activación se debe a diferencias en el microbioma del receptor con implicaciones en el diagnóstico y la terapéutica.

Este estudio nos permitió identificar la relevancia de algunos de estos clones BCR, identificar los clones BCR de relevancia clínica con rechazo de aloinjerto y mostrar que existe una probable relevancia de estos clones con inmunidad heteróloga, dado el enriquecimiento de estos clones en pacientes con vías urinarias colonizadas antes del trasplante y su relevancia biológica para las respuestas a patógenos. Una mejor comprensión del comportamiento del repertorio inmunitario enriñónlos trasplantes no habrían sido posibles sin la aplicación de BCRSeq en combinación con una implementación robusta de canalizaciones computacionales y estadísticas. Sin embargo, existen varias limitaciones de nuestro enfoque que deben reconocerse: en primer lugar, nuestro tamaño de muestra es muy seleccionado y relativamente pequeño en un conjunto de pacientes pediátricos y, aunque alcanzamos significación estadística en nuestro análisis y validamos en dos fuentes de datos diferentes, será necesario un mayor análisis para corroborar nuestros resultados. En segundo lugar, nuestros resultados no están exentos de la influencia que el muestreo biológico y técnico pueda tener en nuestro análisis. Las medidas de diversidad dependen de varios problemas: el hecho de que solo una fracción de miles de millones de células en un repertorio está representada en una muestra, las diferencias en la profundidad de secuenciación y posibles errores experimentales. Hemos controlado ampliamente todos estos problemas, primero en el laboratorio, procesando la misma cantidad de sangre para cada muestra en el mismo lote y segundo, computacional y estadísticamente, aplicando la herramienta de reconocimiento para estimar el repertorio general y realizando una reducción de muestreo para controlar la profundidad de secuenciación. y errores experimentales. En tercer lugar, hemos realizado BCRSeq utilizando dos fuentes diferentes, gDNA y cDNA. La secuenciación de gDNA facilita la estimación de la clonalidad de una secuencia de Ig dada, ya que el número de lecturas de secuencias será proporcional al número de moléculas de gDNA. La secuenciación del ADNc proporciona una estimación del nivel de expresión relativo de varias secuencias de Ig en el repertorio. Se ha demostrado que para los receptores de células T, la caracterización del clonotipo realizada en el ADNc no es tan buena como en el ADNg, lo que muestra que la proporción relativa de clones individuales difiere mucho15 o que el seguimiento de los clones específicos del VIH solo es exitoso con el ADNg, pero no mRNA51. En cuarto lugar, la influencia de la inmunosupresión puede ser un factor de confusión en este tipo de análisis. En este estudio, todas las muestras provienen de un ensayo clínico donde todos los pacientes recibieron la misma carga de inmunosupresión después del trasplante. Sin embargo, controlamos por los dos tipos de esteroides y sin esteroides para asegurarnos de que esto no fuera un problema, y ​​no observamos diferencias en los resultados. Finalmente, la cohorte que aquí presentamos es la de trasplantes pediátricos. La mayoría de los aspectos clínicos trasplantados son similares en niños y adultos. La inmunosupresión y los regímenes utilizados son similares, la creatinina es el principal biomarcador sérico, el rechazo agudo se determina principalmente mediante biopsia con el uso de los criterios de Banff y los mecanismos de rechazo de lariñónlos injertos son generalmente similares52, por lo que la mayoría de las investigaciones realizadas en adultos o niños pueden aplicarse a ambos. Sin embargo, otros aspectos como el incumplimiento/no adherencia a la inmunosupresión, los aspectos inmunológicos, las enfermedades renales primarias que conducen a la insuficiencia renal, a menudo asociadas con problemas urológicos, y las vacunas que se requieren antes del trasplante pueden diferir, por lo tanto, un análisis más profundo en será necesaria una población adulta para generalizar estos hallazgos.

A pesar de estas limitaciones, nuestros datos revelan que se observa una mayor diversidad previa al trasplante en individuos que rechazan el órgano, lo que sugiere una predisposición al rechazo, lo que puede tener implicaciones futuras en la predicción del riesgo de rechazo antes del injerto, las opciones de inmunosupresión y la atención clínica. practicas Después de 24 meses de seguimiento, en el grupo de rechazo se observa una reducción general de la diversidad a lo largo del tiempo acompañada de la persistencia y expansión de ciertos clones y un mayor uso de varios genes de IGHV, lo que puede implicar antígenos comunes particulares en la conducción del rechazo. Se observa un interés especial por el aumento del uso del gen IGHV3-23 entre los pacientes con rechazo, ya que se ha asociado previamente conriñóntrasplante y podría ser un componente clave para impulsar el proceso de rechazo. Este trabajo presenta un análisis longitudinal del repertorio inmune de células B en trasplantes de órganos que promueve más estudios para confirmar estos hallazgos, ya que pueden tener implicaciones clínicas en la predicción, control, seguimiento y tratamiento.riñónrechazo.

Métodos

Diseño del estudio. Estudiamos 81 muestras para gDNA y 56 muestras coincidentes para cDNA longitudinalmente en tiempos 0, 6 y 24 meses de un número total de 27 receptores pediátricos que recibieron un primarioriñóntrasplante. Los sujetos de este estudio provienen de un ensayo clínico (estudio multicéntrico SNSO1) en el que los sujetos fueron aleatorizados (1:1) a un régimen tradicional de inmunosupresión basado en dosis bajas de esteroides (esteroides, inducción estándar con daclizumab hasta el segundo mes posterior al trasplante, e inmunosupresión de mantenimiento con tacrolimus (Prograf, Astellas Pharma) y MMF (CellCept, Hoffman-La Roche) o un régimen de inmunosupresión sin esteroides (inducción prolongada de daclizumab hasta el sexto mes postrasplante, tacrolimus y MMF). se inscribieron después de la aprobación del IRB y tenían consentimiento informado.En este estudio, 14 pacientes recibieron un régimen de evitación de esteroides, mientras que 13 recibieron un régimen inmunosupresor basado en esteroides53 y ninguno de estos pacientes recibió inmunosupresión antes del trasplante, ya que este era uno de los criterios de exclusión. consistió en tres pulsos de corticoides intravenosos (10 mg/kg) e intensificación de la inmunosupresión basal.

Todas las muestras utilizadas en el estudio tenían asociada una biopsia seriada de aloinjerto, que fue leída por un patólogo central, utilizando puntajes histológicos semicuantitativos. El rechazo agudo clínico se definió como un episodio de rechazo agudo, asociado con disfunción del injerto, basado en un aumento de más del 10 por ciento en la creatinina sérica desde los valores basales, y confirmado a través de una lectura anatomopatológica central de las biopsias según la clasificación actualizada de Banff23,24. La lesión crónica del aloinjerto se definió utilizando la puntuación del índice de daño crónico del aloinjerto (CADI). Los pacientes se clasificaron en tres resultados clínicos definidos por la puntuación CADI y los episodios de rechazo. Los no progresores (NP) tenían una puntuación CADI no incremental baja en tres biopsias en serie durante 2 años, sin rechazo agudo, los progresores sin rechazo (PNR) tenían un CADI más alto. puntuación en sus biopsias en serie durante 2 años e incremental a lo largo de los puntos de tiempo sin rechazo y progresores con rechazo (PR) tuvieron puntuaciones CADI incrementales altas en sus biopsias en serie durante 2 años con episodios de rechazo. Estos pacientes fueron cuidadosamente seleccionados de una cohorte más grande de 120 pacientes, emparejados por variables demográficas y para que todos los NP y PNR no tuvieran evidencia de inflamación en la biopsia o lesión subclínica medida por la ausencia de anticuerpos específicos del donante. Ninguno tenía HLA o injerto haploidéntico ya que este era un criterio de exclusión para la inscripción54. Todas las muestras se recolectaron de 12 programas de trasplante pediátrico diferentes de EE. UU. entre 2004 y 2006, según los protocolos aprobados por el IRB. El estudio también fue aprobado por The Human Research Protection Program (HRPP) de la Universidad de California, San Francisco y la Universidad de Stanford para permitir un análisis de muestras de biobancos. Todos los pacientes/tutores dieron su consentimiento informado para participar en la investigación, en pleno cumplimiento de la Declaración de Helsinki. Las actividades clínicas y de investigación que se informan son consistentes con los Principios de la Declaración de Estambul tal como se describe en la Declaración de Estambul sobre el Tráfico de Órganos y el Turismo de Trasplantes.

Aislamiento de gDNA y RNA. Las muestras de sangre (4,5 ml) se recogieron en un tubo de tapa roja de 5 ml y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min hasta que se formó el coágulo. Luego, la muestra se centrifugó a 2000 × g durante 5 min utilizando un rotor de cubeta oscilante. Luego, la capa superior de suero se transfirió a otro criotubo y el coágulo se almacenó en el mismo tubo a -80 grados hasta su uso. El ADN genómico de los coágulos de sangre total se extrajo mediante Clotspin Baskets y el Gentra PuregeneBlood Kit (Qiagen, Valencia, CA).

Para la extracción de ARN deriñónbiopsia con aguja (Qiagen, Valencia, CA) y almacenada a -80 grados; El ARN total se extrajo utilizando una mezcla maestra de 790 µl de TRIzol y 10 µl de glucógeno. Las muestras de tejido se homogeneizaron, se incubaron entre 15 y 25 grados durante 5 min y se añadieron 160 µl de cloroformo para la separación de fases. La mezcla se incubó de nuevo a 25 grados durante 2 min seguido de centrifugación a 4 grados y se usó para la extracción de ARN usando el RNeasy Micro Kit (Qiagen Catalog no.4004). La cantidad y la integridad del ARN se determinaron con el espectrofotómetro UV-Vis Thermo Scientific NanoDrop ND-2000 y el bioanalizador Agilent, respectivamente.

Secuenciación de células B. Se prepararon reacciones de PCR con plantilla de ADN genómico

a partir de alícuotas de 100 ng de gDNA para generar seis bibliotecas de códigos de barras independientes por muestra. Se utilizaron cebadores multiplexados para las regiones marco de IgH J o FR1 o FR2 según el diseño BIOMED-255. Se utilizaron "secuencias de código de barras" de diez nucleótidos en los cebadores para indicar la identidad de la muestra y la identidad de la biblioteca replicada para cada reacción de PCR. La PCR se realizó con polimerasa AmpliTaq Gold (Roche) con el siguiente programa: 94 grados durante 5 min; 35 ciclos de (94 grados por 30 s, 60 grados por 45 s, 72 grados por 90 s); y extensión final a 72 grados durante 10 min. Se llevó a cabo una segunda reacción de PCR para garantizar que las bibliotecas no se amplificaran hasta la saturación antes de la purificación y secuenciación del gel. En total, 0,4 ul de cada primer producto de PCR moldearon la segunda reacción de PCR usando cebadores externos específicos para las 454 secuencias conectoras; la amplificación se realizó con el programa: 94 grados por 15 min, 12 ciclos de (94 grados por 30 s, 60 grados por 45 s, 72 grados por 90 s), y extensión final a 72 grados por 10 min. La tasa de error de AmpliTaq Gold debería tener un efecto mínimo en la identificación de secuencias clonalmente relacionadas o en la estimación de tasas de mutación somática en secuencias, como se analiza en otro lugar56. El ADNc se sintetizó a partir de un total de 300 ng de ARN con cebado mediante hexámeros aleatorios. Las plantillas se amplificaron mediante PCR utilizando cebadores Biomed IGHV en marco 1 (FR1) y cebadores específicos de isotipo ubicados en el primer exón de las regiones constantes. Estos cebadores18,57 también codificaron aproximadamente la mitad de las secuencias enlazadoras de Illumina necesarias para la generación de grupos y la secuenciación en el instrumento MiSeq. La identidad de la muestra se codificó mediante códigos de barras identificadores multiplex de ocho nucleótidos en cada cebador. Para el reconocimiento de grupos de Illumina, se codificaron cuatro nucleótidos aleatorios en los cebadores inmediatamente después de la secuencia del enlazador de Illumina en los cebadores de la región constante. Cada isotipo de anticuerpo para cada muestra se amplificó en una reacción de PCR separada, para evitar la formación de productos de PCR quiméricos de isotipo cruzado. La PCR se realizó con AmpliTaq Gold (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante y se utilizó un programa de 94 grados por 7 min, 35 ciclos de (94 grados por 30 s, 58 grados por 45 s, 72 grados por 120 s), y final extensión a 72 grados durante 10 min. Se usó un segundo paso de PCR para agregar la porción restante de los enlazadores de Illumina a los amplicones y se llevó a cabo con el kit Qiagen Multiplex PCR (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando 0,4 microlitros del primer producto de PCR como plantilla en un Reacción de 30 microlitros. El programa de PCR para el segundo paso de PCR fue de 94 grados durante 15 min, 12 ciclos de (94 grados durante 30 s, 60 grados durante 45 s, 72 grados durante 90 s) y extensión final a 72 grados durante 10 min. Los productos de cada reacción de PCR se agruparon en cantidades equimolares estimadas, se sometieron a electroforesis en geles de agarosa y se extrajeron en gel con kits QIAquick (Qiagen). La secuenciación de alto rendimiento de bibliotecas moldeadas de ADN genómico se realizó en la plataforma 454 (Roche) utilizando química de titanio. La secuenciación de la biblioteca de ADNc se realizó en un instrumento Illumina MiSeq utilizando 600-kits de secuenciación cíclica. En los Datos complementarios 1 se incluye una lista completa de los cebadores utilizados con MiSeq (M154 y M155) y 454 Titanium (T7).

Las lecturas de secuenciación se procesaron de la siguiente manera: las lecturas de extremos emparejados se fusionaron utilizando FLASH58, donde después las secuencias se desmultiplexaron y recortaron los códigos de barras y las secuencias de cebadores IGHV. Las regiones V, D y J y las uniones V-D (N1), D-J (N2) se identificaron mediante el programa de alineación IgBLAST59. Las secuencias se filtraron para eliminar artefactos no IGH, secuencias con inserción o deleciones del gen V, secuencias quiméricas y secuencias no funcionales. A nivel de muestra, excluimos a aquellos con<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">

Análisis de diversidad. La diversidad se mide por la riqueza de especies considerando el número de clones por muestra. Esta medida no considera la frecuencia de cada especie, por lo que también usamos la entropía de Shannon (H) para medir la diversidad proporcionando

información sobre la distribución de tallas de las especies en la población. H se define como:

donde N es el número de clones únicos y pi es la frecuencia del clon i. H varía de 0 (muestra con un solo clon) a Hmax ¼ log2N (muestra con una distribución uniforme de clones).

Luego, usamos un modelo lineal general para encontrar la asociación entre la riqueza y la entropía con el resultado clínico en los diferentes momentos. Ajustamos este modelo por todas las variables clínicas disponibles que se muestran en la Tabla 1 para asegurarnos de que alguna de las características del paciente fuera un factor de confusión.

Para modelar el componente longitudinal de los datos, aplicamos un modelo de efecto mixto lineal considerando un modelo de crecimiento condicional como se muestra en la Fig. 10 complementaria. Para aplicar este modelo, usamos el paquete lme4 en R considerando la interacción entre el resultado clínico y el tiempo para encontrar asociación con la riqueza y la diversidad siendo el tiempo un efecto aleatorio.

Para lidiar con el hecho de que las medidas de diversidad pueden verse afectadas por el problema de las especies faltantes (solo se representa una fracción de miles de millones de células en un repertorio) y los errores de secuenciación y experimentales, realizamos dos estrategias además del análisis de datos completo. En primer lugar, utilizamos la herramienta Recon (reconstrucción de clones estimados a partir de números observados)29 para abordar el problema de las especies faltantes. Recon es un método de máxima verosimilitud modificado que genera la diversidad general de un repertorio a partir de mediciones en una muestra. Recon genera estimaciones precisas y sólidas de un conjunto de medidas de diversidad, incluidas la riqueza y la entropía, lo que permite comparaciones sólidas de diversidad entre individuos. En segundo lugar, realizamos una estrategia de reducción de muestreo tomando un subconjunto aleatorio de lecturas para cada muestra igual al tamaño de secuenciación más pequeño, seguido de un nuevo cálculo de los clones de células B para ajustar la profundidad de secuenciación y tratar posibles errores experimentales. Para gDNA, hay muestras con lecturas muy bajas (< 1000),="" y="" para="" evitar="" perder="" muchas="" secuencias="" y="" la="" realidad="" de="" los="" datos,="" excluimos="" un="" total="" de="" nueve="" muestras="" que=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">

Análisis de red. El algoritmo de generación de red es muy similar al definido antes31. Brevemente, cada vértice representa una secuencia de células B donde el tamaño está definido por todas las secuencias idénticas. Los bordes se calculan usando la definición del clon (los mismos segmentos V y J, la misma longitud de CDR3 y el 90 por ciento de identidad de nucleótidos entre CDR3) y los grupos representan cada clon en el repertorio. El análisis se realizó utilizando el paquete de gráficos en R usando la opción de diseño_con_graphopt para generar el gráfico.

Para cuantificar la red, calculamos el Índice de Gini para el tamaño del vértice y el tamaño del conglomerado. El índice de Gini es una medida de desigualdad ampliamente utilizada para medir la distribución de la riqueza. Mide la desigualdad entre los valores de la distribución de frecuencias. Usamos la función de Gini de un paquete en R para calcular el coeficiente de Gini para el tamaño del vértice y la distribución del tamaño del conglomerado. Un coeficiente de Gini de cero expresa igualdad perfecta y un coeficiente de Gini de 1 expresa desigualdad máxima.

Análisis clonal. Para estudiar los clones específicos asociados con los resultados clínicos, construimos una matriz con todos los clones que están presentes en más de una muestra (número total=118,223) por todas las muestras en cada momento. Luego estudiamos la asociación con el resultado clínico de cada clon particular definiendo una variable por clon como presente/no presente. Finalmente, aplicamos la prueba exacta de Fisher para tener en cuenta la significancia en las tablas de 2 × 3 para cada clon en cada punto de tiempo. También estudiamos los clones de persistencia definidos por aquellos clones que se encuentran en más de un punto temporal en cada individuo. Luego, para dar cuenta de las diferencias por el resultado clínico, aplicamos un modelo lineal que define como variable dependiente el número de clones (para medir las diferencias en la persistencia) y el número de recuentos de cada clon (para medir la expansión clonal) y el resultado clínico como un predictor independiente.

Análisis de uso del gen IGHV. Para estudiar los genes IGHV, evaluamos el uso del gen IGHV por muestra como el número de veces que se usa cada gen normalizado por el número de clones para evitar la sobrerrepresentación de ciertos genes IGHV. Para el análisis estadístico, filtramos aquellos genes con una expresión muy baja (uso/clones de IGHV < {{0}}.05)="" en="" al="" menos="" el="" 10="" por="" ciento="" de="" las="" muestras.="" en="" total,="" analizamos="" 27="" genes="" ighv="" correspondientes="" a="" 63="" muestras.="" luego,="" aplicamos="" un="" modelo="" lineal="" para="" encontrar="" aquellos="" genes="" que="" estaban="" asociados="" con="" el="" resultado="" clínico="" en="" cada="" punto="" de="" tiempo="" y="" corregimos="" estos="" resultados="" mediante="" múltiples="" pruebas="" usando="" benjamini="" y="" hochberg="" fdr="">< 0.05.="" ajustamos="" este="" modelo="" por="" todas="" las="" variables="" clínicas="" disponibles="" que="" se="" muestran="" en="" la="" tabla="" 1="" para="" asegurarnos="" de="" que="" alguna="" de="" las="" características="" del="" paciente="" fuera="" un="" factor="" de="">

Resumen de informes. Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

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