Perfiles químicos y estudio de metabolitos de Cistanche Deserticola cruda y procesada en ratas por UPLC-Q-TOF-MSE

Email de contactotina.xiang@wecistanche.compara más información

Resumen

Fondo: El procesamiento de la materia médica china es una técnica farmacéutica distinguida y única en la Medicina Tradicional China (TCM) que se utiliza para reducir los efectos secundarios y aumentar o incluso cambiar la eficacia terapéutica de las hierbas crudas. Los cambios en los componentes esenciales inducidos por un procedimiento de procesamiento optimizado son los principales responsables de la mayor eficacia de las plantas medicinales. El efecto vigorizante riñón-yang del vino de arroz al vaporCistanche desertica(C.deserticola) fue más fuerte que la C.deserticola (CD) cruda.

Métodos: Se realizó un análisis de comparación utilizando el UPLC-Q-TOF-MS' con la plataforma informática UNIFl para determinar la influencia del procesamiento. Se realizaron estudios in vitro para la caracterización de constituyentes así comometabolitosen vivo. Se determinaron los componentes químicos en CD y sus productos procesados. Los análisis estadísticos multivariantes se realizaron para evaluar las variaciones entre ellos, mientras que OPLS-DA se utilizó para la comparación por pares.

Resultados: Los resultados de este estudio revelaron variaciones considerables en los glucósidos feniletanoides (PhG) yiridoidesdespués de procesar. Se detectaron un total de 97 compuestos en los extractos de CD y su producto procesado. Los PhG que tienen el grupo 4-O-cafeoilo en la parte 8-O- -D-glucopiranosilo, como el acteósido, el cistanosido C, el campneósido II, el osmanthusido disminuyeron después de ser procesados, mientras que los PhG con 6' El grupo -O-cafeoilo en la parte 8-O- -D-glucopiranosilo, como el isoacetósido, el isocistanósido C, el isocampneósido l, el isomartinósido aumentó, especialmente en el grupo CD-NP. También aumentó la intensidad del equinacósido y del cistanósido B, cuya estructura posee un resto 6'-O- -D-glucopiranosilo. En un estudio in vivo, se detectaron 10 componentes prototipo y 44 metabolitos en plasma, heces y orina de rata. Los resultados obtenidos revelaron que el procesamiento conduce a una variación considerable en los constituyentes químicos de la CD y afecta la disposición de los compuestos in vivo, y los procesos metabólicos de fase Ⅱ son las cascadas clave de cada compuesto, y la mayoría de los metabolitos están asociados con el equinacósido o acteósido.

Conclusiones: Esta es la primera investigación de comparación global de CD en bruto y procesado. Estos hallazgos se suman a nuestra comprensión del impacto del procesamiento de CD y brindan datos importantes para futuras investigaciones de eficacia.

Palabras clave: Cistanche deserticola, Procesamiento, UPLC-Q-TOF-MS5, Perfiles químicos, Metabolitos in vivo

Introducción

El procesamiento de la materia médica china (CMM) ha demostrado una aplicabilidad signifcativa en la práctica clínica de la medicina tradicional china (MTC), y se ha considerado un tratamiento viable durante varios siglos. Esta es una tecnología farmacéutica única que se ha derivado de la teoría de la MTC. Después del procesamiento, se identificaron diferencias signifcativas en la apariencia, los componentes químicos, las características y la importancia medicinal de todos los tipos de MTC, lo que lleva a suponer que el procesamiento podría mejorar la eficacia o reducir los efectos tóxicos de la MTC.

Por cientos de años,Cistanche desertica(Rou Cong Rong en chino, CD) se usa comúnmente en la práctica clínica de la MTC para complementar las funciones del riñón. También ayuda en la hidratación del intestino que conduce a la relajación del intestino [1].Cistanchese registró por primera vez en ShenNongBencaoJing. Se encuentra comúnmente en hábitats áridos y semiáridos en Eurasia y el norte de África, incluidos Irán, China, India y Mongolia [2]. El procesado de CD se ha llevado a cabo mediante vaporización con vino de arroz a presión normal, que es un método de preparación documentado en la farmacopea china (Jiucongrong en chino, en adelante denominado “CD-NP”). Y la cocción al vapor de CD con vino de arroz a alta presión es un método de preparación más eficaz (en lo sucesivo denominado "CD-HP") [3, 4]. Varios estudios han revelado que los efectos farmacológicos de la CD son diferentes a los de sus productos procesados ​​[5]. El CD puede tonificar el yang de riñón y relajar el intestino, mientras que después de ser cocido al vapor con vino de arroz, se fortalecería el efecto de reponer el yang de riñón. En nuestro estudio anterior, se descubrió que el CD-NP podría mejorar la tonificación del riñón y apoyar el yang, y aliviar el efecto de humedecer los intestinos y defecar [6–8]. En la práctica clínica, los productos procesados ​​son la forma más utilizada.

Hasta la fecha, varios estudios han analizado los componentes químicos de la EC, seguido del aislamiento e identificación de más de 100 compuestos [9–11], como los glucósidos de feniletanol (PhG),iridoides, lignanos y oligosacáridos como sus principales constituyentes químicos. También se ha informado que existen muchas actividades farmacológicas de las PhG, que incluyen inmunomoduladoras, neuroprotectoras, hepatoprotectoras, antiinflamatorias, antioxidantes, etc. [12–14]. Los iridoides poseen actividades antiinflamatorias [15, 16]. Estudios anteriores también han revelado que algunos componentes químicos mostraron variaciones durante el procesamiento [17–20]. Con base en estos informes, se puede suponer que después del procesamiento, las variaciones en la composición química conducen a varios efectos farmacológicos, que deben explorarse más a fondo.

En el estudio actual, se realizó un método sensible y efectivo, es decir, cromatografía líquida de rendimiento ultra alto junto con TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) para el análisis comparativo, y se realizaron estudios in vitro para analizar cualitativamente los extractos. de CD, CD-NP y CD-HP para dilucidar sus perfiles químicos. En general, los productos químicos exógenos con alta exposición en los órganos diana se consideraron componentes eficaces. Por lo tanto, en ratas, la CD y sus productos procesados ​​se administraron por vía oral respectivamente, seguido de su caracterización. El estudio existente revela un estudio comparativo (tanto in vitro como in vivo) de CD crudo y procesado por primera vez. Los resultados obtenidos ampliarían nuestra comprensión sobre el efecto del procesamiento de CD, lo que podría ser útil para futuros estudios.

materiales y métodos

Materiales

Los compuestos estándar de ajugol (180120) y 2'-acetil-acetósido (M0601AS) fueron proporcionados por Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, China). El cistanosido F (MUST-17022620), echinacoside (D1105AS), cistano-side A (M0906AS) e isoactoside (M0106AS) fueron proporcionados por Must company (Sichuan, China); acteoside (O0618AS), salidroside (J0526AS), catalpol (S0728AS), genipósido (A0407AS) y ácido geniposídico (MB6001-S) se adquirieron de Dalian Meilun Bio.Co.,Ltd (Dalian, China).8-Ácido oxilogánico epidémico (B31123) obtenido de Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, China. El metanol y el acetonitrilo eran de grado MS y se obtuvieron de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania. El ácido metanoico (CH, O,) de grado HPLC fue proporcionado por Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). El agua utilizada en el estudio existente se procesó a través del sistema Milli-Q (18,2 MQ, Millipore, Ma, EE. UU.). El vino de arroz fue proporcionado por Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China).

La cistanch deserticola se recolectó de Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Las muestras fueron identificadas por el Prof. Yanjun Zhai (facultad de farmacia, Universidad de Liaoning de MTC). Las muestras se enviaron a la Universidad de Medicina Tradicional China de Liaoning.

animales

Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Centro de Recursos de Animales de Laboratorio de la provincia de Liaoning, número de licencia: SCXK-2015–0001) proporcionó ratas macho Sprague-Dawley (grado SPF) con 180-220 g de peso corporal total. Estas ratas se alojaron en una sala de cría con temperatura y humedad bien mantenidas, es decir, 20-26 grados, 50-70 por ciento durante una semana. Las ratas fueron alimentadas con alimentos y agua de laboratorio habituales antes de la experimentación. Los animales ayunaron durante la noche, sin embargo, el agua se proporcionó ad libitum antes de la experimentación. Las ratas se ejecutaron con un 10 por ciento de anestésico de hidrato de cloral. El Comité Institucional de Ética Animal del Hospital Provincial de Medicina China de Liaoning aprobó todos los protocolos experimentales (2019.3.25, 2019015).

Preparación de extractos de CD, CD‑NP y CD‑HP

CD-NP, CD-HP se procesaron del mismo lote de Cistanch deserticola. Para preparar CD-NP, las piezas secas de CD (5 mm de espesor, 100 g) se humedecieron con vino de arroz (30 ml) y se cocieron al vapor a 100 grados durante 16 horas, seguido de un secado a 55 grados en un horno de secado. Mientras que el CD-HP se preparó mediante la infiltración de piezas secas de CD (5 mm de espesor, 100 g) con vino de arroz (30 ml), seguido de vaporización a una presión atmosférica de 1,25 durante 4 h. y luego secado en un horno de secado a 55 grados.

En un matraz aforado de 100 ml, se tamizó un gramo del polvo a través del tamiz n.° 4, seguido de la adición del 50 por ciento de metanol (50 ml) y luego se cubrió herméticamente y se mezcló. Esta mezcla se pesó, seguido de media hora. maceración Después de la maceración, la mezcla se sometió a ultrasonidos (potencia 250 W, frecuencia 35 kHz) durante 40 min, seguido de enfriamiento y pesado nuevamente. La pérdida de peso se repuso con metanol al 50 por ciento, se mezcló apropiadamente y se dejó reposar, luego se filtró el sobrenadante y luego se usó el filtrado obtenido como solución de prueba.

Análisis MSE de componentes activos

Preparación de sustancias estándar: tubuloside-A (3.02 mg), echinacoside (3.00 mg), 2'-acetylacteoside (2,34 mg), acteoside (2,45 mg), isoacteoside (0,61 mg), cistanoside-F (2,14 mg), salidroside (3,39 mg), geni poside (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), catalpol (2,39 mg), ácido geniposídico (2,56 mg) y 8-epideoxyloganic ácido (2,34 mg) en un matraz volumétrico de 10 ml, se agregó metanol a volumen constante a escala, se confguró en una solución de referencia de concentración correspondiente. Cada uno de los 100 μL se confguró en una solución de referencia mixta.

Condición de análisis de MS: el valor de masa se corrigió antes del experimento y se utilizó el modo de iones negativos. El rango de masa fue de 50–1200 Da, y la muestra se inyectó a través de una bomba de inyección de flujo. La velocidad del cono fue de 100 l/h, el caudal de disolvente se fijó en 800 l/h. Los voltajes de capilar y cono se fijaron en 2500 y 40 V, en consecuencia. La temperatura de la fuente de iones y del gas disolvente fue de 100 y 400 grados, respectivamente, y la frecuencia de adquisición de la señal fue de 0,5 S−1.

Análisis UPLC-Q-TOF-MS del extracto de CD (15–16 min), 65 por ciento a 55 por ciento A (16–18 min). El caudal fue de 0,3 ml min-1, mientras que la temperatura de la sala y la columna del automuestreador fue de 30 grados y 8 grados por separado. El volumen de inyección fue de 1,0 μL.

La evaluación espectrométrica de masas se llevó a cabo a través de Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.), que comprende una fuente ESI. El caudal de gas nitrógeno se fijó en 800 L·h-1 con una temperatura de 400 grados, la temperatura de la fuente se fijó en 100 grados y el gas del cono se fijó en 50 L h-1. El voltaje de cono y capilar se ajustó a 40 y 2000 V, según corresponda. La energía de colisión de la rampa se utilizó en el rango de 20 a 30 V. Los datos centroides de todas las muestras se obtuvieron de 50 a 1200 Da, con un 5-tiempo de exploración de 0,5 s durante un tiempo de análisis de 10 min. . Se empleó LockSpray TM para la validación de la precisión de la masa. El ion [M–H]− de leucina encefalina (200 pg·μL−1 caudal de infusión 10 μL min−1) a m/z 554,2615 se utilizó como masa de bloqueo. Se empleó el software MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, EE. UU.) para el cálculo exacto de la masa, la composición de los iones precursores y los iones de los fragmentos.

Análisis de datos en plataforma Masslynx

Además, se estableció una biblioteca interna que comprende el nombre del compuesto, su estructura y la fórmula molecular (en mol.) con base en la literatura. Todos los compuestos fueron anotados en una plantilla especial, hecha en Excel. Además, los archivos mol (Chemdraw Ultra 8.0, Cambridge soft, EE. UU.) y los archivos de Excel de todas las estructuras compuestas individuales también se guardaron en la PC local. La hoja de Excel establecida con datos importantes se importó directamente a la biblioteca científica en UNIFI

Se empleó UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Reino Unido para la evaluación de las características estructurales, en particular para los fragmentos característicos y la fragmentación de MS. Se estableció un área de pico mínima de 500 para la detección de picos 2D. Durante la revelación de los picos 3D, se eligió una intensidad máxima de energía baja de más de 300 cuentas y una intensidad máxima de energía elevada de más de 80 cuentas. Se encontró que el error de masa era de hasta ±10 ppm para compuestos conocidos, y la tolerancia del tiempo de retención se fijó en el rango de ±0,1 min. Seleccionamos los aductos negativos que contenían -H, más HCOOH. El procesamiento de los datos sin procesar obtenidos de MS se llevó a cabo a través del software UNIFI optimizado para identificar rápidamente los componentes químicos que cumplían con los estándares con la base de datos autoconstruida y la Biblioteca de Medicina Tradicional interna.

A continuación, para verificar la estructura química de cada compuesto objetivo, los isómeros se distinguieron por sus patrones característicos de fragmentación de MS que se revelaron en los estudios informados y comparando los tiempos de retención de los estándares de referencia.

Análisis metabolómico basado en análisis estadístico multivariante

Antes de procesar los datos sin procesar, se establecieron los parámetros, como masa que va desde 150 a 1200 Da, rango de tiempo de retención (0 a 20 min), umbral de intensidad ( 2000 recuentos), tolerancia de masa, es decir, 5 MDA, mientras que la ventana de masa y tiempo de retención fue de 0,20 min y 0,05 Da, respectivamente. En la lista posterior de la base de datos, el identificador de iones fue el RT-m/ pares con respecto a sus tiempos de elución. Los mismos valores para RT y m/z en varios lotes de muestras se consideraron como el mismo compuesto.

Se realizó un análisis estadístico multivariante para evaluar biomarcadores efectivos que contribuyeron considerablemente a las variaciones entre diferentes grupos. Durante el análisis, se empleó el análisis de componentes principales (PCA) para indicar las diferencias máximas y el reconocimiento de patrones para obtener una descripción general y una clasificación. OPLS-DA es una herramienta de modelado que proporciona visualización de la carga de componentes predictivos de OPLS-DA para ayudar en la evaluación del modelo. Se utilizó la importancia variable para la proyección (VIP) para evaluar la evaluación de varios componentes, y lametabolitoswith VIP values>1.0 y valor P<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Las ratas de los experimentos con animales se clasificaron aleatoriamente en cuatro grupos (n=6 para cada grupo), seguido de la administración oral de varios extractos: (1) Grupo de control en blanco: las ratas recibieron solución salina normal (2 ml/100 g) ; (2) grupo CD: las ratas recibieron extracto de CD (2 ml/100 g); (3) grupo CD-NP: las ratas recibieron extracto de CD-NP (2 ml/100 g); (4) Grupo CD-HP: las ratas recibieron extracto de CD-HP (2 ml/100 g). La categorización adicional de todos los grupos se llevó a cabo en tres subgrupos para plasma, orina y heces, según corresponda. Dos horas más tarde, a cada rata se le administró por vía oral la misma cantidad de extractos.

Después de la administración, la recolección de muestras de sangre se llevó a cabo a las 1.0 h, 2.0 h y 4.0 h en tubos de polietileno heparinizados de 1,5 ml (de las venas orbitarias) , seguido de centrifugación (a 4500 rpm) de todas las muestras durante 15 min.

Para las muestras de orina y heces, las ratas se mantuvieron en jaulas de metabolismo, y luego se llevó a cabo la recolección de muestras de orina y heces durante 24 h después de la administración. La centrifugación de las muestras de orina se realizó a 4500 rpm durante 15 min, mientras que las muestras de heces se secaron a la sombra, se molieron en polvo, luego se tomaron 0,2 g y se agregaron a 0,5 mL de solución salina. solución, ultrasonido por 5 min, y centrifugado a 12,000 rpm por 15 min. Todas las biomuestras se mantuvieron a -80 grados hasta su análisis.

Preparación de muestras biológicas. La adición de muestras de plasma, orina y heces se realizó con 3 volúmenes de metanol, seguido de agitación vorticial durante 3 min. A continuación, se llevó a cabo la centrifugación (a 12, 000 rpm) de las mezclas durante 10 min, seguida de la transferencia del sobrenadante al tubo EP y luego se secó con nitrógeno a 37 grados. Además, se realizó la adición de 200 μL de solución de HCN-H2O (50 por ciento). Diez, se usó el vórtice para mezclar (1 min), seguido de centrifugación (a 12,000 rpm) durante 5 min. El sobrenadante (5 μL) de las muestras tratadas se inyectó en el sistema UPLC-Q-TOF-MSE.

Condiciones cromatográficas líquidas y espectrométricas de masas El análisis parametabolitostambién fue realizada por el instrumento Waters UPLC a través de una interfaz ESI. Las separaciones se llevaron a cabo utilizando una columna Acquity UPLC HSS T3 (100 mm×2,1 mm, 1,8 µm), la fase móvil fue ácido fórmico al 0,1 % (A): acetonitrilo (B), el la condición de elución del gradiente fue 0-3 min (99,8 % →98 % A).3-5 min(98 % →95 % A),5-8 min(95 % →90 % A), { {18}} min (90 por ciento →85 por ciento A),12-17 min(85 por ciento →70 por ciento A), 17-22 min (70 por ciento →60 por ciento A), 22-23 min (60 por ciento →58 por ciento A), 23-25 min (58 por ciento A),25-32 min (58 por ciento →45 por ciento A) y 32-37 min (45 por ciento →35 por ciento A ), 0,4 mL min-1 fue el caudal. La temperatura de la columna y la sala de muestras se fijó en 40 y 8 grados, respectivamente. Se utilizaron las condiciones de espectrometría de masas mencionadas anteriormente.

Estrategia para el análisis sistemático de metabolitos en muestras biológicas Se empleó el software UNIFI (1.8.2) para el procesamiento de datos. La función Binary Compare se utilizó para la identificación de metabolitos efectivos. Los metabolitos evaluados no existían en la muestra de control equivalente o existen a bajas intensidades de iones. El umbral de intensidad relativa se fijó en 3 o 5, y se pudieron evaluar los metabolitos que cumplían con los criterios subrayados. Los metabolitos comunes y predecibles fueron luego determinados por EIC. Para la búsqueda de metabolitos de dos fases, se aplicó la función NLF. Por ejemplo, en el software UNIFI, los parámetros podrían establecerse en 176.0321 para buscar posibles conjugados de ácido glucurónico. Después del procesamiento, se puede establecer o identificar una pérdida neutral en el método. MassFragment se utilizó para determinar o caracterizar las estructuras de los metabolitos detectados, la función de interpretación espectral de UNIFI es la función principal utilizada para analizar la fragmentación secundaria de los componentes principales. Esta función se puede utilizar para la verificación rápida de la ruta de fragmentación si es razonable.

Resultados

Regla de fragmentación de masas de glicósidos feniletanoides e iridoides

Los glucósidos feniletanoides son los principales constituyentes químicos de la EC. Las soluciones estándar de isoactósido,

Se tomaron cistanoside F, tubuloside A, echinacoside, acteoside y 2'-acetyl-acteoside, seguido de proporcionar un nivel diferente de energías de colisión (Tabla 1), y luego se obtuvieron los mapas MS2 correspondientes (Fig. 1).

El análisis espectrométrico de masas reveló que los glucósidos de feniletanoide tienen patrones de fragmentación del espectro de masas similares, las vías de división en el modo de iones negativos incluyen principalmente (1) ruptura del enlace éster: pérdida del grupo cafeoílo neutro (C, H, O162.03) y acetilo neutro grupo (C, H, O, 42.00); (2) escisión glucosídica: pérdida de residuos de ramnosa neutros (C.HIO, 146,05) y residuos de glucosa neutros (CgHO, 162,05). A partir de la espectrometría de masas de alta resolución, se pudieron distinguir el cafeoílo (162.03) y el residuo de glucosa (162.05).

Se tomaron soluciones estándar de iridoides ajugol, catalpol, ácido genipósido, genipósido y 8-epide ácido oxilogánico, luego se proporcionaron diferentes energías de colisión y se obtuvieron los mapas de MS correspondientes (Fig. 2).

Los glucósidos iridoides tienen patrones de fragmentación del espectro de masas similares, las vías de escisión en el modo de iones negativos incluyen principalmente (1) escisión glucosídica: pérdida de residuos de glucosa neutros (CHoO, 162,05); (2) pérdida de CO neutro, (43,99) y H , O(18.01).

Identificación de los compuestos en extractos de CD, CD-NP y CD-HP

Análisis UPLC-QTOF-MSE

Se llevó a cabo la optimización de las condiciones cromatográficas. A continuación, los compuestos de CistancheHerba se evaluaron en modos de iones negativos y positivos con CE altos y bajos. Los resultados obtenidos revelaron que la compatibilidad del modo negativo fue mayor en relación con el modo positivo para estos compuestos. La figura 3 muestra el cromatograma de iones de pico básicos (BPI) de MS trazado con picos numerados. La intensidad de cada ion detectado en el análisis UPLC-Q-TOF-MS se normalizó con respecto al recuento total de iones para la generación de una matriz de datos que comprendía el valor m/z, el área de pico normalizada y el tiempo de retención.

La evaluación de componentes de CD y sus productos procesados ​​en la plataforma UNIFl

Se identificaron un total de 97 compuestos con el modo -SEM (n=6) de CD y su producto procesado (Tabla 2), incluidos glucósidos de feniletanoide (PhG), iridoides, lignanos y oligosacáridos. Los componentes 95, 91 y 94 se detectaron en CD, CD-NP y CD-HP en consecuencia. Entre ellos, 64 fueron feniletanoides, 13 fueron iridoides y se determinaron otros 20 tipos de compuestos. Hubo una similitud en la composición química de CD y su producto procesado, sin embargo, se encontró que la cantidad de los componentes era diferente entre CD y su producto procesado.

Variaciones en los componentes químicos de los productos procesados ​​Se empleó el software Simca-P 13.0 para el análisis de la matriz de datos multivariados. Antes de PCA, todas las variables estaban centradas en la media y en escala de Pareto, seguidas de la identificación de posibles variables discriminantes. En un gráfico de puntuación de PCA, cada punto mostraba una muestra individual. Las muestras que mostraron similitud en sus componentes químicos se dispersaron una al lado de la otra, mientras que las que mostraron variaciones en sus componentes se dividieron. Como se ve en PCA (Fig. 4), el grupo de CD-HP se separó de los grupos de CD y CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 y P<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

En la Fig. 8, encontramos la intensidad del acteósido (54), el cistanósido C (74), el campneósido I (43), el osmanthusido (75) y el 2'-actilactósido (80) que tienen el grupo 4'-O-caffeoyl en la parte 8-O- -D-glucopiranosilo (ver Fig. 9) disminuyó después de ser procesada por vino de arroz, mientras que la intensidad del isoacetósido (60), es castanósido (71), iso-campneósido I (69), aumentó el isomartinosido (86) que tiene el grupo 6'-O-cafeoílo (ver Fig. 9), especialmente para el grupo CD-NP. Aunque el tubulósido B (72) tiene un grupo 6'-O-cafeoílo, al igual que el isoactósido, la intensidad disminuyó debido a su grupo 2'-acetilo. La intensidad del equinacósido (38) y el cistanósido B que tienen grupos radicales 6'-O- -D-glucopiranosilo aumentó, pero la intensidad del tubulosido A (55) también disminuyó debido a su grupo 2'-acetilo.

Nuestro equipo de investigación también estudió la estabilidad térmica del acteósido y el isoactósido y descubrió que el acteósido era inestable en agua, metanol y solución de vino de arroz amarillo, y podía convertirse en isoactósido en parte bajo condiciones de calentamiento. Pero la termoestabilidad del isoactósido fue mejor, especialmente en la solución de vino de arroz amarillo. La Figura 10 mostró los posibles cambios de PhG en CD durante el procesamiento:

Identificación de los metabolitos en ratas A partir de datos de espectrometría de masas de alta resolución, se analizó y comparó el peso molecular exacto y la composición elemental de los metabolitos y compuestos de protomoléculas. Como los mismos tipos de compuestos en la medicina tradicional china mostraron similitud en las modificaciones metabólicas, las correlaciones de los constituyentes fitoquímicos in vitro pueden extenderse a sus metabolitos in vivo. Mientras tanto, según las vías de biotransformación convencionales, se infirió un cambio razonable del peso molecular. Finalmente, los metabolitos se identificaron analizando los espectros de masas MSE de la vía de fragmentación de los metabolitos y protocompuestos en el espectro de masas [21, 22]. En comparación con la muestra en blanco, sus componentes se identificaron in vivo con base en la información proporcionada por cromatograma-espectro de masas, la posibilidad de una reacción metabólica, las características de la estructura del compuesto y la regla de fragmentación de su espectro de masas. Consulte la Tabla 3.

Identificación de metabolitos relacionados con los glucósidos de feniletanol

Para el procesamiento se utilizó la plataforma UNIFI. La figura 11 muestra el cromatógrafo TIC de orina, heces y plasma para CD y sus productos procesados. En comparación con las muestras en blanco, se identificaron un total de 54 metabolitos en ratas, incluidos 10 componentes prototipo y 44 metabolitos, de los cuales 24, 49 y 6 estaban en heces, orina y plasma, según corresponda.

Sobre la base de la masa precisa, la cascada de fragmentación y las pérdidas neutras predecibles por biotransformación, se evaluaron tentativamente un total de 35 metabolitos asociados a glucósidos de feniletanoide. Los metabolitos relacionados de los glucósidos de feniletanoide tienen patrones de fragmentación del espectro de masas similares, como el fragmento típico de descafeinado m/z 461.1605, luego se hidrolizan aún más por enlaces glucosídicos y éster in vivo, y se metabolizan en hidroxitirosol (HT)(m/ z153,0504, C.HO.4,73 min) y ácido cafeico (CA)(m/z179,0389, CH, O0,77 min), véase la Fig. 12A.

M11 indicaba [MH]~ en m/ 153,0504 con fórmula, es decir, C.HO, e identificado como HT. M16 presentó [MH]- en m/z 329,0851, que era 176 Da más elevado que el de HT, lo que revela que podría ser un metabolito glucuronizado de HT. El [MH]-de M26 fue m/z 343,1037,14 Da más alto que el del glucurónido de HT. Por lo tanto, M26 se identificó como glucurónido metilado con HT. M17 se identificó como HT-sulfato basado en su [MH]- en m/z 233.0112,80 Da sobre el HT, que podría metilarse más, luego produjo M22, que mostró el m/z 247.0278, lo que indica que era HT- metabolito sulfatado metilado. M7 (m/167,0335) y M5 (m/z 167,0762) se consideraron como productos de oxidación y HT metilado, respectivamente (Fig. 12B).

M1 indicó [MH]- en m/z 179,0389, la fórmula molecular aclarada fue CH-O e identificada como ácido cafeico (CA). que podría ser un metabolito glucuronizado de CA. M27 tenía m/z 258,994, que era 80 Da más alto que el de CA, por lo que lo aclaramos como sulfato de CA y podría producir M35 (m/z 273,0064). Como M4 da el [MH]7 am/z 193,0524,14 Da mayor que CA, se identificó como metabolito metilado de CA. M39 era el metabolito de deshidroxilación de CA, con m/z 163,04, y se podía sulfatar en M32 (m/z 242,9951).

M33(m/z 181.0491, C.HO,9.06 min) fue el producto de reducción de CA, es decir, ácido 3,4-dihidroxi-bencenopropiónico, que podría metilarse en M19 (m /z 195,0623, C10H12O4, 0,93 min). M33 podría deshidratarse en M43, es decir, 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min), y M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) y M29 (m/z 245,0125, C9H10O6S, 8,52 min) fueron los productos glucuronizados y sulfatados (Fig. 12C).

Para los metabolitos asociados a los glucósidos de feniletanoide, las cascadas metabólicas clave fueron reacciones metabólicas de fase II, es decir, glucuronidación, metilación y sulfatación. Las cascadas metabólicas propuestas de feniletanoides se representan en la Fig. 13.

Identificación de metabolitos relacionados con iridoides

Al analizar la composición elemental de los metabolitos, la fragmentación de MSE y la literatura asociada, se evaluaron tentativamente un total de 19 metabolitos asociados con iridoides. Los glucósidos iridoides fueron hidrolizados por enlaces glucosídicos para formar sus correspondientes agliconas. La m/z 185,117 fue para M8, 162 Da menor que el ajugol, que se produjo por la pérdida del residuo de glucosa.

M40 (m/z 199,0641, Rt 10,91 min) fue el producto desglicosilado de catalpol. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) fue inferior a 30 Da la del metabolito desglicosilado de catalpol, y se identificó como la eliminación de una molécula del metabolito CH,O. M34 (m/z 151,0352, Rt 9,08 min), fue una pérdida adicional del metabolito H, O.

M44 (m/z 211,0665, Rt 11,31 min) era un metabolito desglicosilado de genipósido, y M37 (m/z 197,0833, Rt 15,03 min) era la desglicosilación de 8-ácido epideoxilogánico. Las reacciones metabólicas de los iridoides podrían revelarse como metabolismo de fase I de desglicosilación (Fig. 12D).

Comparación de perfiles metabólicos en plasma, orina y heces entre CD y sus productos procesados

Se compararon 2 prototipos en plasma, 7 en orina y 3 en heces. Hubo 7 prototipos absorbidos en CD, 7 prototipos absorbidos en CD-NP y 8 prototipos en CD-HP. M21 solo se detectó en el grupo de heces de CD-NP, y M38 y M51 se detectaron solo en grupos de orina de CD-HP. En comparación con los metabolitos, los metabolitos idénticos en plasma, orina y heces fueron 4, 42 y 21, respectivamente. Hubo 34 metabolitos absorbidos en el grupo CD, 39 en CD-NP y 40 en el grupo CD-HP. M5, M7, M40 y M52 solo se detectaron en los grupos CD-NP, mientras que M24, M41 y M48 solo se detectaron en los grupos CD-HP.

Se observaron variaciones tanto en la absorción como en el metabolismo de los compuestos activos en diversos productos procesados ​​de la EC. En la Fig. 14, encontramos que la intensidad de la conjugación de HT-sulfato (M17) fue la más alta en la orina, seguida de 3-conjugación de sulfato de HPP (M29), conjugación de sulfato de HT metilado (M22), sulfato de CA deshidroxilado conjugación de sulfato de ácido propiónico de 3,4-dihidroxibenceno (M32) (M19). El contenido de productos metabólicos en el grupo procesado fue mayor que en el grupo CD, especialmente para M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Sus compuestos precursores 6'-O-caffeoyl en la parte 8-O- -D-glucopiranosilo, como el hidroxitirosol, tienen propiedades antitumorales, antiinflamatorias, antibacterianas, antivirales y antifúngicas [ 23]. El ácido cafeico posee actividades antiinflamatorias, anticancerígenas y antivirales [24]. Era consistente con el uso clínico de CD y sus productos procesados.

Discusión

CD es un TCM, y varios estudios de investigación han documentado sus principales componentes bioactivos, incluidos PhG, iridoides y polisacáridos. En la práctica clínica de la MTC, los productos procesados ​​de CD han sido ampliamente utilizados en relación con los crudos. La composición química cambiará durante el procesamiento, lo que puede provocar cambios en los efectos medicinales (Fig. 14).

Los PhG son un tipo de compuesto fenólico caracterizado por una estructura de -glucopiranósido que lleva un resto hidroxifeniletilo como aglicona. Estos compuestos a menudo comprenden ácido cafeico y ramnosa unidos al residuo de glucosa a través de enlaces éster o glucosídicos, respectivamente. En el estudio actual, los análisis cualitativos de CD, CD-NP. y CD-HP, identificándose un total de 97 compuestos, entre ellos glucósidos feniletanoides (PhGs), iridoides, etc. Los resultados obtenidos mostraron variaciones en la composición química antes y después del procesamiento. La intensidad de los PhG que tienen el grupo 4'-O-caffeoyl en la parte 8-O- -D-glucopiranosilo, como el acteósido, el cistanosido C, el campneósido II, el lado del osmanthus, disminuyó después de procesarse, mientras que los PhG con

como isoacetósido, isocistanósido, isocampneósido I, isomartynósido aumentaron, especialmente en el grupo CD-NP. También aumentó la intensidad del equinacósido y del cistanósido B, cuya estructura posee un resto 6'-O- -D-glucopiranosilo. Los PhG que tienen un grupo 2'-acetilo a menudo disminuyen debido a la reacción de hidrólisis durante el proceso, como el tubulosido B, el 2-acetilactosido.

La investigación de los metabolitos absorbidos in vivo se llevó a cabo después de la administración oral de CD y sus productos procesados. Los procesos metabólicos de la fase II fueron las cascadas clave y la mayoría de los metabolitos fueron sulfato, glucurónido y conjugados metilados. Los glucósidos de feniletanol tienen baja absorción y utilización oral. Son difíciles de absorber en la sangre y actúan como progenitores para desempeñar sus funciones después de la activación metabólica in vivo. Feniletanoides producidos en feniletanolaglicona, como hidroxitirosol (HT) y ácido cafeico (CA) y su derivado 3-ácido hidroxifenilpropiónico (3-HPP), estos metabolitos pueden absorberse más fácilmente en el plasma y tener una mejor efecto medicinal.

CD y sus productos procesados. La conjugación de sulfato de HT (M17) tiene la mayor intensidad en la orina, seguida de la 3-conjugación de sulfato de HPP (M29), la conjugación de sulfato de HT metilado (M22), la conjugación de sulfato de CA deshidroxilado (M32) y 3,{{ 7}}Conjugación de sulfato de ácido dihidroxibencenopropiónico (M19). El contenido de productos metabólicos en el grupo procesado fue mayor que en el grupo CD, especialmente para M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

En general, los componentes que tienen una alta exposición en los órganos diana podrían ser efectivos. Se ha evaluado y determinado in vitro una cantidad suficiente de feniletanoides y sus derivados. Acteósido es el compuesto característico, cuyo contenido disminuyó después de ser procesado por vino de arroz, y el contenido de isoactósido, isocistanósido C, isocampneósido I aumentó correspondientemente. Los productos de degradación de los PhG, como los derivados de CA y HT, podrían evaluarse en las muestras biológicas, y el procesamiento del vino de arroz puede mejorar la absorción de metabolitos in vivo.

Conclusión

En este estudio se detectaron 97 compuestos en los extractos de CD y su producto procesado. La degradación de unos pocos glucósidos se produjo a temperatura elevada y, como resultado, se sintetizaron algunos isómeros y complejos nuevos. En un estudio in vivo, los componentes prototipo (10) y los metabolitos (44) se determinaron o evaluaron tentativamente en plasma, heces y orina de rata. Los procesos metabólicos de fase II fueron las cascadas clave, la mayoría de los metabolitos estaban asociados con el equinacósido o el acteósido, como HT, CA y sus derivados 3-ácido hidroxifenilpropiónico 3-HPP. Estos metabolitos pueden absorberse más fácilmente en el plasma y tener un mejor efecto medicinal. Los resultados obtenidos mostraron que la composición química de la CD fue diferente y afectó la disposición del compuesto in vitro e in vivo.

abreviaturas

PhG: glucósidos feniletanoides; CD: Cistanche deserticola; CMM: Materia médica china; MTC: Medicina Tradicional China; CD-NP: Gistanche deserticola Procesado al vapor con vino de arroz a presión normal; CD-HP: Cistanche deserticola Procesado al vapor con vino de arroz a alta presión; UPLC-Q-TOF-MS: cromatografía líquida de rendimiento ultraalto junto con TOF-MS; PCA: Análisis de componentes principales; VIP: Importancia variable para la proyección; CA: Caffeicacid; HA: Hidroxitirosol.

Expresiones de gratitud

No aplica.

Contribuciones de los autores

LZ, LBN, SJ participaron en la redacción, redacción del manuscrito. RJ, LPP ayudó con los experimentos con animales y redactó y finalizó todas las figuras y tablas. ZC, HY. ITZ ayudó con el diseño y la realización de este estudio y revisó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Fondos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Concesión No: 81874345) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Liaoning (Concesión No: 2020-MS-223).

Disponibilidad de datos y materiales.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Declaraciones

Aprobación ética y consentimiento para participar

La aprobación ética para el uso de animales de experimentación en este estudio se obtuvo del Comité de Ética Médica de la Universidad de Medicina Tradicional China de Liaoning (Número de aprobación: 2018YS(DW)-044-01). Todos los procedimientos experimentales en este estudio se realizaron bajo los estándares éticos de el Comité de Ética Médica de la Universidad de Medicina Tradicional China de Liaoning.

Consentimiento para publicación

No aplica.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés que revelar.

Detalles del autor

'Departamento de Farmacia, Universidad de Medicina Tradicional China de Liaoning, Dalian, Liaoning, China.'Instituto de Investigación de Drogas del Grupo Monos, Ulaanbaatar 14250, Mongolia.

Recibido: 31 de mayo de 2021 Aceptado: 17 de septiembre de 2021 Publicado en línea: 28 de septiembre de 2021

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1*, Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 y Tianzhu Jia1

Referencias

1. Comisión de la Farmacopea China. Farmacopea de la República Popular China, vol. I. Beijing: China Medical Science Press; 2020. pág. 140.
2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): uno de los mejores regalos farmacéuticos de la medicina tradicional china. Frente Farmacol. 2016;7:41.
3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Efectos de diferentes métodos de procesamiento de secado para Fresh Cistanche deserticola en el contenido de sus componentes. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optimización del proceso de vaporización a alta presión para Cistanches Herba. Mentón Trad Patente Med. 2019;11:2576–80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Efectos de Cistanches herba antes y después del procesamiento sobre la función antienvejecimiento y la función inmunológica de ratas envejecidas inducidas por D-galactosa. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882–2885.
6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Estudio sobre componentes laxantes en Cistanche deserticola YMCA. Mentón moderno Med. 2015;17(4):307–10.
7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Estudio sobre la función neuroendocrino-inmune de Cistanche deserticola y sus productos de vapor de vino de arroz en el modelo de rata inducido por glucocorticoides. Complemento basado en Evid Alternat Med. 2020;22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Mejora de la función vigorizante del riñón en el modelo de ratón por Cistanches herba secado rápidamente a una temperatura media-alta. Comida J Med. 2019;22(12):1246–53.
9. Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola YC Ma, "Ginseng del desierto": una revisión. Soy J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: una descripción general de sus propiedades químicas, farmacológicas y farmacocinéticas. J Etnofarmacol col. 2018;219:233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): una revisión de su fitoquímica y farmacología. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Efectos neuroprotectores del equinacósido en el modelo MPTP de ratón de la enfermedad de Parkinson. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Efecto protector del tubulosido B sobre la apoptosis inducida por TNF alfa en células neuronales. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.
14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Iridoides antiinflamatorios de los tallos de Cistanche deserticola cultivados en el desierto de Tarim. Mentón J Nat Med. 2016;14(1):61–5.
15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Glicósidos feniletanoides con actividades antiinflamatorias de los tallos de Cistanche deserticola cultivados en el desierto de Tarim. Fitoterapia. 2013;89:167–74.
16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoides y glucósidos monoterpénicos acíclicos, kankanosidos L, M, N, O y P de Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. Una estrategia novedosa para explorar rápidamente marcadores químicos potenciales para la discriminación entre Radix Rehmanniae crudo y procesado por UHPLC-TOF-MS con análisis estadístico multivariable. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Cambios en los niveles de glucósidos de feniletanoide, actividad antioxidante y otros rasgos de calidad en rodajas de Cistanche deserticola mediante procesamiento al vapor. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024–30.
19. Ma ZG, Tan YX. Cambios en el contenido de seis glucósidos de feniletanoide en períodos de tiempo humeantes con vino en Desertliving Cistanche. Mentón Trad Pat ent Med. 2011;33(11):1951–4.
20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Efecto del proceso de cocción al vapor sobre la calidad de la cistanche deserticola poscosecha para uso medicinal durante el secado al sol. Toro BiolPharm. 2016;39(12):2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metabolitos del acteósido dietético: perfiles, aislamiento, identificación y capacidades hepatoprotectoras. J Química alimentaria agrícola. 2018;66(11):2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Caracterización sistemática de los metabolitos de equinacósido y acteósido de Cistanche tubulosa en plasma, bilis, orina y heces de rata según UPLC-ESI-Q-TOF -EM. Cromatógrafo biomédico. 2016;30(9):1406–15.
23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hidroxitirosol: un compuesto natural con actividades farmacológicas prometedoras. J Biotecnología. 2020;309:29–33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Ácido cafeico, un farmacóforo versátil: una descripción general. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.

Nota del editor

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.