¿Cómo juegan los ingredientes activos de Cistanche Tubulosa un papel en la enfermedad de Alzheimer?

JIANHUA YANG1*, BOWEI JU1,2*, YAO YAN1, HUANHUAN XU1, SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1 y JUNPING HU2

Resumen.El presente estudio tuvo como objetivo investigar los efectos neuroprotectores deglucósidos de feniletanoide(PhGs) en H2O2- y péptido -amiloide (A )1-42-daño inducido de células PC12 como modelo in vitro deenfermedad de alzheimer (ANUNCIO). Las condiciones óptimas de inducción se establecieron mediante la selección de varios tiempos y concentraciones de incubación. Las células PC12 se trataron con 00,5 µM A 1-42 y H2O2 en presencia de PhG durante 24 h y luego se evaluó la viabilidad celular mediante un ensayo MTT; También se midieron la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) y el contenido de malondialdehído (MDA). Las condiciones óptimas para establecer laANUNCIOmodelo fueron el tratamiento de células PC12 con 0.5 µM A 1-42 durante 48 h, o con 25 µM H2O2 disuelto en DMEM con PBS. Los PhG en concentraciones de 5, 25 y 50 µg/ml aumentaron la viabilidad y disminuyeron la liberación de LDH y MDA por parte de las células PC12 lesionadas con A 1-42 o H2O2. En conclusión, el modelo de lesión celular PC12 inducida por A 1-42- y H2O2- se estableció con éxito. Se demostró que las PhG tienen un efecto neuroprotector significativo contra la lesión celular inducida por A 1-42- o H2O2-.

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Introducción

enfermedad de alzheimer (ANUNCIO), un trastorno neurodegenerativo con las características clínicas de pérdida progresiva de la memoria y deterioro de la función cognitiva (1), es la causa más común de demencia en todo el mundo (2). Los costos financieros son inmensos debido a la prevalencia de la DA (3). Por lo tanto, es urgente desarrollar medios apropiados para el manejo y la prevención deANUNCIO.

La patogenia deANUNCIOestá estrechamente asociado con la acumulación de ovillos neurofibrilares y placas seniles (SP) en las regiones cerebrales afectadas (4,5). Se ha informado que el péptido amiloide (A), el componente principal de las SP, tiene un papel causal en la progresión de laANUNCIOya que tiene un efecto tóxico sobre las células neuronales (6). Los fragmentos A, incluidos A 1-40, A 25-35 y A 1-42, se generaron a través de la división de la proteína precursora de amiloide (7). Se encontró que la neurotoxicidad de A 1-42 es significativamente mayor que la de A 25-35 y A 1-40, y A 1-42 es capaz de inducir unaANUNCIOmodelo (1,8-10). El estrés oxidativo puede estar involucrado en la patogenia deANUNCIOy es el principal mecanismo subyacente a la neurotoxicidad inducida por A (11-13). Varios estudios sugirieron que A 1-42 causaba la acumulación intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que provocaba la oxidación de lípidos y proteínas, daños en el ADN y la activación de la señalización del punto de control del ciclo celular (1, 14, 15). Cantidades excesivas de H2O2 pueden provocar daño oxidativo e inducir la apoptosis de las células PC12 (16). Por lo tanto, atacar el estrés oxidativo puede ser un enfoque prometedor para el desarrollo de estrategias terapéuticas para inhibir la neurotoxicidad inducida por A en la EA.

Herba (H.)Cistanche, una medicina herbal china comúnmente utilizada en China continental para nutrir los riñones y reponer la esencia y la sangre, se ha utilizado para tratar la pérdida de memoria y el estreñimiento senil (17). El glucósido feniletanoide (PhG), uno de los principales componentes de H.Cistanche, mejora el deterioro de la apoptosis neuronal causada por A 25-35 a través de sus efectos antioxidantes (18,19). Un estudio anterior identificó cinco componentes principales del total de PhG, a saberacteósido, 2'-acetilactósido,echinacósido, cistanósidos e isoactósidos (20). Entre estos componentes,acteósidoyechinacósidose ha informado que tienen efectos neuroprotectores sobre la neurotoxicidad inducida por A 25-35- o H2O2- (21-23). Por ejemplo, Wu et al (24) sugirieron que el acteósido yechinacósido

Palabras clave:feniletanoideglucósidos, células PC12, H2O2, -péptido amiloide1-42, neuroprotección,cistanche

materiales y métodos

Preparación de PhG. Los PhG totales se extrajeron de H.Cistanchecomo se describió previamente (25). El tallo secado al aire de H.Cistanchese pulverizó y se extrajo por percolación con 80 por ciento de EtOH. El percolado se evaporó a presión reducida, seguido de una nueva suspensión en una cantidad adecuada de H2O2 (1{{20}}0 µmol/l). La mezcla se aisló en una columna de resina macroporosa SP-825 (Mitsubishi Chemical, Tokio, Japón) y se eluyó con 0, 30, 50, 70 y 90 por ciento de EtOH en agua. Para obtener la fracción rica en PhG, los eluyentes de EtOH 30-50 por ciento se concentraron y secaron a presión reducida. Se realizó espectrofotometría ultravioleta (UV) para determinar los PhG totales. El contenido de equinacósido y acteósido se determinó por cromatografía líquida de alta presión de acuerdo con un protocolo previo (26). Se utilizó una columna Hypersil ODS-2 (4,6 x 250 mm, 5 µm; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Dalian, China) y se mantuvo a temperatura ambiente. Las fases móviles fueron cianuros de metilo y agua que contenía 0,4 por ciento de ácido fosfórico (v/v; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). El caudal fue de 0,75 ml/min y la longitud de onda se fijó en 333 nm.

Cultivo celular y tratamiento farmacológico. La línea celular de feocromocitoma de rata PC12 fue proporcionada por el Dr. He Chunhui, de la Facultad de Medicina de la Universidad Médica de Xinjiang (Urumqi, China). Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.) que contenía 10 por ciento de suero bovino fetal (Sangon Biotech Co. Ltd., Shanghái, China) , 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicinas en una incubadora a 37˚C que contiene 5 por ciento de CO2 y 95 por ciento de aire. Al alcanzar el 80 por ciento de confluencia, las células se trataron con 0,25 por ciento de tripsina y se sometieron a pases.

Para eliminar la interferencia del propio fármaco sobre el crecimiento de las células PC12, se realizó un experimento de toxicidad. En resumen, se sembraron células PC12 (3x104 células/ml) en 96-placas de pocillos a 100 µl/pocillo y se incubaron a 37˚C durante la noche. Después de desechar el sobrenadante, se añadieron 200 µl de DMEM completo al grupo en blanco, mientras que las células de los grupos de intervención se trataron con PhG a varias dosis (5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 y 200 µg/ mililitros). Después de la incubación de las células a 37 °C durante 48 h, se añadieron a cada pocillo 20 µl de solución de MTT (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA). Después de la incubación durante 4 h, se descartó el sobrenadante y se añadieron 150 µl de dimetilsulfóxido por pocillo, seguido de agitación durante 10 min. Los valores de densidad óptica (DO) a 490 nm se detectaron utilizando un lector de placas ELISA.

Una lesión celular PC12 inducida por 1-42. Se disolvió en agua (100 µg/ml) un péptido 1-42 adquirido de Bioss Biotech (Beijing, China). Posteriormente, la mezcla se incubó a 37 ˚C durante 4 días y se almacenó a 4 ˚C antes de su uso.

Las células PC12 se sembraron en 96-placas de pocillos (3xl04 células en 100 µl por pocillo). Después de cultivar durante 24 h para determinar la adherencia, se añadieron 50 µl de A 1-42 en varias concentraciones finales (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5 o 2 µM) disueltas en DMEM sin suero, seguido de incubación durante 24, 48, 72 o 96 h. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo MTT. Se determinó que la concentración óptima de A 1-42 era 0,5 µM.

Se trataron células PC12 (3xl04 células por pocillo) con varias dosis de PhG (0, 0.5, 5, 25 o 50 µg/ml) en presencia de 0,5 µM A 1-42 durante 24 h. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo MTT.

Lesión de células PC12 inducida por H2O2. Las células PC12 se sembraron en placas de 96-pocillos (3xl04 células en 100 µl por pocillo). Después de cultivar durante 24 h para determinar la adherencia, se añadieron 100 µl de H2O2 en varias concentraciones finales (0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 y 500 µM) disueltos en DMEM con o sin PBS (0,01 mol/l), seguido de incubación durante 24 h. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo MTT. Se determinaron la concentración óptima de H2O2 y el solvente para establecer el modelo in vitro de AD.

Se trataron células PC12 (3xl04 células por pocillo) con varias dosis de PhG (0, 0,5, 5, 25 y 50 µM). Después de cultivar durante 24 h para observar la adherencia, las células PC12 se trataron con 100 µl de H2O2 disueltas en DMEM con PBS en presencia de PhG durante 24 h. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo MTT.

Ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). La lesión celular se evaluó midiendo la actividad de LDH en el sobrenadante de células PC12 utilizando un kit de LDH de acuerdo con el protocolo del fabricante (n.º de cat. 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Porcelana). En resumen, se añadieron secuencialmente H2O doblemente destilada, 0,2 µmol/ml de ácido pirúvico, tampón de matriz y tampón de coenzima I 48 h después del tratamiento con el fármaco. Después de la incubación a 37 °C durante 15 min, se añadió 2,4-dinitro-fenilhidracina. Posteriormente, se añadieron a cada pocillo 250 µl de una solución de NaOH 0,4 M. El sobrenadante se recogió después de una incubación de 30 min a temperatura ambiente. Luego se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas.

Medición de malondialdehído (MDA). La MDA se midió en el sobrenadante de las células PC12 utilizando un kit comercial (cat. n.º 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, se agregaron en orden alcohol deshidratado y otros reactivos, seguidos de incubación en un baño de agua. a 95˚C durante 40 min. La mezcla se centrifugó a 1006 xg y 25 °C durante 10 min después de enfriar. Luego se usó el sobrenadante para determinar el contenido de MDA. Posteriormente se midió la absorbancia con un lector de microplacas a 532 nm.

Evaluación de los efectos protectores del equinacósido y el acteósido contra la EA in vitro. Se sembraron células PC12 a una densidad de 3x104 células/pocillo en 96-placas de pocillos (100 µl/pocillo). Las células se incubaron con fármacos que incluían equinacósido (n.º de cat. 111670-200503; Institutos Nacionales para el Control de Drogas y Alimentos, Pekín, China) y acetónido (n.º de cat. 111530-200505; Institutos Nacionales para el Control de Drogas y Alimentos). ) a varias concentraciones (0,5, 25 y 50 µg/ml). Posteriormente, las células se trataron con A 1-42 o H2O2 durante 24 h y se midió la viabilidad celular mediante un ensayo MTT.

Análisis estadístico. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. La prueba t de Student se utilizó para las comparaciones entre grupos. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE. UU.). PAGS<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultados

Cuantificación de PhGs de H. Cistanches. Los espectros ultravioleta de laPhGextraídos, así como soluciones estándar deechinacósidoyacteósidose registraron, y los resultados mostraron que los espectros UV eran consistentes (Fig. 1). espectrofotometría ultravioleta

mostró que el contenido de PhG era del 87,6 por ciento. Los resultados de la HPLC mostraron que los contenidos de equinacósido y acteósido fueron 37,7 y 17,8 por ciento, respectivamente (Fig. 2).

Determinación de la concentración ideal de PhG. En comparación con el grupo en blanco, PhG a 75, 100, 125, 150, 175 y 200 µg/ml tuvo un efecto inhibidor significativo sobre las células PC12 (P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80 por ciento (Fig. 3). Por tanto, se usaron PhG a la concentración de 5, 25 y 50 µg/ml para tratar células PC12 en experimentos posteriores debido a que no afectaban a la viabilidad celular.

Una lesión celular PC12 inducida por 1‑42. En comparación con el grupo de control, la viabilidad celular en el grupo de lesión 0.5 µM A 1-42 fue del 63 por ciento (P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="" in="" vitro="" ad="">

También se determinó la actividad de las células PC12 tratadas con 00,5 µM A 1-42 en presencia de dosis seguras de PhG (5, 25 y 50 µg/ml) durante 24 h. En comparación con el grupo modelo (P<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">

Lesión de células PC12 inducida por H2O2. La viabilidad de las células PC12 tratadas con H2O2 25 µM disuelta en DMEM con PBS fue del 56,43 por ciento. La viabilidad de las células PC12 tratadas con H2O2 200 µM disuelta en DMEM sin PBS fue del 71,64 por ciento (Tabla I). Por tanto, las células PC12 tratadas con H2O2 25 µM disuelta en DMEM con PBS se seleccionaron como la condición óptima para establecer el modelo AD.

En comparación con el grupo de control, la viabilidad celular en el grupo modelo fue del 48,8 por ciento (P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">

PhGs, y la viabilidad de las células PC12 tratadas con PhGs a concentraciones de 5, 25 y 50 µg/ml fue del 54, 57 y 64 por ciento, respectivamente (Tabla II).

Los PhG inhiben la liberación de LDH inducida por lesiones por parte de las células PC12. En comparación con el grupo de control, el contenido de LDH del sobrenadante de las células PC12 dañadas aumentó, lo que fue inhibido por PhG de manera dependiente de la concentración. Este resultado indicó que las PhG tienen un efecto neuroprotector significativo en las células PC12 (Fig. 6).

Tabla I. Viabilidad celular (porcentaje) después del tratamiento con H2O2.

Tabla II. Viabilidad celular después de la interferencia de fármacos.

inhibido por PhGs de una manera dependiente de la concentración. Este resultado indicó que las PhG tienen un efecto neuroprotector significativo en las células PC12 (Fig. 7).

PhG y sus componentes echinacoside y acteoside rescatan la viabilidad de las células PC12 dañadas. En comparación con el grupo modelo, el tratamiento con acteósido aumentó significativamente la viabilidad de las células PC12 dañadas por A 1-42- de una manera dependiente de la dosis. Los PhG y el equinacósido también aumentaron significativamente la viabilidad de las células PC12 dañadas por A 1-42-en todas las concentraciones probadas (Fig. 8A).

**P<0.05, vs.="" model="" group.="" aβ,="" â-amyloid="" peptide;="" phgs,="" phenylethanoid="" glycosides;="" ech,="" echinacoside;="" as,="">

En comparación con el grupo modelo, el acteósido aumentó significativamente la viabilidad de las células PC12 tratadas con H2O2. Los PhG también aumentaron la viabilidad de las células PC12 tratadas con H2O2, mientras que el efecto no fue significativo a concentraciones de 5 y 25 µg/ml (Fig. 8B). Además, el equinacósido aumentó la viabilidad celular a 25 µg/ml.

En conclusión, el acteósido, las PhG y el equinacósido ejercieron efectos neuroprotectores significativos en las células PC12 sometidas a lesión con A 1-42 o H2O2.

Discusión

El estrés oxidativo es el principal mecanismo subyacente a la neurotoxicidad mediada por A en la EA (11-13). Por lo tanto, atacar el estrés oxidativo puede representar un enfoque para el tratamiento de la EA. En el presente estudio, se estableció con éxito un modelo in vitro de EA que comprende lesión celular PC12 inducida por A 1-42- y H2O2-. Los resultados de los ensayos de MTT, LDH y MDA mostraron que los PhG aumentaron la viabilidad celular y disminuyeron la liberación de LDH y MDA por parte de las células PC12 sometidas a lesión. Se puede concluir que las PhG tienen efectos neuroprotectores significativos en las células PC12.

Para reducir los efectos de los propios PhG en el crecimiento de células PC12 y prevenir la proliferación anormal, se determinó la dosis segura de PhG en un ensayo de detección. Los resultados mostraron que los PhG a 75, 100, 125, 150, 175 y 200 µg/ml tenían un efecto inhibidor significativo sobre las células PC12 (P<0.05,><0.01), while="" cell="" viability="" remained="">80 por ciento a concentraciones de 5, 25 y 50 µg/ml. Por lo tanto, las PhG a la concentración de 5, 25 y 50 µg/ml eran seguras para las células PC12.

La lesión por A {{0}} se vio afectada por ciertos factores, incluidos el solvente, el tiempo de incubación y la calidad del producto. En el presente estudio, el péptido A 1-42 se disolvió en agua (100 µg/ml) y se incubó a 37 °C durante 4 días en una incubadora de CO2 antes de su uso. Las células PC12 se trataron con A 1-42 en concentraciones de 0,5, 1, 1,5 y 2 µM. Los resultados mostraron que la viabilidad celular disminuyó con el aumento de A 1-42, y la viabilidad fue<50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups.="" thus,="" treatment="" of="" pc12="" cells="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="" ad="" model.="" aβ25-35="" has="" been="" commonly="" used="" to="" establish="" ad="" models="" due="" to="" its="" low="" cost="" and="" simple="" operation="" (27-29).="" the="" neurotoxicity="" of="" aβ1-42="" is="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" aβ25-35,="" and="" aβ1-42="" is,="" therefore,="" the="" optimal="" aβ="" fragment="" for="" establishing="" an="" ad="" model="">

El H2O2 es un oxidante y el exceso de H2O2 puede causar daño oxidativo e inducir la apoptosis celular (30). En el presente estudio, las células PC12 se trataron con 25-500 µM de H2O2 disueltas en DMEM con o sin PBS. Los resultados mostraron que el H2O2 disuelto en DMEM sin PBS provocó una proliferación anormal de células PC12. Por lo tanto, el tratamiento de células PC12 con H2O2 25 µM disuelto en DMEM con PBS fue la condición óptima para establecer el modelo AD. La lesión inducida por a 1-42-fue mayor que la lesión inducida por H2O2-debido a la mala estabilidad del H2O2 y los efectos del disolvente.

Cuando la célula está dañada, la fuga de LDH al medio de cultivo aumenta significativamente. Se sabe que ROS causa la producción de MDA. El contenido de MDA y LDH, por lo tanto, refleja la cantidad de daño oxidativo. En el presente estudio, la actividad de LDH y MDA inducida por daño disminuyó con dosis crecientes de PhG. Estos resultados indicaron que PhGs tiene un efecto neuroprotector significativo en las células PC12. El ensayo MTT mostró que las PhG exhibieron un efecto neuroprotector dependiente de la dosis en las células PC12.

En conclusión, se estableció con éxito un modelo in vitro de EA que comprende lesión celular PC12 inducida por A 1-42- y H2O2-. El tratamiento con PhG aumentó la viabilidad celular y disminuyó la liberación de LDH y MDA por parte de las células PC12 tratadas con A 1-42 o H2O2. Los PhG tuvieron un efecto neuroprotector significativo en la lesión celular inducida por A 1-42- o H2O2-.

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