Componentes químicos de las hojas de cistanche

Resumen: CistancheLas hojas se han utilizado durante mucho tiempo como medicina tradicional paratratandoaccidente cerebrovascular isquémico, angina de pecho, yhipertensióny como una bebida saludable ycosmético paraantienvejecimiento. Este estudio tuvo como objetivo aislar tantos compuestos como fuera posible de un extracto de etanol.de las hojas de caqui para identificar los compuestos biológicamente activos. El efecto antioxidantede la capa de acetato de etilo del extracto de etanol de las hojas de caqui fue demostrado porEnsayo de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) y cromatografía líquida de alta resolución en línea.2,20 -análisis de casino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) (HPLC-ABTS). Un nuevo flavonoide,canferol-3-O- -D-2"-cumaroilgalactósido (1), y un nuevo compuesto natural, kaempferol-3-O- -D-2"-feruloilglucósido (3) fueron aislados de la capa de acetato de etilo, junto con 25 previamentecompuestos conocidos, incluyendocatorce flavonoides, una ionona, dos cumarinas, siete triterpenoides,y una acetofenona. La interpretación de los datos espectrométricos y espectroscópicos determinó sus estructuras.. Todos los compuestos aislados se evaluaron rápidamente usando un en líneaHPLC-ABTSensayo, y de estos, compuestos4–8, 11, 13, 15, y16 mostró claramenteefectos antioxidantes. ElLa cantidad de estos compuestos fue {{0}}.3–0.65 por ciento del extracto.

Palabras clave:Diospyros kaki; hojas de caqui; flavonoide; antioxidante

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1. Introducción

Diospyros kakiThunb. (caqui) pertenece a la familia de las Ebenaceae y es ampliamentedistribuido en Corea, China y Japón. Su fruto se come fresco o seco, mientras que las hojas tienenSe ha utilizado durante mucho tiempo como medicina tradicional para tratar el accidente cerebrovascular isquémico, la angina de pecho, la hipertensión,aterosclerosis y enfermedades infecciosas [1]. Además, sus hojas han sido aprovechadascomo bebidas saludables y cosméticos debido a sus propiedades anti-envejecimiento y capacidad paraayudar a prevenir la acumulación de colesterol y melanina [1]. Investigaciones recientes han sugeridoque los extractos de hojas de caqui poseen una amplia gama de propiedades biológicas,incluyendo barrido radical, neuroprotección, inhibición de la trombosis, antiaterosclerosis,y antialérgico [2–6]. Una investigación fitoquímica anterior sugirió que variostipos deflavonoidesy los terpenoides son los principales constituyentes [7], y varios taninos,También se informaron naftoquinonas, cumarinas, iononas y ácidos grasos.8–12]. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son moléculas reactivas producidas en sistemas biológicos,y el equilibrio entre la generación y eliminación de ROS está bien controlado en condiciones normalesfisiología celular [13]. Sin embargo, la generación excesiva de ROS causa daño oxidativo,y, a su vez, el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad, como el cáncer, la diabetes y el Parkinson.enfermedad [14]. Por lo tanto, descubrir antioxidantes como flavonoides y compuestos fenólicospodría ser una estrategia prometedora para el tratamiento de estas enfermedades.

Como parte de nuestro proyecto continuo para encontrar compuestos biológicamente activos [15], elefecto antioxidante del extracto de etanol (EtOH) y particiones de solventes del caquihojas se evaluó mediante el ensayo de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) y el análisis en línea de alto rendimientocromatografía líquida-2,20 -casino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico)(HPLC-ABTS) análisis. Un estudio fitoquímico en las hojas de caqui condujo al aislamientode un nuevo flavonoide (1), un nuevo compuesto natural (3), y25 anteriormentecompuestos conocidos. La aplicación de métodos espectroscópicos y espectrométricos caracterizó las estructuras. Todos los compuestos aislados fueron examinados rápidamente por suefectos antioxidantes usando HPLC-ABTS en línea. Además, el análisis cuantitativo detodos los compuestos aislados se realizó en el presente estudio.

2. Resultados y Discusión

2.1. Efecto antioxidante de las hojas de caqui

Se evaluó el efecto antioxidante del extracto etanólico (EtOH) de hojas de caquipara un tamizaje preliminar a través de DPPH (Figura1A). El 0.125 mg/mL de lael extracto eliminó aproximadamente el 80 por ciento del radical DPPH, mientras que 0,025 mg/mL de ácido ascórbicoel ácido constituía el 94 por ciento del radical. El ensayo en línea HPLC-ABTS se llevó a cabo para rápidamenteasegurar la confiabilidad de estos resultados (Figura1D). El ácido gálico y Trolox se utilizaron como internosestándares El cromatograma a 734 nm (pico negativo) sugirió que aproximadamentenueve constituyentes podrían tener actividades antioxidantes. Ácido gálico y Trolox (6-hidroxi- 2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílicoácido) se utilizaron como estándares internos para asegurar lafiabilidad de los resultados. Se infirió que la mayoría de estos picos eran derivados de flflavonoidescomo el glucósido flavonoide y el flavanol, según el análisis de desreplicación realizadocomparando los espectros ultravioleta (UV) y de masas de los compuestos con los publicadosdatos. El fraccionamiento guiado por bioensayo sugirió que estos compuestos antioxidantes eranabundante en la capa de acetato de etilo (EtOAc), mientras que el agua (H2O) capa mostró débilactividad (Figura1B,C). 

Figura 1. Efectos de eliminación de DPPH del extracto de EtOH (A), capa de EtOAc (B) y capa de HO (C) Capa de HhO de las hojas de caqui: (D) cromatograma ABTS-HPLC en línea del extracto de EtOH.

2.2. Investigación Fitoquímica

Para identificar estos compuestos antioxidantes, varios cromatográficos y espectroscópicosse llevaron a cabo métodos para el aislamiento y caracterización estructural de loscompuestos. Un nuevo flflavonoide (1) y un nuevo compuesto natural (3) se obtuvieron de lacapa de acetato de etilo del extracto de etanol, junto con 25 compuestos previamente informados,a saber, kaempferol-3-O- -2"-cumaroilglucósido (2) [16], ( más )-catequina (4) [17], hiperósido(5) [17], isoquercitrina (6) [18], quercetina-3-O- -2"-galoilgalactósido (7) [19], quercetina-3-O- -2"-galoilglucósido (8) [20], trifolina (9) [18], astragalina (10) [18], canferol-3-O- - 2"-galoilgalactósido (11) [21], canferol-3-O- -arabinósido (12) [22], canferol-3-O- - 2"-galoilglucósido (13) [23], quercetina-3-O- -2"-cumaroilglucósido (14) [24], quercetina(15) [15], kaempferol (16) [25], (6S,9S)-rosósido (17) [26], escopoletina (18) [27], umbeliferona(19) [28], 1-(2,4-dihidroxi-6-metilfenil)etanona (20) [29], ácido barbinérvico (21) [30], ácido diospírico B (22) [7], ácido rotungénico (23) [31], ácido pomólico (24) [32], ácido siaresinólico(25) [33], ácido oleanólico (26) [25], y ácido ursólico (27) [25] usando espectroscopia ydatos espectrométricos y físicos en comparación con los datos publicados y también con delgadaanálisis de cromatografía en capa (TLC) (Figuras2 y3). Entre estos, los compuestos2, 16, 17, 19, 20, y24 primero fueron aislados deD. kaki. 

El compuesto 1 se obtuvo como un polvo amarillo, en el que la fórmula molecular se estableció como C3olO3 en base a datos de espectrometría de masas de alta resolución (HRMS). El espectro mostró bandas de absorción a 207 y 315 nm, lo que indica que el compuesto 1 tenía un esqueleto de flavonol. Los datos de resonancia magnética nuclear (RMN) de 'H (Tabla 1, Figura S1) mostraron un patrón típico de glucósido de flavonol cumaroilado, mostrando dos conjuntos de señales de tipo AA'BB' ({{10}}.{{11 }} (2H, d, J= 8.5 Hz, H-2' y H-6 ),6,87 (2H, d, J{{20}} .5 HzH-3' y H-5')) en el anillo B de kaempferol así como las señales (0 7.45 (2H, d, J=8. 5 HzH-2 y H{{3{{104}}}}"), 6,81 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3 y H-5 por ciento) en el anillo aromático del grupo cumaroilo Dos señales de doblete (8H 7.65 (1H, d, J=15.5 Hz, H-7"") y 6.35 (1Hd, J=16.0 Hz, H-8"), indicando protones trans-olefínicos del grupo de países. Adicionalmente, una señal de protones anoméricos (0H 5.57 (1H, d, J=8.0 Hz, H-1) se observó en la región del azúcar, lo que sugiere la presencia del grupo de azúcar cíclico configurado en B. El 13C y la mejora sin distorsión por datos de RMN de transferencia de polarización (Iable 1Figura S2) mostró 30 resonancias que comprenden dos carbonos transolefínicos, diez carbonos aromáticos y seis carbonos de resto glucosilo, y diez carbonos no protonados que incluyen dos carbonos carbonilo. En particular, los cambios químicos en C-2, C-3 y C-4 (8c 158,1, 134,9 y 179,2) fueron señales características del flavonol3-0-glucósido. Además, la señal de carbono carbonílico en C-1" (8c 168,7) y dos señales de carbono transolefínico en C-2'" y C-3"(6 146.9 , 115.2) fueron cambios químicos típicos del grupo cumaroilo. La señal del carbono anomérico en C-1(6C 100.4) y otras señales para el resto glucosilo de C-2" a C-6" ' (6c74.3, 73.4, 70.5, 77.4 y 62.0). Estos datos de RMN unidimensional (1D) eran superponibles a los de kaempferol-3-0-B-2"-cumaroilglucósido (2) (16]. Sin embargo, la comparación cuidadosa de los datos de RMN de 13C entre los dos compuestos sugirió que el compuesto 1 tenía un resto de galactosa, lo que se demostró aún más mediante los datos de RMN de espectroscopía de mejora de Overhauser nuclear (NOESY) (Figura S6). Se observó H-2 y H-4 en el compuesto 2, no hubo correlación entre estos protones en el compuesto 1. En general, interpretar los datos de 13C NMR y NOESYNMR es un método eficaz para determinar el tipo de fracción glucosilo Se dedujo que la ubicación del resto de galactosa estaba en C-3 de acuerdo con el cambio de campo de C-2y C-4, como lo demuestra la correlación de enlaces múltiples heteronucleares (HMBCentre H{ {123}}" y C-3 (Figura S5). Se demostró que la posición del grupo cumaroilo está en C-2" según el cambio de campo (0 5.36 (1H, dd, J=10.0, 8.0 Hz, H{ {134}}")) y la correlación HMBC entre H-2' y C-1. Como resultado, la estructura del compuesto 1 se determinó como kaempferol-3-0-B-2"-cumaroilgalactósido. Aunque el compuesto 2 se aisló previamente de varias fuentes, incluidas Ouercus suber (16] y Alliumporrum (34), el compuesto 1 se aisló y caracterizó estructuralmente por primera vez.

Compuesto3 se aisló como un polvo amarillo y se estableció la fórmula molecularcomo C31H28O14 mediante el análisis de datos HRMS. El espectro UV mostró UVabsorción a 210 y 327 nm debido a la misma aglicona con compuestos1 y2. El1H Datos de RMN (Tabla1, Figura S10) eran similares a los del compuesto2, pero compuesto3 tenía un grupo feruloilo en lugar del grupo cumaroilo, como lo demuestra la presencia de ungrupo metoxi adicional (δH 3.91 (3H, s, 3000 -OCH3)). Además, un protón anoméricoseñal (δH 5.64 (1H, d, J {{0}},0 Hz, H-100 )), lo que indica que el enlace glucosiloera un-configuración, y la señal desplazada campo abajo (5.03 (1H, t,J = 8.5 Hz, H-200 )) se mostró en la región del azúcar, como con el compuesto1. El13Datos de C NMR (Tabla1, CifraS11) mostró 31 resonancias que comprenden dostrans-carbonos olefínicos, diez carbonos cuaternarios,diez carbonos aromáticos, seis carbonos del resto glucosilo y un carbono metoxi, y diez carbonos no protonadoscarbonos, incluidos dos carbonos carbonílicos correspondientes a kaempferol, feruloil,y grupos de glucosa. En particular, las señales de carbono de C-200 a C-600 (δC 75.8, 76.3, 71.5, 78.8 y 62.5) sugirió la presencia de un resto de glucosa. Las ubicaciones de la fracción de glucosa.y el grupo feruloilo fueron asignados por las correlaciones HMBC de largo alcance entre H-100 yC-3 (δC 134.8) y H-200 y C-1000 (δC 168.4) (Figura S14). La posición de un adicionalgrupo metoxi fue determinado por la correlación clave entre 3000 -OCH3 y C-3000 (δC 149.4). Los resultados anteriores sugirieron la estructura del compuesto3 como kaempferol-3-O- - 2"-feruloil glucósido. Hasta donde sabemos, el compuesto3 solo fue reportado como unproducto de la hidrólisis de 3-O- -(2-O-feruloil)-glucosil-7,40 -di-O- -glucosil kaempferol, aislado deAllium tuberosum[35]. Por lo tanto, la estructura de3 fue dilucidado como un nuevocompuesto natural

Compuesto11 fue aislado como un polvo amarillo. El1Datos de RMN H (Figura S19)mostró un conjunto de AA0 CAMA Y DESAYUNO0 señales de tipo (δH 8.06 (2H, d, J {{0}},0 Hz, H-20 , H-60 ), 6.87 (2H, d, J {{0}}.0Hz, H-30, H-50 )) en el anillo B de kaempferol y una señal singlete enδH 7.02 (2H, s, H-3000 , H-7000 ) de un resto galoílo en la región aromática, que es una señal característicadel flavonol asignado. Una señal de protones anoméricos (δH 5.78 (1H, d, J {{0}},0 Hz, H-100 )) indicó que el enlace glucosilo era un-configuración. Además, un campo abajoseñal de protones desplazada (5.27 (1H, t,J = 9.5 Hz, H-200 )) sugirió que el grupo galoíloestaba unido al grupo hidroxilo de C-200 porque este cambio podría atribuirse ala influencia anisótropa de laO-fracción galoílo [21]. El13Datos de C NMR (Figura S20)exhibió 26 resonancias, lo que indica un glucósido de flavonol asignado. Las señales de carbonode C-200 a C-600 (δC 71.1, 72.7, 68.2, 76.0 y 60.1) sugirieron la presencia de una galactosamitad. Por lo tanto, la estructura del compuesto11 fue confirmado como kaempferol-3-O- -200 - galoilgalactósido. Aunque compuesto11 fue aislado previamente de varias fuentes,incluidoD. kaki[21,36], Solo el1Los datos de H NMR y MS se informaron previamente. De este modo,el13Los datos de C NMR se informaron por primera vez en este estudio

2.3. Actividades antioxidantes de los compuestos aislados

Todos los compuestos aislados fueron evaluados por sus efectos antioxidantes utilizandolínea de análisis HPLC-ABTS para determinar qué compuestos contribuyeron al efecto antioxidanteefecto de las hojas de caqui. Compuestos4–8, 11, 13, 15, y16 mostró potente antioxactividades idativas (Figura4). La mayoría de estos compuestos eran kaempferol y quercetina.derivados, pero algunos derivados (1–3, 9, 10, 12, y14) no mostró actividades. ElLa relación estructura-actividad no se determinó completamente, pero se reveló parcialmente. Enen particular, quercetina y kaempferol con fracciones de galoílo (7, 8, 11, y13) se encontrarontienen actividades potentes, pero aquellos con fracciones de cumaroilo o feruloilo (1–3 y16) Nomostrar cualquier actividad.

Figura 4.Actividades de captación de radicales de los compuestos aislados (4–8, 11, 13, 15, y16) fueron evaluados en líneaEnsayo HPLC-ABTS.

2.4. Análisis Cuantitativo de Compuestos Aislados

El análisis cuantitativo de todos los compuestos aislados en el extracto soluble en EtOAcse realizó para confirmar que los efectos antioxidantes de las hojas de caqui podrían sercausada por estos compuestos activos. Un método específico de HPLC con detección de matriz de diodos yEl detector de dispersión de luz evaporativa fue desarrollado para la determinación simultáneade 27 compuestos. El contenido de todos los triterpenoides aislados fue de aproximadamente 5.9 por ciento deel extracto, y de éstos, los de ácido siaresinólico (25), ácido oleanólico (26), y ursólicoácido (27) representó una porción significativa, como se informó en estudios previos [7]. Elcontenido de flavonoides fue de aproximadamente 5,4 por ciento, y de estos, los de compuestos activosfueron 3.2 por ciento (Cuadro2). En particular, el contenido de kaempferol-3-O- -200 -galoilgalactósido(9), kaempferol-3-O- -2"-galoilglucósido (10), isoquercitrina (13), y quercetina-3-O- -2"- galoilglucósido (15) fueron más del 0.3 por ciento. El método analítico se verificó mediante unprocedimiento de validación simple para asegurar la pertinencia del método, que mostró una adecuadaespecificidad, linealidad, exactitud y precisión.

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