Los glucósidos totales de Cistanche Deserticola promueven la recuperación de la función neurológica al inducir la regeneración neurovascular a través de la vía Nrf- 2/Keap-1 en ratas MCAO/R

Fondo:

Se ha informado que la medicina tradicional china Cistanche deserticola es válida para enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares. Sin embargo, sus componentes activos para la protección del ictus isquémico no están claros. Nuestro objetivo fue explorar los componentes activos de C. deserticola contra el accidente cerebrovascular isquémico, así como sus posibles mecanismos.

Métodos:

Investigamos los efectos protectores del cerebro de extractos de C. deserticola, glucósidos totales (TG), polisacáridos (PS) y oligosacáridos (OS) en un modelo de rata de oclusión-reperfusión de la arteria cerebral media (MCAO/R). 2, 3, 5-Se utilizó la tinción con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) para evaluar el volumen del infarto cerebral y se adoptó el ensayo con azul de Evans para evaluar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB). Entonces, las expresiones CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin, Keap-1 y Nrf{{ 13}} se analizaron mediante transferencia Western o inmunofluorescencia, y las actividades MDA, SOD, CAT y GSH-Px se analizaron mediante kits.

Resultados:

El tratamiento con TG redujo notablemente las puntuaciones de déficit neurológico y los volúmenes de infarto, promovió la angiogénesis y la remodelación neural, y mantuvo de manera efectiva la integridad de la barrera hematoencefálica en comparación con el grupo modelo. Además, los TG redujeron significativamente los niveles de MDA y aumentaron las actividades antioxidantes (SOD, CAT y GSH-Px) en el cerebro. Mientras tanto, los TG redujeron notablemente la expresión de Keap-1 y facilitaron la translocación nuclear de Nrf-2. Por el contrario, no se observaron efectos protectores para los grupos de PS y OS.

Conclusión:

Los TG son los principales componentes activos de C. deserticola contra la lesión cerebral inducida por MCAO/R, y la protección se realiza principalmente a través de la vía Nrf-2/Keap-1.

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INTRODUCCIÓN

Los accidentes cerebrovasculares se consideran una de las principales causas de muerte y discapacidad en el mundo (Donnan et al., 2008). Casi el 87 por ciento de todos los casos de accidente cerebrovascular son provocados por un accidente cerebrovascular isquémico (Ovbiagele y Nguyen-Huynh, 2011). Actualmente, el agente más eficaz y el único fármaco aprobado por la FDA que se usa para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico es un activador del plasminógeno tisular recombinante. Sin embargo, una gran cantidad de pacientes con accidente cerebrovascular no responden a este fármaco, debido a su estrecha ventana de tiempo terapéutico y al grave riesgo de complicaciones hemorrágicas (Lee et al., 2012; Schellinger y Kohrmann, 2014). Un desafío importante del tratamiento trombolítico es la lesión por isquemia/reperfusión (I/R), que se considera una causa principal de lesión cerebral y destrucción de la función. La reperfusión después de la isquemia cerebral aumenta el riesgo de una hemorragia cerebral al tiempo que conduce a una lesión neurovascular y produce un exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS) que dañan la barrera hematoencefálica (Alluri et al., 2015). Varios estudios han confirmado que la interrupción de la BBB es una de las principales causas de la patogenia del accidente cerebrovascular isquémico (Cao et al., 2016b).

La BBB consiste principalmente en células endoteliales, pericitos, astrocitos, neuronas y membranas basales. Los componentes centrales de la BBB son células endoteliales microvasculares cerebrales que están unidas por uniones estrechas, restringiendo así las moléculas exógenas en el cerebro. Las alteraciones patológicas de las uniones estrechas, en particular la ocludina, la claudina-5 y la zonula occludens-1 (ZO-1), afectan significativamente la función de la BBB durante un accidente cerebrovascular isquémico, especialmente la permeabilidad de la barrera (Liu et al. al., 2014; Hu et al., 2018; Liu et al., 2019). Durante los períodos de I/R, el exceso de ROS es uno de los principales factores que conducen al daño directo de las neuronas cerebrales (Ding et al., 2014). La sobreproducción de ROS conduce a la degradación de ciertas uniones y la interrupción de la BBB, lo que da como resultado que moléculas exógenas ingresen al cerebro a través de la BBB, lo que provoca un agravamiento del daño cerebral (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Por lo tanto, la protección de la BBB por antioxidantes se ha considerado como una forma potencial de prevenir la lesión por reperfusión.

Además de la ruptura de la BHE, la I/R puede provocar lesiones neurovasculares y muerte neuronal (Jung et al., 2010). Durante un accidente cerebrovascular, el aumento de la muerte de las células neuronales puede resultar del estrés oxidativo (Chi et al., 2018), y numerosos estudios han demostrado que las ERO agravan la gravedad del accidente cerebrovascular y el daño neurológico (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Grieta et al., 2006). Aunque los ensayos clínicos no han obtenido resultados satisfactorios, la neuroprotección sigue siendo una estrategia prometedora para el tratamiento del ictus isquémico agudo (Moretti et al., 2015). Por lo tanto, encontrar fármacos neuroprotectores efectivos para tratar los accidentes cerebrovasculares es un beneficio para los pacientes con accidentes cerebrovasculares.

La medicina tradicional china (MTC) toma medidas para intervenir contra el desequilibrio interno del cuerpo (Gaire, 2018). Debido a la patogenia compleja de los accidentes cerebrovasculares isquémicos, el efecto multifactorial de la MTC y sus componentes activos desempeñan un papel fundamental en el tratamiento de los accidentes cerebrovasculares. La Cistanche deserticola YC Ma, extendida en áreas áridas o semiáridas de Mongolia y el noroeste de China, ha sido una hierba de la medicina tradicional china ampliamente utilizada para el tratamiento de diversas enfermedades, como el olvido y la depresión, durante más de 1,000 años en China . Los estudios farmacológicos modernos indicaron que los extractos crudos de C. deserticola mostraron múltiples actividades farmacológicas, como mejorar la función de aprendizaje y memoria, neuroprotección, mejorar la inmunidad, efectos antioxidantes, antienvejecimiento y antifatiga (Ko y Leung, 2007; Wang et al. , 2012; Li et al., 2015). El análisis químico de C. deserticola mostró que sus componentes principales incluyen glucósidos feniletanoides, glucósidos iridoides, polisacáridos y oligosacáridos (Jiang y Tu, 2009). Sin embargo, los componentes activos de C. deserticola para la protección del cerebro no están muy claros.

La propiedad neuroprotectora de C. deserticola implica su potencial terapéutico en enfermedades cognitivas como el accidente cerebrovascular y la depresión, así como la enfermedad de Alzheimer (Wang et al., 2017). Sin embargo, la investigación sobre el impacto de C. deserticola en los accidentes cerebrovasculares, incluidos sus componentes activos y mecanismos de acción, es muy limitada.

En el trabajo actual, exploramos el efecto protector de tres extractos de C. deserticola, glucósidos totales (TG, glucósidos feniletanoides y otros glucósidos), polisacáridos (PS) y oligosacáridos (OS) sobre lesiones cerebrales por I/R. Nuestros hallazgos pueden contribuir a la aplicación clínica precisa de C. deserticola y proporcionar un agente candidato para la terapia del accidente cerebrovascular isquémico.

MATERIALES Y MÉTODOS

Sustancias químicas y reactivos

Los tallos de Cistanche deserticola fueron comprados en Alashan, Mongolia Interior, e identificados por uno de los autores (P.-F. Tu). Los TG, PS y OS se prepararon de acuerdo con nuestro método informado anteriormente (Gao et al., 2015). El análisis cuantitativo de los TG se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) como se describió anteriormente (Li et al, 2019), y su cromatograma se muestra en la Figura 1. Los principales componentes de los TG son equinacósido, tubulosido A, acteoside, isoacteoside, y 2'-acetilacteosido; sus contenidos son 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g y 12,045 mg/g, respectivamente. Los contenidos de PS y OS son 69,42 % y 65,24 %, respectivamente, según lo determinado por HPLC y el análisis de ácido fenol-sulfúrico, respectivamente (Zhang A. et al., 2018; Shi et al, 2019).

The standard references of echinacoside (A0282), tubuloside A (A0942), acteoside (A0280), isoacteoside (A0281), and 2'- acetylacteoside (A0943) were purchased from Chengdu Must Biotechnology (Sichuan, China). The purities of all standards are more than 98 percent . Nissl stain H&E kits were bought from Boster (Wuhan, China). Edaravone (T0407-1) was bought from Target Mol (Shanghai, China). Rabbit anti-rat MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620), and mouse anti-rat CD31 (ab24590) were purchased from Abcam Inc (Cambridge, MA, USA). Rabbit anti-rat Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M), and Occludin (BS72035) were bought from Bioworld Technology (Nanjing, China). Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) was the source of rabbit anti-rat Synapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) was purchased from Proteintech Group, Inc. (Chicago, USA).

Los anticuerpos secundarios fueron suministrados por Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, China). Hoechst 33258 se obtuvo de Beyotime (Jiangsu, China).

animales

Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley (macho, con un peso de 250 a 300 g) de Vital River Laboratory Animal Technology (Beijing, China) y se alojaron en una habitación con aire acondicionado en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Todos los experimentos con animales se realizaron según las pautas ARRIVE de investigación con animales (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín (LA2019123).

Protocolos de Experimentación Animal

Las ratas se sometieron a MCAO/R, como se describió anteriormente (Wang et al., 2018). Brevemente, se expusieron la arteria carótida común izquierda (CCA), la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida interna (ICA), y se insertó una sutura de monofilamento de nailon 3-0 desde la ECA hasta la ACI hasta llegar a la mitad arteria cerebral (ACM). Después de 1,5 horas de oclusión de la ACM, se simuló la reperfusión retirando el filamento. Durante el procedimiento quirúrgico, la temperatura corporal de todas las ratas se mantuvo a 37,0 grados.

Administración de Drogas

Las ratas se separaron aleatoriamente en seis grupos utilizando el software SPSS versión 22.0 como se describe (Jiang et al., 2014): grupo normal (NOR); grupo modelo (MOD); grupo de edaravona (fármaco positivo, 6 ml/kg, EDI); grupo TG (280 mg/kg, TG); grupo de PS (280 mg/kg, PS) y grupo de OS (280 mg/kg, OS). Los TG, PS y OS se administraron una vez al día después de MCAO/R durante 14 días. Los grupos NOR y MOD fueron tratados con solución salina normal. Los números de animales se muestran en la Tabla 1.

Medición de Peso y Puntajes de Déficit Neurológico Modificado (NSS)

El peso corporal se controló el día 14 utilizando una báscula digital ADVENTURE™ (OHAUS, Nueva Jersey, EE. UU.). La masa se evaluó según el método descrito por FJ Wang (Wang et al., 2018), con revisiones menores.

Tinción con cloruro de 2, 3, 5-trifeniltetrazolio (TTC)

El volumen del infarto se midió como se describió anteriormente (Wang et al., 2015). En resumen, los cerebros se seccionaron en siete bloques coronales igualmente espaciados (2 mm). Estas secciones se tiñeron con TTC al 2 por ciento (Coolaber, Beijing, China) a 37 grados durante 15 min. Volumen del infarto (porcentaje)=(volumen del hemisferio isquémico ipsilateral −volumen del hemisferio isquémico contralateral)/volumen del hemisferio isquémico contralateral × 100.

Tinción Nissl y H&E

Las ratas se anestesiaron profundamente y luego se extrajo rápidamente todo el cerebro del cráneo y se fijó con paraformaldehído al 4 por ciento, se incrustó en cera de parafina y se seccionó en rodajas de 7 µm de espesor. Las secciones se tiñeron con Nissl y H&E. En este estudio, se capturaron seis campos aleatorios de 200 × 200 µm en cada muestra de tejido con un microscopio óptico. El número de cuerpos de Nissl se contó con el software IPP versión 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, EE. UU.).

Ensayo azul de Evans

A las ratas se les inyectó EB al 2 por ciento (Coolaber Science & Technology Co., LTD) después de MCAO/R. Dos horas más tarde, se anestesiaron las ratas y luego se extrajo rápidamente todo el cerebro y se homogeneizó en acetona. Los sobrenadantes se analizaron a 620 nm con un lector de absorbancia 800 TS (BioTek, EE. UU.).

Medición de las actividades de catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD), malondialdehído (MDA) y glutatión peroxidasa (GSH-Px)

Todas las muestras de suero se centrifugaron a 4,000 × rpm durante 15 min a 4 grados y luego se analizaron para detectar las actividades de MDA, CAT, SOD y GSH-Px siguiendo las instrucciones del fabricante (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, China).

Análisis de transferencia Western

Los tejidos cerebrales (100 mg) recogidos de cada rata se homogeneizaron y lisaron en tampón de lisis RIPA y luego se analizaron para detectar la concentración de proteína usando un kit BCA (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.). Las proteínas totales del tejido se cargaron en geles SDS-PAGE al 10 por ciento y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó usando leche descremada al 5 por ciento, luego se incubó durante la noche con anticuerpos primarios a 4 grados. A continuación, la membrana se incubó con un anticuerpo secundario. El análisis de transferencia Western se analizó utilizando el sistema de imágenes digitales Kodak (5200 Multi, Tanon, China).

Análisis inmunofluorescente

Se realizaron tinciones de inmunofluorescencia para CD31, a-SMA, ZO-1, claudina5, ocludina, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 y Keap-1. Los anticuerpos primarios contra Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 y Keap-1 se diluyeron a 1 :200 y 1:100, respectivamente. Los anticuerpos secundarios de IgG anti-conejo de ratón Alexa Flur 488 y IgG anti-conejo de cabra rodamina (TRITC) se diluyeron a 1:200. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33258. Las imágenes se capturaron con el sistema de imágenes de patología cuantitativa automatizada Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, EE. UU.). La expresión de la proteína se analizó utilizando el software IPP versión 6.0.

Análisis estadístico

Todos los datos se describieron como media ± DE. Se realizó el software SPSS versión 22.0 para el análisis estadístico. Se utilizó ANOVA de una vía al comparar diferentes grupos. Se consideró que P < 0.05 era la diferencia estadística.

RESULTADOS

Los TG aumentan el peso corporal y reducen los daños cerebrales en ratas MCAO/R

Después de 14 días de curación con TG, PS, Oss y EDI, se evaluaron los pesos corporales, los déficits neurológicos y los volúmenes de infarto de las ratas I/R. Los resultados mostraron que los pesos corporales en el grupo MOD se redujeron considerablemente, mientras que los pesos disminuidos en los grupos TG, PS y EDI aumentaron (Figura 2A). Las puntuaciones de déficit neurológico se redujeron sustancialmente por EDI y TG (Figura 2B). Los cortes de cerebro en las ratas del grupo NOR eran de color rojo oscuro y no hubo infartos, mientras que las ratas del grupo MOD mostraron un gran infarto cerebral ipsilateral. Después del tratamiento con TG, los volúmenes de infarto se redujeron significativamente (Figuras 2C, D). El tratamiento con PS y OS no mostró ningún efecto evidente sobre los índices anteriores. Los datos anteriores mostraron que los TG podrían aliviar notablemente la lesión cerebral inducida por I/R, pero los PS y los OS no.

Los TG mejoran el daño histopatológico en ratas MCAO/R

Para determinar algunos de los efectos del tratamiento con TG, PS y OS sobre el daño histopatológico, se realizó una tinción con H&E para revelar el daño patológico. Las estructuras histomorfológicas de los cerebros del grupo NOR se organizaron con regularidad. Los cambios de morfología en los grupos TG fueron más leves que en el grupo MOD. Sin embargo, los grupos de tratamiento con PS y OS no mostraron una mejora significativa de los cambios morfológicos (Figura 3).

Los TG atenúan la lesión neuronal después de ratas inducidas por I/RI

La tinción de Nissl mostró los cambios histopatológicos de las neuronas en la penumbra del área isquémica. Como se muestra en la Figura 4, las neuronas normales tenían un nucléolo claro y una estructura intacta. En el grupo MOD, las neuronas tenían espacios intercelulares agrandados. Los hermosos cuerpos desaparecieron, encogidos y profundamente manchados. Sin embargo, estos cambios rara vez se observaron en los grupos EDI, TG y PS. Estos resultados ilustraron que los TG y los PS podrían atenuar significativamente la lesión neuronal inducida por isquemia/reperfusión.

Los TG atenúan la interrupción de BBB después de ratas tratadas con I/RT

El ensayo azul de Evans es un método clásico para investigar el cambio de la permeabilidad de BBB. Los resultados del experimento mostraron que se observó un aumento del azul de Evans en el grupo MOD, mientras que hubo una disminución significativa del azul de Evans en las ratas tratadas con TG y EDI. Además, no hubo diferencias significativas entre los grupos de terapia con PS y OS (Figura 5). Estos resultados sugirieron que los TG podrían atenuar significativamente la interrupción de BBB.

Los TG promueven la angiogénesis en ratas lesionadas por I/R

Estudios más recientes muestran que la angiogénesis desempeña un papel fundamental en la recuperación funcional neurológica y los resultados pronósticos después de un accidente cerebrovascular isquémico agudo (Yuen et al., 2015). Para evaluar los efectos de los TG, PS y OS en la angiogénesis, se utilizaron CD31 y a-SMA para cuantificar el número de capilares. La tinción de inmunofluorescencia mostró que el grupo MOD causó una disminución notable en las expresiones de CD31 (Figuras 6A, B) y aSMA (Figuras 6C, D) en la penumbra de áreas isquémicas de ratas I/R, en comparación con las ratas normales. Este resultado ilustró que I/R podría causar daño vascular en la penumbra de la corteza de los hemisferios isquémicos. Sin embargo, el tratamiento con TG y EDI aumentó notablemente la densidad capilar, la angiogénesis y la arteriogénesis como lo indica el aumento de las expresiones de CD31 y a-SMA. Estos resultados sugieren que los TG podrían promover la angiogénesis en la penumbra isquémica de las ratas I/R, pero los PS y OS no.

Los TG aumentan la expresión de proteínas de unión estrecha en ratas lesionadas por I/R

La interrupción de BBB puede elevar el contenido de agua del cerebro y la inflamación del tejido, lo que provoca una lesión cerebral. Las proteínas de unión estrecha son componentes estructurales importantes de la BHE (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Para probar si el tratamiento con TG, PS y OS después de un accidente cerebrovascular podría influir en la integridad de la BBB, las expresiones de ZO-1, claudina-5 y ocludina se realizaron mediante análisis de inmunofluorescencia. Los resultados indicaron que las expresiones de claudina-5, ocludina y ZO-1 se redujeron visiblemente en el grupo MOD. Sin embargo, se incrementaron sustancialmente después de 14 días de su administración. Los grupos de PS y OS no mostraron cambios significativos en estas expresiones de proteínas (Figura 7). Estos datos indicaron que los TG podrían regular las expresiones de proteínas de unión estrecha y mantener la integridad de BBB después de una lesión por I/R.

Los TG aumentan la cobertura de pericito en los capilares en ratas lesionadas por I/R

La cobertura de pericitos en los capilares juega un papel fundamental en el mantenimiento de la integridad de la BHE (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Por lo tanto, probamos si la cobertura de pericitos podría aumentar con el tratamiento con TG, PS y OS. Los resultados del análisis de intensidad de inmunofluorescencia mostraron que las expresiones tanto de PDGFRb como de CD31 se redujeron drásticamente en el grupo MOD. La administración de TG a las ratas I/R recuperó significativamente o incluso aumentó las intensidades de expresión de PDGFRb y CD31, pero no se observaron diferencias en los grupos de tratamiento con PS y OS (Figura 8). Por lo tanto, el tratamiento de los TG podría aumentar significativamente la cobertura de pericitos. Estos hallazgos confirmaron además que los TG pueden mantener la integridad de BBB después de I/R.

Los TG promueven la remodelación neural en ratas lesionadas por I/R

Según numerosos estudios, la neurogénesis tras un ictus puede mejorar significativamente la recuperación funcional (Grefkes and Ward, 2014; Zhang et al., 2019). La sinaptofisina (SYN), las proteínas de densidad postsináptica 95 (PSD-95) y la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP-2) se utilizaron como marcadores para examinar la plasticidad neuronal en la penumbra isquémica de la corteza. Para evaluar los efectos del tratamiento con TG, PS y OS en la neurogénesis en ratas lesionadas por I/R, se realizaron la inmunofluorescencia y el western blot para las expresiones SYN, PSD95 y MAP-2. Como se muestra en las Figuras 9 y 10, los niveles de expresión de SYN, PSD95 y MAP-2 en ratas I/R después de 14 días de reperfusión disminuyeron en comparación con las ratas NOR, mientras que la cura de TG y PS podría aumentar significativamente. regular sus niveles de expresión. El grupo de OS no tuvo cambios significativos en comparación con el grupo MOD. Los datos indicaron que la cura de TG y PS fue capaz de promover drásticamente la remodelación neural después de una lesión por I/R.

TGs Alter Nrf-2 y Keap-1 Expresiones en Ratas I/R Heridas

El estrés oxidativo es el principal mecanismo patogénico en la lesión por I/R (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Los estudios verificaron que Nrf-2 es un regulador maestro de las respuestas antioxidantes (Thompson et al., 2015). Para investigar las respuestas oxidativas mediadas por Nrf-2 y Keap-1 después de la lesión por I/R, evaluamos la expresión citoplasmática y la translocación nuclear de Keap-1. Mientras tanto, también se ensayó la expresión de Nrf-2 en tejidos cerebrales de ratas lesionadas por I/R (Figuras 10 y 11). Según el análisis de inmunofluorescencia, se encontró que Nrf-2 estaba principalmente ubicado en el citoplasma en el grupo NOR. En el grupo de TG, la expresión de Nrf-2 en la localización citoplasmática estaba regulada negativamente, pero aumentaba en el núcleo, y también se observó una expresión disminuida de Keap-1. Los datos mostraron que la protección cerebral de los TG podría estar asociada con la modulación de Nrf-2 y Keap-1.

Los TG atenúan el estrés oxidativo del tejido cerebral en ratas lesionadas por I/R

Para confirmar los efectos antioxidantes de los TG, se evaluaron las actividades de SOD, CAT, GSH-Px y MDA en ratas lesionadas por I/R. En la Figura 12, el contenido de MDA aumentó notablemente en el grupo MOD y, al mismo tiempo, las actividades de SOD, CAT y GSH-Px disminuyeron, en comparación con las ratas normales. Por el contrario, el tratamiento con TG provocó una disminución significativa del contenido de MDA y un aumento de las actividades de SOD, CAT y GSH-Px. Estos resultados confirmaron aún más la actividad antioxidante de los TG.

DISCUSIÓN

Muchos estudios sugieren que la MTC C. deserticola tiene amplias actividades biológicas, por ejemplo, mejora la capacidad de aprender, la memoria y la inmunidad (Dong et al., 2007; Jiang y Tu, 2009; Wang et al., 2017; Xia et al., 2018). Sin embargo, los componentes activos de C. deserticola para la neuroprotección siguen sin estar claros. El trabajo actual tiene como objetivo evaluar los componentes activos de C. deserticola contra el accidente cerebrovascular isquémico en el modelo MCAO/R. Se utilizaron tres extractos de C. deserticola (TG, PS y OS) para evaluar sus efectos en ratas MCAO/R, así como los posibles mecanismos. El accidente cerebrovascular es una enfermedad cerebrovascular aguda frecuente. Los estudios epidemiológicos muestran que el accidente cerebrovascular es más común en hombres que en mujeres (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik y Bushnell, 2017).

Así, en nuestro experimento, se adoptaron ratas macho para las pruebas. Nuestros resultados demostraron que la inducción de I/R aceleró el estrés oxidativo y el volumen del infarto, rompiendo la BBB y provocando lesiones nerviosas y cerebrovasculares. Después de la selección, se encontró que los TG disminuyen el volumen del infarto y promueven la angiogénesis y la remodelación neural. Además, se observó que los TG mantienen la integridad de BBB después de la lesión por I/R. Por el contrario, los PS y los OS no alivian significativamente el daño por I/R. Por lo tanto, los TG se consideran la principal fracción activa de C. deserticola para la neuroprotección, potencialmente a través de la promoción de la remodelación neuronal, la angiogénesis y la integridad de BBB a través de la activación de la vía Nrf2/Keap-1.

La creciente evidencia indica que el establecimiento de circulación colateral efectiva es significativamente importante para evitar la formación de infarto y penumbra isquémica, y es un tratamiento crítico en una etapa temprana del accidente cerebrovascular isquémico (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). La proliferación de células endoteliales vasculares y de células musculares lisas tras un infarto isquémico determina el establecimiento de circulación colateral.

Sin embargo, los modelos de isquemia tienen un fenómeno común: el estrés oxidativo existía ampliamente en la microvasculatura cerebral. Los datos del estudio han demostrado que una gran cantidad de antioxidantes pueden alterar la función de la BHE y las propiedades de la angiogénesis (Mentor y Fisher, 2017). CD31 y a-SMA son los marcadores de las células endoteliales vasculares y de las células del músculo liso, respectivamente (Saboor et al., 2016). Para investigar el efecto de la proliferación celular mencionada anteriormente de los extractos de C. deserticola, examinamos las expresiones de CD31 y a-SMA en el homogeneizado de penumbra isquémica cerebral. Nuestros datos mostraron que los TG mejoraron notablemente las expresiones de CD31 y a-SMA. Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre los grupos de PS y OS. Por lo tanto, deducimos que los TG pueden reducir el daño cerebral al promover la angiogénesis mediante el aumento de las expresiones de CD31 y a-SMA, mientras que los PS y los OS no proporcionaron tal protección contra el daño cerebral. Estos resultados confirmaron además que solo los TG podrían prevenir la lesión por I/R cerebral.

Se puede considerar que el accidente cerebrovascular isquémico es el resultado de una isquemia cerebral causada por un deterioro en la plasticidad neuronal o la remodelación de áreas del cerebro. La mayoría de los pacientes con accidente cerebrovascular sufren de déficits neurológicos. La activación de la neurogénesis es una estrategia prometedora para que los pacientes con accidente cerebrovascular mejoren sus funciones neurológicas (Cramer y Chopp, 2000). La neurogénesis participa directamente en la recuperación de la función neurológica después de una lesión cerebral por I/R (Zhang et al., 2019). Investigaciones anteriores muestran que los TG pueden mejorar la tasa de supervivencia de las células piramidales del hipocampo e inducir la neurogénesis (Lian et al., 2017). El estrés oxidativo provoca la pérdida de neuronas durante muchas enfermedades, como el Parkinson, los accidentes cerebrovasculares, etc. (Duan y Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2 transcribe muchos genes relacionados con la neuroprotección en su región promotora, incluidos principalmente SOD, MDA, CAT y glutamil cisteína ligasas, etc. (Satoh et al., 2006). Las proteínas SYN, PSD-95 y MAP-2, que están estrechamente asociadas con la formación sináptica y la neurotransmisión, pueden considerarse marcadores de plasticidad neuronal de investigación en la región de penumbra isquémica. Después de estudiar, encontramos que la cura con TG podría aumentar significativamente las expresiones de PSD95, SYN y MAP-2, lo que indica que la protección cerebral de los TG se correlacionó con una mayor plasticidad neuronal durante I/R. Sin embargo, es una pena que no haya una diferencia obvia entre los grupos de PS y OS. Estos resultados indicaron que los TG podrían mejorar la neuroplasticidad después de una lesión por I/R cerebral.

La investigación de imágenes en pacientes con accidente cerebrovascular mostró que la disfunción BBB puede considerarse como un atributo sorprendente del cerebro perisquémico (Bang et al., 2007). Los TJ, que están compuestos por proteínas citoplásmicas, proteínas transmembrana y moléculas de adhesión de unión entre las células endoteliales capilares, son muy importantes para mantener la integridad de la BHE (Ye et al., 2019). Entre ellas, ZO-1, claudina-5 y ocludina son las proteínas más importantes en las TJ. La creciente evidencia indica que el aumento de la permeabilidad de la BBB inducida por la isquemia generalmente se correlaciona con las alteraciones de ZO-1, claudina-5 y ocludina (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al., 2017; Liu et al., 2018).

En este trabajo, los resultados demostraron que aunque los TG podrían aumentar significativamente las expresiones de las proteínas ZO-1, claudina-5 y ocludina en los tejidos cerebrales inducidos por MCAO, ni los PS ni los OS lo hicieron. La BBB consiste en células endoteliales cerebrales y está estrechamente asociada con los pericitos (Nyul-Toth et al., 2016). Los pericitos son vitales para la integridad de la BHE (Bell et al., 2010). El accidente cerebrovascular isquémico desencadena la muerte de los pericitos y el desprendimiento de las células endoteliales del cerebro en la fase aguda, lo que desestabiliza la microvasculatura y altera las propiedades de la BBB (Zechariah et al., 2013). Nuestros datos mostraron que los TG podrían aumentar la cobertura de pericitos en los capilares y aumentar los niveles de expresión de ZO-1, claudina-5 y ocludina. Estos fenómenos demostraron que los TG podían proteger eficazmente la integridad de la BBB después de una lesión por I/R cerebral. En resumen, los TG pueden atenuar la lesión cerebral de múltiples maneras, como promover la angiogénesis, mejorar la plasticidad neuronal y mantener la integridad de la BHE.

Luego investigamos la vía de señalización para explorar el mecanismo subyacente a la protección cerebral de TG. El proceso de lesión por I/R es multifactorial y, por lo tanto, numerosos mecanismos están involucrados en la patogenia. El estrés oxidativo es un factor de riesgo fundamental que contribuye a la lesión cerebral inducida por I/R (Suda et al., 2013), como el daño de la estructura BHE, la disfunción del endotelio vascular y el agravamiento de la lesión neuronal isquémica (Xiong et al., 2015; Caglayan et al., 2019; Priestley et al., 2019).

Por lo tanto, el estrés oxidativo se ha convertido en un objetivo terapéutico atractivo en la lesión cerebral inducida por I/R. Las enzimas de fase 2, que están mediadas por el factor nuclear E2-relacionado con el factor-2 (Nrf-2), se han considerado un medio importante por el cual las neuronas se protegen contra el estrés oxidativo (Suzuki y Yamamoto , 2015; Ya et al., 2018). La creciente evidencia indica que la activación de Nrf-2 durante la I/R es un objetivo terapéutico potencial para la neuroprotección (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, como importante regulador de la defensa antioxidante endógena, media el nivel de hemooxigenasa 1 (HO-1) y otras enzimas antioxidantes, como NAD(P)H quinona oxidorreductasa 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH y MDA (Siow et al., 2007; Ding et al., 2014). Además, Nrf-2 juega un importante papel regulador en la angiogénesis. El presente estudio muestra que Nrf-2 puede mejorarse y activarse significativamente en el proceso de desarrollo vascular (Wei et al., 2013).

Como se describió anteriormente (Jiang y Tu, 2009), los TG contienen muchos compuestos bioactivos, por ejemplo, equinacósido, tubulosido A, acteósido, isoactósido y 2'-acetilactósido, y algunos de ellos mostraron funciones neuroprotectoras después de una lesión por I/R cerebral ( Peng et al., 2016). El echinacósido tiene muchos efectos farmacológicos, como la oxidación, la antisenescencia, la neuroprotección, la antiinflamación, la promoción de la cicatrización, la hepatoprotección, la promoción de la formación ósea y las actividades antitumorales (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji et al., 2019; Xu et al., 2019).

Recientemente, el echinacósido ha sido identificado como un potente antioxidante en el sistema nervioso central (Lu et al., 2016). El echinacósido puede reducir el contenido de MDA y mejorar las actividades de SOD y GSHPx en la lesión cerebral por isquemia, y el análisis de acoplamiento molecular mostró que el echinacósido puede unirse a Keap-1, lo que lleva a la translocación nuclear Nrf-2 (Li et al. al., 2018). El estudio Xia mostró que el acteoside podría disminuir el volumen del infarto y el contenido de agua del cerebro para mejorar los déficits neurológicos en ratas MCAO/R al mitigar el estrés oxidativo (Xia et al., 2018). Otros estudios han demostrado que el isoactósido podría aumentar las actividades de las enzimas antioxidantes celulares, SOD y CAT en células V79-4 tratadas con H2O2-(Chae et al., 2005). Sobre la base de los informes anteriores de los compuestos activos contenidos en los TG, es posible deducir que los TG podrían proteger contra el accidente cerebrovascular isquémico a través de las vías de antioxidación.

Informé sobre los efectos neuroprotectores de los glucósidos feniletanoides (PhG) en la apoptosis inducida por H2O2-en células PC12 a través de la vía Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Estos PhG se suprimieron significativamente al desencadenar la translocación nuclear de Nrf2 y aumentar las expresiones de HO-1, NQO1, subunidad catalítica de glutamato-cisteína ligasa (GCLC) y subunidad modificadora de glutamato-cisteína ligasa (GCLM) (Li et al., 2018) ; Gong et al., 2019).

Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que la vía Nrf-2/ARE desempeña un papel crucial en los efectos protectores mediados por PhG en las células neuronales. De manera similar, en este estudio, encontramos que los TG podrían disminuir el nivel de MDA y aumentar los niveles de SOD, CAT y GSH-Px en las ratas I/R. Mientras tanto, los TG podrían aumentar la expresión de Nrf2 en el núcleo, disminuir la expresión correspondiente en el citoplasma y disminuir significativamente la expresión de Keap-1. Por lo tanto, la vía Nrf-2/Keap-1 puede estar involucrada en los efectos neuroprotectores mediados por TG. En el futuro, se realizaría una mayor validación de esta vía en cultivos celulares in vitro con modelos de lesiones por privación/reoxigenación de oxígeno-glucosa. Además, en nuestro estudio se administraron extractos de C. deserticola durante 14 días de forma continua. Dado que la neurogénesis adulta afectaría la interpretación de los efectos neuroprotectores durante 14 días de reperfusión, la neurogénesis no puede excluirse de nuestro diseño experimental actual para explorar el efecto neuroprotector de las TC. Esta es la limitación de nuestra investigación.

En conclusión, son los TG de C. deserticola los que pueden mejorar la angiogénesis y la neurogénesis, así como mantener la integridad de la BBB en ratas con lesión I/R, pero no los PS y los OS. Los efectos podrían estar mediados por la activación de la vía Nrf-2/Keap-1.

DECLARACIÓN DE DISPONIBILIDAD DE DATOS

Los datos sin procesar que respaldan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición de los autores, sin reservas indebidas, para cualquier investigador calificado.

DECLARACIÓN DE ÉTICA

Este trabajo se llevó a cabo de acuerdo con las Directrices para experimentos con animales de la Universidad de Pekín. Los protocolos de estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín (LA2019123).

CONTRIBUCIONES DE AUTOR

YJ, KZ y PT diseñaron la investigación. FW realizó la investigación. FW y RL analizaron los datos. FW, RL y JC escribieron el manuscrito y el análisis de HPLC. JC, KZ, YJ y PT revisaron el manuscrito.

FONDOS

Este estudio fue apoyado por el Proyecto Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (2017YFC1702400, 2019YFC1711000), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81773932) y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo de Tecnología Clave "Innovación de Nuevos Medicamentos" de China (2018ZX09711001-008-003 ).

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Conflicto de intereses:

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un potencial conflicto de interés.

El editor encargado declaró una afiliación compartida, aunque ninguna otra colaboración, con los autores KZ y YJ, en el momento de la revisión.

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