Análisis De Composición Y Actividades Inmunológicas De Los Oligosacáridos Aislados De Cistanche Deserticola

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Resumen.Se obtuvo un oligosacárido (CDOS) a partir deCistanche deserticamediante extracción con álcali (pH{{0}}), precipitación con etanol y fraccionada en dos fracciones purificadas (es decir, CDOS-1 y CDOS-2) mediante Sephadex G-100 y cromatografía de filtración en columna Sephadex G-25. La composición de monosacáridos del CDOS se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Se encontró que CDOS-1 solo estaba compuesto por sacarosa y CDOS-2 estaba compuesto principalmente por sacarosa, ramnosa y manitol, con una relación molar de 1:0,73:3,61. Las pruebas inmunológicas indicaron que CDOS presentó un efecto significativo en el índice de bazo de ratón, aumentando la actividad de fagocitosis de los macrófagos y estimulando la proliferación de células productoras de anticuerpos. Se espera que el CDOS se convierta en alimento o medicina funcional.

Palabras clave:Cistanchedeserticola, oligosacárido, purificación, composición, actividades inmunológicas.

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1. Introducción

Cistanchedeserticola YCMa. (Familia Orobanchaceae) es una pequeña planta parásita nativa del noroeste de China. La planta entera seca (sin flores) se conoce como tónico y se llama "Rou Congrong". En la medicina oriental, se clasifica en sabor dulce y salado, de naturaleza cálida y atribuible a los canales del riñón y del intestino grueso, con el funcion devigorizantelariñóny complementar la esencia, hidratar el intestino y relajar los intestinos [1]-[3]. El estudio farmacológico moderno demostró que podría impulsar la síntesis de ADN y retrasar el proceso de senilidad, aumentar la actividad antioxidante [4], prevenir y tratar enfermedades cardiovasculares [3]. Además, también podría causar efectos analgésicos yanti-inflamatorio[5], mejoran el aprendizaje y la memoria al inducir factores de crecimiento nervioso [6]. Algunos estudios indicaron que los extractos de C. deserticola podrían activar la función fagocítica de los macrófagos intraabdominales en ratones [7]-[9] ymejorar elcuerpo's inmunidad[10]. Según los estudios previos, esta planta contiene múltiples componentes activos que incluyen glucósidos feniletanoides, iridoides, lignanos, sacáridos, alcaloides, etc. [11] Como la C.deserticolafeniletanoideglucósidosy los polisacáridos se reconocen como los principales componentes activos, numerosos estudios se han centrado en sus estructuras y bioactividades durante las últimas décadas [12]-[17]. En cuanto a los valiosos oligosacáridos enC. deserticola, los informes son bastante limitados. Los oligosacáridos, un sacárido de cadena corta que contiene homo o heteroazúcares, son bien conocidos por sus efectos beneficiosos en la vida humana y se han utilizado ampliamente durante mucho tiempo [18]. Los oligosacáridos funcionales, que tienen una función fisiológica como baja cariogenicidad y factor de crecimiento de bifidobacterias [19], mejoran la salud de humanos y animales. Se han utilizado como ingrediente alimentario. Recientemente, se informaron nuevas funciones de los oligosacáridos, que tienen la capacidad de modular el sistema inmunológico en humanos, animales y peces [20]. En este artículo, presentamos la primera parte de los resultados del programa de investigación, el fraccionamiento de los oligosacáridos totales obtenidos del extracto alcalino de C. deserticola mediante una combinación de ultrafiltración y cromatografía de permeación en gel, y el análisis de la composición de los mismos mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Además, también presentamos las actividades inmunológicas de los oligosacáridos de C. deserticola. Hasta donde sabemos, hay pocos informes publicados sobre los estudios de actividad inmunoestimuladora deC. deserticolaoligosacáridos.

2. Experimental

2.1. Materiales

La C. deserticola se cultivó y recolectó en Alxa League (Mongolia Interior, China). Se compraron ratones Kunming (Grado II, seis semanas de edad) del Centro Experimental de Farmacología de la Universidad de Mongolia Interior. Sephadex G-100, Sephadex G-25, ácido trifluoroacético (TFA), 1-fenil-3-metil-5- pirazolona (PMP), D-glucosa, D- galactosa, D-fructosa, D-xilosa, D-manosa, ácido D-galacturónico, ácido D-glucurónico, sacarosa, ramnosa, manitol, fucosa, ramnosa, se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). El RPMI medio-1640 se adquirió de Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, EE. UU.). Todos los demás productos químicos eran de grado analítico.

2.2. Extracción de oligosacáridos

Los cuerpos secos de C. deserticola se cortaron en trozos más pequeños y luego se trituraron hasta convertirlos en polvo mediante un molino y se extrajeron con etanol anhidro (3 x 5000 ml) a 70 grados durante 3 horas a presión atmosférica. Se fijó un condensador de reflujo para eliminar los lípidos. A continuación, el residuo que quedó se extrajo con álcali (pH=10) a 60 grados durante 3 veces (2 h cada vez). Después de la centrifugación (2000 g durante 15 min, a 20 grados), el sobrenadante se concentró a una décima parte del volumen en un evaporador rotatorio a presión reducida a 50 grados y se filtró. Luego, el filtrado se desproteinizó con el reactivo Sevag [21] y se decoloró con carbón activado.

2.3. Aislamiento y purificación de oligosacáridos

Los oligosacáridos crudos liofilizados se disolvieron en agua destilada, se centrifugaron y luego el sobrenadante se purificó mediante una columna Sephadex G-100 (1x50 cm), equilibrada con agua ultrapura. Después de cargar con la muestra, la columna se eluyó con agua ultrapura a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se recogieron diferentes fracciones usando tubos de ensayo. El contenido total de carbohidratos de cada tubo se midió a 490 nm por el método de fenol-H2SO4 [22]. La solución eluida con agua se separó en dos fracciones CDOS-1 y CDOs-2. Dos fracciones se purificaron adicionalmente respectivamente en una columna Sephadex G-25 (2,7 x 85 cm) utilizando agua ultrapura (a un caudal de 1 ml/min). Después de recolectar la fracción purificada, se liofilizó.

2.4. Análisis de la composición de monosacáridos

La composición de monosacáridos de los CDO se obtuvo mediante análisis HPLC. Los CDO (2 mg) se hidrolizaron primero con metanol anhidro que contenía HCl 2 M a 80 grados durante 16 h en atmósfera de nitrógeno y luego con TFA 2 M a 120 grados durante 1 h. Después de eliminar el TFA por evaporación, los hidrolizados se derivatizaron posteriormente con PMP de acuerdo con el método informado [23] y se analizaron por HPLC. La separación por HPLC se realizó en el sistema EF-2002 HPLC (empresa KNAUER, Alemania). Los derivados de PMP se cromatografiaron utilizando volumen Sugar-PAK (6,5 x 300 mm, empresa de vasos de agua, Estados Unidos) y se midió la absorbancia a 245 nm. El volumen de inyección fue de 20 µl y la fase móvil, compuesta por PBS (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B), se utilizó para la elución isocrática en una proporción de volumen del 82 % (A) al 18 % (B). El tiempo total de ejecución de HPLC fue de 40 min y el caudal fue de 0,5 ml/min.

2.5. Actividades inmunobiológicas

2.5.1. Función fagocítica de monocitos-macrófagos

Sesenta ratones Kunming (Grado II, seis semanas de edad) se adquirieron del Centro Experimental de Farmacología de la Universidad de Mongolia Interior y se aclimataron durante 1 semana antes de su uso. Todos los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos, que consistían en un grupo de control de solución salina, un grupo de dosificación alta de CDO, un grupo de dosificación moderada y un grupo de dosificación baja de CDO. A los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal una solución de oligosacáridos de 0,5 ml una vez al día durante 5 días. El grupo de dosis alta, moderada o baja de CDO recibió 10{{10}}, 50 o 25 mg/kg/PC de CDO, respectivamente; y se inyectaron 0,5 ml de solución salina en el grupo de control. El séptimo día se realizó un experimento de depuración de partículas de carbono, según Hou [24], y se midió el índice de bazo y el índice de timo. Brevemente, se inyectaron 0,05 ml/10 g/bw de tinta china en cada ratón a través de la vena caudalis, luego se obtuvieron 20 μl de sangre de la vena orbitalis posterior 3 y 7 minutos después de la inyección. Las muestras de sangre se colocaron en tubos con 2 ml de Na2CO3 al 0,1 por ciento y los valores de DO se midieron a 600 nm. El índice de aclaramiento (K), el índice fagocítico ( ) y el índice de órganos inmunitarios se calcularon de la siguiente manera (1), t2 y t1 significan 7 minutos y 3 minutos respectivamente.

2.5.2. La proliferación de células productoras de anticuerpos

Se inmunizaron grupos de ratones Kunming (cinco por grupo) mediante inyección intraperitoneal de 2 x 107 SRBC en 1,0 ml de PBS a los que se añadieron 50 ug de materiales de prueba (ninguno en el control). Una semana después, se cultivaron esplenocitos (106 células por 2 ml por pocillo) de ratones Kunming con o sin materiales de prueba durante 72 h en medio RPMI 1640 al 10 % bajo CO2 al 5 % en el aire, por triplicado para cada cultivo. Se determinó el número de PFC contra SRBC por 106 esplenocitos [25], [26].

2.6. análisis estadístico

Los datos se expresaron como valores medios ± DE. La diferencia entre los grupos probados y el control se analizó mediante la prueba t de Student. P < 0.05="" se="" consideró="">

3. Resultados y discusión

3.1. Aislamiento y purificación de oligosacáridos

Los CDO se aislaron del extracto alcalino de los cuerpos secos de C. deserticola con un rendimiento del 3,07 por ciento. Se aislaron dos fracciones de CDOS-1 y CDOS-2 del agua destilada eluida mediante la columna Sephadex G-100, respectivamente (Fig. 1). Las fracciones purificadas de CDOS-1 y CDOS-2 mostraron un solo pico en la columna Sephadex G-25, lo que indica que no había otros oligosacáridos presentes en la muestra. Los resultados de las composiciones de monosacáridos mostraron que CDOS-1 solo estaba compuesto de sacarosa (Fig. 2) y CDOS-2 estaba compuesto principalmente de sacarosa, ramnosa y manitol (Fig. 3), con una relación molar de 1:0.73:3.61.

3.2. Actividades inmunobiológicas de las CDO

Mucha evidencia in vivo e in vitro ha demostrado que los oligosacáridos naturales muestran una función inmunomoduladora al estimular tanto la función celular como la humoral.inmune respuestas[27], [28]. En este documento, 100 mg/kg/BW de CDO aumentaron el índice de bazo de ratón, pero no hubo diferencias significativas en el índice de timo entre los grupos tratados y los grupos de control (Tabla 1). Los macrófagos son un componente importante de las defensas del huésped contra la infección viral al inhibir la replicación intracelular de virus y al matar las células infectadas por virus [29]. Cuando se activa, los macrófagos liberan una variedad de intermediarios de oxígeno o nitrógeno y citoquinas que participan en varias funciones biológicas importantes, como actividades antiinflamatorias y antitumorales [30]-[32]. Por lo tanto, la actividad fagocítica de los macrófagos es un indicador importante de las funciones inmunitarias del organismo. En este estudio, las dosis moderadas y altas de CDO aumentaron la actividad de fagocitosis de los macrófagos (Tabla 1). La proliferación de células productoras de anticuerpos inducida por CDO se estudió mediante el examen del aumento de la PFC hemolítica en los bazos de ratones Kunming que se inmunizaron con SRBC más el espécimen de prueba. Los resultados indicaron que las dosis moderadas y altas de CDO mejoran significativamente la proliferación de células productoras de anticuerpos (Tabla 2). Altas dosis de CDO causaron un aumento muy significativo en el recuento de PFC (P <>

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