¿Cómo el extracto acuoso de cistanche promueve el peristaltismo intestinal y mejora el estreñimiento?

Shuai Yan,1,2 Yin-zi Yue,1 Xiao-peng Wang,1 Hong-li Dong,1 Shu-guang Zhen,1 Ben-sheng Wu,1 y Hai-hua Qian3

Se informó que la medicina tradicional china tiene buenos efectos en el tratamiento del estreñimiento funcional. Este trabajo intentó probar los efectos de los extractos acuosos de HerbaCistanche(AEHC) en el tratamiento de STC y determinar los posibles mecanismos mediante un modelo de estreñimiento de tránsito lento (STC) inducido por loperamida. Se realizó HPLC para la identificación y confirmación de los componentes bioactivos en el AEHC. Se encontró que AEHC atenuó las respuestas de STC en función del aumento de la cantidad fecal, el contenido de humedad y la tasa de tránsito intestinal, así como los niveles séricos de GAS, MTL, SS y CGRP. También aumentaron los niveles de proteína y mRNA del c-kit, marcador de células intersticiales de Cajal (ICC). Mientras tanto, solo aumentó el nivel de proteína de SCF, un ligando de ckit. El análisis de nuestros datos sugirió que AEHC obviamente podría mejorar la función de ICC a través de una vía de señalización que involucra PI3K, SCF y c-kit y mejorar los índices de motilidad colónica como GAS, MTL, SS y CGRP. Es interesante notar que AEHC pareció ser efectivo en el estreñimiento, por lo que se necesitan más experimentos para aclarar los mecanismos exactos involucrados.

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el acteósido en la cistanche tiene buenos efectos sobre los antioxidantes

1. Introducción

El estreñimiento es una enfermedad gastrointestinal funcional común y un problema de salud pública, caracterizado por una defecación continuamente difícil, infrecuente o incompleta [1]. La prevalencia del estreñimiento varía de 0.7 por ciento a 81 por ciento en todo el mundo, especialmente en los ancianos [2, 3]. El estreñimiento de tránsito lento (STC) es una queja gastrointestinal común entre el 13 y el 37 por ciento de los pacientes con estreñimiento crónico resistente al tratamiento [4, 5]. Los datos epidemiológicos indican una mayor incidencia de STC entre las mujeres jóvenes que entre los hombres [6]. STC causa estreñimiento intratable, que muestra poca respuesta al tratamiento conservador y una tendencia al trastorno neurodegenerativo. No tan simple como una enfermedad funcional, requiere un tratamiento invasivo y agresivo [7].

Una serie de fármacos químicos actuales, como los laxantes osmóticos o secretores y los agentes de carga, se utilizan universalmente para

tratar el estreñimiento [8], aunque sus aplicaciones son limitadas debido a los altos gastos y los efectos secundarios abdominales como dolor, calambres e hinchazón [9]. En la actualidad, la regulación del tracto gastrointestinal es el foco principal de las terapias contra el estreñimiento. La cisaprida se generó por primera vez como un agente de promoción para el tratamiento de la enfermedad gástrica, pero luego se retiró debido al riesgo de arritmias cardíacas [10].

Tegaserod es un antagonista selectivo del receptor de 5-hidroxitriptamina que puede estimular el peristaltismo y la secreción intestinal [11, 12]. La prucaloprida es un nuevo derivado de dihidro benzofurano carboxamida y un agonista del receptor 5-HT con alta selectividad y especificidad, que puede mejorar la motilidad gástrica, del intestino delgado y del colon y funciona más rápido en la dinámica [13–15]. Como derivado de la prostaglandina E1, la lubiprostona puede activar selectivamente el canal CIC para promover la secreción gastrointestinal y aumentar los efectos de la transmisión intestinal [16].

La motilidad en el estreñimiento es un problema generalizado, pero su etiología aún no está clara. Sin embargo, evidencia convincente ha demostrado la contribución de las células intersticiales de Cajal (ICC) a la patogenia del estreñimiento [17]. ICC se encuentra entre las terminaciones nerviosas y las células del músculo liso en el tracto gastrointestinal. Las ICC son generalmente reconocidas como células marcapasos para la actividad gastrointestinal y como mediadores de la transmisión neuromuscular [18]. Los estudios han indicado que la densidad de ICC en el colon de pacientes con estreñimiento de tránsito lento es notablemente más baja en comparación con la de los pacientes normales [19]. En consecuencia, un número decreciente de ICC puede conducir a una escasez de actividad de onda lenta, afectando así la respuesta contráctil e induciendo un tránsito retrasado en pacientes con estreñimiento de tránsito lento. Para este punto, la mejora de la ICC con productos farmacéuticos puede ser crucial para curar el estreñimiento de tránsito lento.

Varias medicinas a base de hierbas y fórmulas chinas tradicionales han llamado la atención recientemente como terapias novedosas para el tratamiento del estreñimiento crónico como resultado de una mejor producción de heces [20, 21]. HerbaCistanchees una medicina herbaria tradicional utilizada en el tratamiento de la enfermedad renal crónica, la infertilidad femenina, la menorragia profusa y la impotencia [22, 23]. HerbaCistanchepreviene la apoptosis de las neuronas cerebrales mediante la expresión de factores relacionados con la apoptosis y factores neurotróficos en las células MES23.5 [24]. Herba Cistanche también ha demostrado potencial farmacéutico en el tratamiento del Síndrome de Deficiencia de Yang-Qi Riñón-Yang. Un estudio reciente ha demostrado que HerbaCistancheaumenta la respiración mitocondrial y el estado antioxidante del glutatión en los cardiomiocitos H9c2 [25].

TCM cree que el estreñimiento tiene una estrecha relación con los riñones. Al abrirse en los genitales externos y el ano, el riñón gobierna la micción y la defecación. El transporte de los desechos se basa en la promoción del qi del riñón y la nutrición del yin del riñón. Si el yang del riñón es deficiente o el fuego de la puerta de la vida se extingue, la congestión fría del intestino grueso resultará en el estancamiento de los desechos. El estreñimiento también es causado por evacuaciones intestinales secas, ya que la deficiencia de esencia renal no genera suficiente líquido [26].

HerbaCistanchees una hierba unificadora común, que tiene un sabor dulce y salado y una naturaleza cálida. Atribuido a los meridianos del intestino grueso y del riñón, puede tonificar el yang del riñón y humedecer el intestino para aliviar el estreñimiento. Esta hierba única y sus preparaciones farmacéuticas chinas se han utilizado ampliamente para tratar el estreñimiento con una eficacia notable [27].

En China, los efectos de HerbaCistancheSe han registrado raíces sobre el estreñimiento [28, 29] y en la Materia médica china de Shen Nong se las denomina "tallos suculentos secos de laCistancheespecie" [30]; sin embargo, la prueba científica sobre el efecto de HerbaCistancheraíces sobre el estreñimiento no ha existido hasta ahora, la dosis clínicamente efectiva es de 20 g por día en la Farmacopea China, y el efecto clínico no aumenta más con la dosis.

Desde HerbaCistanchees tan escaso [31], la estandarización de su dosificación clínica para el tratamiento de STC mediante un estudio experimental no solo evita el fracaso del tratamiento debido a una dosificación inadecuada, sino que también evita que los pacientes sufran pérdidas económicas e incluso desventuras con la medicación por uso excesivo. Esperamos

los resultados podrían sentar una base científica para nuevos medicamentos para el estreñimiento. Por lo tanto, es importante investigar el Herba acuosoCistanche'sfunción de la promoción intestinal y su acción sobre la ICC en el presente estudio.

2. Materiales y métodos

2.1. Preparación de Extracto Acuoso de Herba Cistanche.

Todo HerbaCistanchefueron adquiridos de Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co., Ltd. (Nanjing, China), que fueron cosechados, recolectados y procesados ​​siguiendo las prácticas etnobotánicas estándar de las plantaciones en el área de Sinkiang en China. La identidad de la planta fue comprobada morfológicamente por el profesor Tu Lin Lu de la Universidad de Medicina China de Nanjing, Nanjing, China. Se depositó una muestra de comprobante (NUCMCHS-2015628) en la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Medicina China de Nanjing, Nanjing, China.

Rodajas de HerbaCistanche, con un peso de 500 g, se pulverizaron con una batidora eléctrica y se extrajeron en 5000 ml de agua destilada, luego de lo cual el extracto acuoso se purificó a 100 C durante 2 h con un equipo de extracción circulante.

poro de membrana (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.), y el residuo obtenido de los extractos se disolvió en 4000 ml de agua. Después de la extracción a reflujo, los extractos se recolectaron y evaporaron para obtener el producto de muestra final. Los extractos acuosos se concentraron a gránulos secos (1 g/ml) usando un

para uso posterior. Las muestras sólidas se reconstituyeron en agua destilada para dar las dosis requeridas de 10, 20 y 40 mg/kg de peso corporal para el experimento.

2.2. animales

El protocolo experimental utilizado en este estudio fue revisado y aprobado en base a procedimientos éticos y atención científica por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Medicina Tradicional China de Suzhou, Suzhou, China (SHTCM-IACUC; número de aprobación: PNU{{2} }). Todas las ratas macho (cepa Sprague Dawley) con ag se compraron en el Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de Shanghai de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud. Los animales tenían libre acceso a una dieta estándar (AIN-93 M) y agua del grifo ad libitum y se alojaron individualmente en acero inoxidable con porcentaje de humedad relativa y se expusieron a 12 h de luz natural y 12 h de oscuridad al día.

2.3 Diseño Experimental.

La loperamida se usó para inducir el estreñimiento en ratas de acuerdo con estudios previos [32, 33]. Un total de 60 ratas se dividieron aleatoriamente en 5 grupos (por grupo): A: grupo normal (NG), B: grupo modelo (grupo tratado con Lop más vehículo), C: un grupo de ratas con estreñimiento tratadas con extracto acuoso bajo de Herba Cistanche (grupo tratado con Lop más LAEHC), D: un grupo de ratas con estreñimiento tratadas con extracto acuoso medio de Herba Cistanche (grupo tratado con Lop más MAEHC), y E: un grupo de ratas con estreñimiento tratadas con extracto acuoso alto de Herba Cistanche (Lop más grupo tratado con HAEHC). El grupo A se trató con solución salina normal (10 ml/kg); El grupo B fue tratado con loperamida

(4mg/kg); el grupo C se trató con loperamida (4 mg/kg) y extracto bajo en agua de Herba Cistanche (1 g/kg); El grupo D se trató con loperamida (4 mg/kg) y extracto acuoso medio de Herba Cistanche (2 g/kg), y el grupo E con loperamida (4 mg/kg) y extracto acuoso alto de Herba Cistanche (4 g/kg). kg). A todas las ratas del grupo normal se les inyectó 0,9 por ciento de cloruro de sodio, mientras que a las otras se les inyectó loperamida en 0,9 por ciento de cloruro de sodio dos veces al día durante 3 días consecutivos para inducir el estreñimiento. El extracto acuoso de Herba Cistanche se suspendió en agua y se administró por vía oral una vez al día desde el día 4 hasta el día 18 en el Grupo C, Grupo D y Grupo E, mientras que los Grupos A y B recibieron un volumen constante de agua por sonda.

2.4. Condición cromatográfica.

El perfilado por HPLC se realizó en el Sistema cromatográfico de líquidos Shimadzu (Tokio, Japón), que consta de una bomba LC-20AT y un

fueron monitoreados a 330 nm a 30 C. La fase móvil isocrática consistía en metanol 0,1 por ciento de ácido fórmico (80: 20, v/v) y corría a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min . La separación cromatográfica fue

tamaño de partícula 5 m, Beijing Dikma Science and Technology Co., Ltd., Beijing, China).

2.5. Análisis de ejercicio, ingesta de alimentos, ingesta de agua, cuerpo

Se administró oralmente goma arable (una suspensión acuosa de 20 por ciento de carbón vegetal y 10 por ciento de goma arable) a un volumen de 25 ml/kg de cada animal. Después de 30 min, los animales fueron sacrificados humanitariamente por dislocación cervical y diseccionados. Se atravesó el intestino delgado desde el píloro hasta el ciego y se midió la distancia recorrida por la harina de carbón y la longitud total del intestino delgado. Para una rata individual, el porcentaje de tránsito intestinal se calculó como el porcentaje de la distancia recorrida por la harina de carbón en relación con la longitud total del intestino delgado. La siguiente ecuación calcula la tasa de tránsito intestinal (porcentaje): distancia recorrida por el carbón/distancia del píloro al ciego 100 por ciento.

2.6. Muestra de sangre y recolección de tejidos. Al final del período experimental, las ratas se sometieron a un ayuno de 12 h pero se les permitió acceso libre al agua. A continuación, todas las ratas se anestesiaron 30 minutos más tarde mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg) y se colocaron sobre una mesa con temperatura regulada. Se recogieron muestras de sangre y se centrifugaron a 3500 rpm durante 15 min para obtener suero. El colon se dividió inmediatamente y se lavó con solución salina normal a 4 °C y luego se dividió en dos partes. Un fragmento se fijó en formalina al 10 por ciento y se procesó en parafina fraccionada para su posterior análisis inmunohistoquímico (IHC), mientras que el otro fue Peso y Cabello. Alteraciones en el ejercicio, ingesta de alimentos, agua

almacenados a 80 C hasta que fueron ensayados. la ingesta, el peso corporal y el pelo se observaron y registraron diariamente durante todo el período experimental. Observamos "alteraciones en el ejercicio" siguiendo los pasos específicos: la caja de fabricación propia (60 cm de alto, 50 cm de largo y 80 cm de ancho con pared periférica oscura) se utiliza para la prueba de campo abierto; el fondo blanco estaba dividido en rombos (12 cm) por la línea negra en una habitación oscura y tranquila; una bombilla de 100 W colgaba 1 m por encima del centro de la caja; las ratas se colocaron en el centro de la caja en los días 4, 6, 12 y 18 del modelado. El número de cuadrados por los que pasaron las ratas en 5 minutos se utilizó como puntuación de movimiento horizontal y el tiempo de las ratas en posición vertical en 5 minutos se utilizó como puntuación de movimiento vertical. Las puntuaciones de movimiento horizontal y movimiento más las puntuaciones de movimiento vertical indican la cantidad de ejercicio de las ratas. Cada rata se midió una vez [34, 35].

2.7. Medición de parámetros fecales.

El último día de la administración oral, se recogieron gránulos de heces frescas de cada rata SD en tubos tapados de fondo redondo durante 6 h, y se registraron los pesos totales de cada grupo. Para determinar el contenido de humedad fecal, usamos una balanza eléctrica para secar los gránulos de heces hasta alcanzar un peso constante y medimos el peso seco. el contenido de humedad

2.8. Evaluación de GAS, MTL, SS y CGRP.

Las concentraciones de gastrina (GAS), motilina (MTL), somatostatina (SS) y péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) en el suero se estimaron mediante ELISA utilizando kits comercialmente disponibles.

2.9. Análisis histológico.

Los dos puntos transversales recolectados de ratas SD se fijaron con formalina al 10 por ciento durante 12 h, se incrustaron

m rebanadas gruesas que se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E, Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.). Las características morfológicas de estas secciones se observaron bajo microscopía óptica, después de lo cual se midió la longitud de las vellosidades, el grosor de las criptas y el grosor del músculo utilizando Leica Application Suite (Leica Microsystems, Suiza).

2.10. Análisis inmunohistoquímico.

Seguimos los métodos de Zhu et al. (2016) [36]; secciones de 5 m sin teñir fueron

teñido con anti-c-kit de conejo (1:100) a 4°C durante la noche. El método del anticuerpo secundario y del complejo avidina-biotina-peroxidasa se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó un control negativo de inmunoglobulina para eliminar la unión no específica. Niveles de expresión de c-kit

2.11. Análisis de la Tasa de Tránsito Intestinal.

La tasa de tránsito intestinal se realizó de acuerdo con los protocolos informados anteriormente [36]; Brevemente, después de 14 días de tratamiento, todas las ratas SD se sometieron a un ayuno de 12 h pero se les permitió libre acceso al agua.

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. Los niveles de expresión génica de los ARNm de c-kit, SCF y PI3K en el colon se determinaron utilizando un kit de extracción de ARN total (TIANGEN Biotech,

Beijing, China) de acuerdo con los protocolos del fabricante. La PCR en tiempo real se realizó con ABI StepOnePlus Real-Time PCR System (ABI). Se usó SYBR Green I Real-Time PCR Master Mix (QPK201, Toyobo, Japón) para detectar productos de PCR. Las reacciones se realizaron por triplicado. Posteriormente, se homologó tejido fresco de colon de rata que pesaba 0,5 g.

l) se extrajo de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, EE. UU.). Se usó un kit de PCR de transcripción inversa (Takara Biotechnology Co., Inc.) para sintetizar la primera cadena de ADNc de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todos los parámetros objetivo se muestran en la Tabla 1. El protocolo de ciclado se realizó bajo las siguientes condiciones: 95 C durante 5 min (desnaturalización del ADN), seguido de 40 ciclos de 95 C durante 15 s, 60 C durante 20 s y 72 C durante 40 s. Se realizó un análisis de la curva de fusión al final de los ciclos de amplificación.

2.12. Análisis de Western Blot.

Los contenidos de proteína de c-kit y SCF en homogeneizados de muestras de colon se evaluaron mediante transferencia Western. En resumen, las proteínas totales de los homogeneizados se determinaron mediante un ensayo de ácido bicinconínico (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE. UU.). Se usó gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) para separar proteínas en el sistema de electroforesis BioRad (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). Luego, las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de 2 h de tratamiento con tampón de bloqueo en TBS que contenía un 5 % de leche descremada a temperatura ambiente, las membranas de PVDF se incubaron durante la noche con anti-c-kit diluido 1:1000 (Santa Cruz, CA, EE. UU.), anti-c-kit diluido 1:500 SCF (Sigma, MO,

UU.), y anticuerpos anti-actina diluidos 1:8000 (Kangchen, Shanghái, China), respectivamente. La unión del anticuerpo primario se detectó utilizando el correspondiente anticuerpo secundario conjugado con HRP (Beyotime, Jiangsu, China). Se utilizó un kit de quimioluminiscencia mejorado (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, EE. UU.) y el sistema de imágenes infrarrojas Odyssey (Gene Company Ltd., Hong Kong) para la detección de quimioluminiscencia. La prolactina de limpieza se utilizó como control de carga. La cantidad de expresión de proteína se presenta en relación con los niveles de actina.

2.13. Análisis estadístico.

Los datos de medición se informaron como el error estándar medio de la media (SEM) y se analizaron mediante SPSS

16. 0 software (SPSS, Chicago, IL, EE. UU.). Se utilizó el análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de las pruebas de rango múltiple de Duncan para determinar diferencias significativas en todos los parámetros. Los valores se consideraron estadísticamente significativos en

3. Resultados

3.1. Composición y Componentes Funcionales de Herba Cistanche.

Como se muestra en la Figura 1, las raíces de Herba Cistanche contienen altas concentraciones de varios componentes bioactivos relacionados con efectos laxantes. Las concentraciones de echinacósidos totales y verbacósidos totales fueron 0,64 mg/g y 0,16 mg/g, respectivamente. Se detectaron dos picos que indicaban niveles elevados de equinacósido y verbascósido en el LP en un tiempo de retención adecuado mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

3.2. Observacion general.

Las ratas SP no murieron durante el transcurso del experimento, lo que indica una mayor seguridad y operatividad del modelo animal. En comparación con el Grupo A, las ratas en el grupo modelo mostraron pelaje esponjoso, lasitud, heces secas y

Empeoró con la extensión del tiempo de modelado.

3.3. Efecto de AEHC sobre el número de heces y el contenido de humedad en ratas con estreñimiento inducido por loperamida.

En comparación con las heces normales, las heces de los Grupos B, C, D y E estaban secas, pequeñas y duras y no estaban pulidas antes del tratamiento.

después de todo, a las ratas se les inyectó loperamida (tratadas con medicamentos que han aliviado los síntomas como cuerpo y 3(b)).

el peso no difirió significativamente entre todos los grupos experimentales, aunque el Grupo E mostró un peso corporal ligeramente menor que los otros grupos (Figura 2(a)). Además, las ratas SD con estreñimiento comieron significativamente menos comida que el Grupo A ( ), mientras que las diferencias entre los Grupos B, C, D y E (Figura 2(b)) no fueron significativas. El consumo de agua tampoco cambió entre el Grupo A y el Grupo B. Además, no se detectó un aumento significativo en el consumo de agua en

que el tratamiento con el AEHC no indujo ninguna alteración. Aunque la tasa de tránsito intestinal en los Grupos C, D y también fue significativamente mayor, los Grupos C, D y E tenían proporciones significativamente más bajas que el Grupo A.

3.4. Efecto de AEHC en la tasa de tránsito del intestino delgado en ratas con estreñimiento inducido por loperamida.

Como se ve en la Figura 4, no se detectaron diferencias en el tiempo de tránsito del intestino delgado de referencia entre los cinco grupos. El grupo B tiene una relación de propulsión de polvo de carbón conspicuamente más baja en comparación con el grupo A (𝑃 < 0.01).="" aunque="" la="" tasa="" de="" tránsito="" intestinal="" en="" los="" grupos="" c,="" d="" y="" e="" también="" fue="" significativamente="" mayor="" que="" la="" del="" grupo="" b="" (𝑃="">< 0.05),="" los="" grupos="" c,="" d="" y="" e="" tuvieron="" proporciones="" significativamente="" más="" bajas="" que="" el="" grupo="">

3.5. La intervención con AEHC mejora parcialmente la función del índice de motilidad colónica.

Los niveles séricos de GAS y MTL obtenidos de las ratas del Grupo B disminuyeron significativamente en comparación con los del Grupo A (𝑃 < {{0}}.01,="" resp.).="" por="" otro="" lado,="" los="" grupos="" c,="" d="" y="" e="" (𝑃="">< 0.05,="" respectivamente)="" tienen="" niveles="" efectivamente="" más="" altos="" de="" gas="" y="" mtl="" por="" la="" administración="" de="" extractos="" de="" herba="" cistanche="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" b="" los="" valores="" de="" ss="" en="" las="" ratas="" del="" grupo="" b="" fueron="" más="" altos="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" a="" (𝑃="">< 0.01);="" los="" grupos="" c,="" d="" y="" e="" tienen="" niveles="" atenuados="" de="" ss="" (𝑃="">< 0.05)="" (figura="" 5).="" en="" comparación="" con="" las="" ratas="" con="" estreñimiento,="" los="" niveles="" de="" cgrp="" en="" las="" ratas="" normales="" del="" grupo="" a="" (𝑃="">< 0,01)="" y="" en="" los="" grupos="" c,="" d="" y="" e="" administrados="" con="" herba="" cistanche="" fueron="" constantes="" (𝑃=""> 0,05).

3.6. Alteración Histológica de Colon.

Para investigar si el tratamiento con AEHC puede inducir una alteración estructural del tejido del colon, se midió la longitud de las vellosidades, el grosor de la capa de la cripta y el grosor del músculo en el colon transverso de ratas en los cinco grupos después de la tinción con H&E. Al comparar la patología del colon de las ratas de cada grupo, la mucosa colónica era lisa y contenía pequeñas arterias y pequeñas venas en la submucosa y un gran número de células adiposas. Además, la capa muscular estaba formada por células musculares lisas y la subserosa estaba completa. La longitud promedio de las vellosidades fue significativamente más corta en el Grupo B que en el Grupo A (𝑃 < {{0}}.01).="" sin="" embargo,="" la="" longitud="" promedio="" de="" las="" vellosidades="" en="" el="" grupo="" c="" aumentó="" considerablemente="" en="" más="" del="" 30="" por="" ciento="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" b="" (figuras="" 6="" y="" 7)="" (𝑃="">< 0.05).="" mientras="" tanto,="" la="" longitud="" promedio="" de="" la="" vellosidad="" aumenta="" considerablemente="" en="" los="" grupos="" d="" y="" e="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" b="" (figuras="" 6(a)="" y="" 6(b))="" (𝑃="">< 0.01).="" además,="" la="" alteración="" del="" grosor="" muscular="" fue="" muy="" similar="" a="" la="" longitud="" de="" las="" vellosidades.="" en="" el="" grupo="" b,="" el="" grosor="">

fue dramáticamente más delgado en comparación con el Grupo A. Sin embargo, los niveles de grosor muscular en los Grupos C, D y E aumentaron en un 30-35 por ciento en relación con el Grupo B (Figuras 6 y 7). En general, estos hallazgos indican que el AEHC puede aumentar la longitud de las vellosidades y el grosor del músculo en el colon de ratas con estreñimiento.

3.7. La administración del tratamiento con AHEC aumentó la expresión de proteínas de c-Kit y SCF.

Su inmunorreactividad se detectó en el colon ya que las células de todos los grupos dieron positivo para c-kit. Como se muestra en la Figura 8, el nivel de expresión de c-kit en el Grupo B fue más bajo que en el Grupo A (𝑃 < 0.05).="" el="" nivel="" de="" expresión="" de="" c-kit="" en="" el="" grupo="" c="" fue="" más="" alto="" que="" en="" el="" grupo="" b="" (𝑃="">< 0.{{20}}5),="" mientras="" que="" más="" c-kit="" estuvo="" presente="" en="" los="" grupos="" d="" y="" e="" que="" en="" el="" grupo="" b="" (𝑃="">< 0.05).="" después="" del="" tratamiento="" con="" diferentes="" concentraciones="" de="" extracto="" acuoso="" de="" herba="" cistanche="" durante="" 2="" semanas,="" los="" niveles="" de="" expresión="" de="" proteínas="" de="" c-kit="" y="" scf="" se="" detectaron="" mediante="" análisis="" de="" transferencia="" western.="" el="" análisis="" de="" transferencia="" western="" mostró="" que="" los="" niveles="" de="" expresión="" de="" c-kit="" y="" scf="" eran="" notablemente="" más="" bajos="" después="" del="" tratamiento="" con="" loperamida="" en="" colones="" de="" ratas="" (figura="" 9).="" la="" figura="" 8(e)="" demuestra="" que="" la="" disminución="" de="" c-kit="" en="" ratas="" con="" estreñimiento="" aumentó="" significativamente="" en="" un="" 31,2="" por="" ciento="" después="" de="" tratar="" a="" las="" ratas="" con="" 500="" 𝜇g/ml="" de="" aehc="" (𝑃="">< 0,05).="" además,="" el="" tratamiento="" con="" 100="" y="" 200="" µg/ml="" de="" aehc="" elevó="" los="" niveles="" de="" expresión="" de="" la="" proteína="" c-kit.="" la="" expresión="" de="" la="" proteína="" scf="" aumentó="" significativamente="" en="" un="" 20,1,="" 24,7="" y="" 8,4="" por="" ciento="" en="" el="" tratamiento="" con="" 100,="" 200="" y="" 500="" 𝜇g/ml="" de="" aehc,="" respectivamente="" (figura="" 9).="" 3.8.="" efecto="" de="" aehc="" en="" la="" expresión="" de="" arnm="" de="" c-kit,="" scf="" y="" pi3k.="" para="" investigar="" si="" el="" tratamiento="" con="" aehc="" puede="" afectar="" la="" regulación="" del="" arnm="" relacionado="" con="" la="" contracción="" muscular,="" se="" observaron="" alteraciones="" en="" los="" niveles="" de="" expresión="" de="" c-kit,="" scf="" y="" pi3k="" en="" el="" colon="" de="" ratas="" con="" estreñimiento="" utilizando="" cebadores="" específicos.="" los="" resultados="" mostraron="" que="" los="" niveles="" de="" arnm="" de="" c-kit="" en="" el="" grupo="" b="" fueron="" significativamente="" más="" bajos="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" a="" (𝑃="">< 0,05),="" mientras="" que="" los="" niveles="" de="" arnm="" en="" los="" grupos="" c,="" d="" y="" e="" fueron="" más="" altos="" que="" en="" el="" grupo="" b="" (𝑃="">< 0,05)="" (figura="" 10).="" también="" examinamos="" el="">

expresión de SCF, un ligando de kit. La expresión de ARNm de SCF en las ratas del Grupo B fue significativamente menor que en el Grupo A, mientras que el tratamiento con AEHC en los Grupos C, D y E aumentó la expresión de ARNm de SCF (Figura 10). Además, examinamos el efecto de AEHC en la expresión del gen PI3K. El día 14, el nivel de expresión del gen PI3K fue significativamente mayor en los Grupos C, D y E que en el Grupo B (𝑃 <>

4. Discusión

El estreñimiento es un trastorno muy común que se caracteriza por movimientos intestinales deficientes. Disminuye en gran medida la calidad de vida y genera enormes cargas económicas tanto para los pacientes como para el seguro nacional de salud [32]. Los productos naturales y los alimentos medicinales ahora atraen una atención cada vez mayor debido a su potencial para convertirse en nuevos medicamentos utilizados para el tratamiento del estreñimiento [37, 38]. Por lo tanto, estudiamos los efectos terapéuticos del AEHC en ratas con estreñimiento inducidas por loperamida. La loperamida, el difenoxilato de atropina y la morfina se usan ampliamente para inducir el estreñimiento en animales de laboratorio. Entre los tres fármacos, la loperamida induce una duración prolongada de la evacuación de las heces y un retraso del tránsito luminal intestinal, ya que inhibe tanto la secreción de agua como el movimiento fluido de la pared intestinal [39]. El análisis del peso corporal en este estudio no encontró ninguna diferencia dentro de cada grupo. Después del experimento, tampoco se encontró diferencia. El grupo de dosis baja de AEHC todavía vio el peso corporal más bajo, sin embargo, el grupo modelo y el grupo normal presenciaron el peso corporal más alto. El estreñimiento es generalmente una enfermedad funcional. El estreñimiento de tránsito lento inducido en este estudio no afectó la absorción de nutrientes de las ratas ni su peso corporal durante el experimento. No existían diferencias en las cantidades de heces de las ratas y su contenido de humedad entre los grupos antes del modelo; sin embargo, ambos disminuyeron notablemente después del modelado y el contenido de humedad de las heces aumentó después de usar AEHC en diferentes dosis. Después de estudiar la tasa propulsora de polvo de carbón del colon.

de ratas, el grupo modelo observó una disminución evidente de la tasa, mientras que se mantuvo normal en los grupos de dosis baja, media y alta de AEHC. Los resultados mostraron que el estreñimiento de tránsito crónico inducido por loperamida tratado con diferentes dosis de Herba Cistanche puede recuperar la función propulsora del colon en diferentes grados. Las hormonas gastrointestinales son sustancias bioactivas de alto rendimiento secretadas por las células endocrinas de la mucosa gastrointestinal y el páncreas, que poseen efectos tanto de excitación como de inhibición para regular la función motora gastrointestinal [40, 41], de los cuales GAS, MTL y SS tienen efectos importantes. Las dos primeras hormonas estimulan la secreción de jugo digestivo, constriñen el músculo liso gastrointestinal, promueven el movimiento del contenido gastrointestinal y excitan la motilidad gastrointestinal. SS, por el contrario, inhibe la secreción de jugo digestivo, la contracción del músculo liso gastrointestinal y el vaciamiento gastrointestinal [42]. Se encontró que los niveles de GAS y MTL en el tejido del colon del grupo modelo eran los más bajos, lo que indica que el método de modelado ciertamente redujo la concentración de GAS y MTL en el tejido del colon. Como las principales hormonas gastrointestinales de la motilidad del colon, la concentración de GAS y MTL aumentó con diferentes dosis de AEHC y, por lo tanto, mejoró la motilidad del colon. Por el contrario, el nivel de SS en el tejido del colon del grupo modelo fue el más alto, lo que indica que el método de modelado puede promover la concentración de SS en el tejido del colon. CGRP es uno de los vasodilatadores más poderosos y su efecto de relajación es 10-veces más fuerte que el efecto de contracción. Como importante neurotransmisor o neuromodulador que regula las funciones digestivas, el CGRP puede inhibir la mayor parte de la motilidad gastrointestinal y la secreción de diversos jugos digestivos [43]. La concentración de CGRP en el grupo modelo fue más alta que en el Grupo A, lo que indica que el método de modelado puede aumentar la concentración de CGRP en el tejido del colon, lo que también puede ser uno de los factores para la reducción del peristaltismo colónico que provocará estreñimiento. La concentración de CGRP en el tejido del colon de los grupos AEHC fue menor que la del grupo modelo, lo que sugiere que AEHC tuvo un efecto inhibidor relativamente débil sobre el movimiento del colon. c-Kit es una proteína transmembrana. El factor de células madre (SCF) de su ligando es producido por células neuronales y células musculares lisas. Promueve el desarrollo y diferenciación de ICC y mantiene su función fisiológica normal. El etiquetado de c-Kit refleja indirectamente la cantidad y densidad de ICC [44, 45]. Además, la célula ICC juega un papel clave en la regulación de la motilidad gastrointestinal y actúa como marcapasos del movimiento gastrointestinal. Por lo tanto, algunos trastornos de la motilidad gastrointestinal pueden encontrar una disminución en la cantidad y función de las células ICC. Según estudios previos, se redujeron los recuentos de células en el colon de pacientes con estreñimiento crónico de tránsito. Por lo tanto, el presente estudio observó las células colónicas de ratas utilizando técnicas inmunohistoquímicas y de expresión específica. Comparado con el grupo normal, el número de células en el grupo modelo disminuyó notablemente pero aumentó después del tratamiento. El estudio mostró que las células ICC y los factores de células madre (SCF) están estrechamente relacionados con la vía de señalización de c-kit/SCF. SCF es el ligando natural de c-kit expresado en varios tejidos del cuerpo pero principalmente

producido por las células del estroma en la médula ósea. Cada monómero de c-kit se combina con un SCF a través de los dominios extracelulares 1–3. Después de la dimerización de SCF, la estructura del monómero c-kit cambia y produce homodimerización, lo que luego da como resultado la autofosforilación del residuo de aminoácido en la membrana celular y estimula varias moléculas de segunda señal para regular las funciones celulares de ICC. La segunda molécula señal es la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), una apolipoproteína que convierte la 4,5- difosfoinositida en 3,4,5-trifosfoinositida mediante la combinación con la tirosina 721 de c-kit. Investigaciones anteriores mostraron que los inhibidores de PI3K, Wortmannin y LY294002, dieron lugar a un desarrollo anormal de ICC al bloquear la señal [46]. Nuestro experimento encontró que las expresiones de ARNm y proteína c-kit y SCF en el grupo modelo disminuyeron al principio, pero luego aumentaron en grupos AEHC de diferentes dosis, aunque a niveles por debajo de lo normal. La expresión de ARNm de PI3K aumentó notablemente. Por lo tanto, SCF/c-kit puede surtir efecto a través de PI3K. Los resultados mostraron que AEHC podría regular el músculo liso del tracto gastrointestinal aumentando la cantidad de células ICC. La dosis baja de AEHC no tuvo un efecto significativo sobre el estreñimiento, mientras que la dosis media y la dosis alta acortaron el tiempo de la primera defecación de las ratas, aumentaron el contenido de humedad de las heces, mejoraron la tasa propulsora del colon, refinaron la cantidad de heces, aumentaron los GAS , MTL y CCK, y fortaleció la contractilidad del colon. La dosis efectiva de AEHC es inicialmente de 20 g/d después de la conversión, que es equivalente a la dosis media y la dosis alta en este estudio.

5. Conclusiones

AEHC promueve la motilidad intestinal al mejorar la función de ICC y regular los neurotransmisores en este estudio, que demostró que AEHC tiene el potencial para tratar y prevenir el estreñimiento. Los extractos mejoraron la producción de ondas lentas del colon y regularon el ritmo de la actividad contractiva Cantidad de ARNm de SCF Cantidad de ARNm de PI3K Cantidad de ARNm de c-Kit12 Medicina alternativa y complementaria basada en la evidencia del músculo liso al aumentar la cantidad de ICC a través de PI3K/SCF/ Vía de señal de c-kit. Sin embargo, además, los estudios experimentales detallados podrían mejorar la comprensión de las otras vías moleculares de AEHC para curar STC y ayudar a guiar los estudios clínicos prospectivos que evalúan sus efectos y seguridad.

Conflictos de interés

Los autores declaran que no existen conflictos de interés.

Contribuciones de los autores

Shuai Yan y Yin-Zi Yue contribuyeron igualmente a este trabajo. Todos los autores han aprobado el documento final.

Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) y financiado por el Gobierno chino (81573979). El estudio también fue apoyado por el proyecto de tecnología de la Administración Provincial de Medicina Tradicional China de Jiangsu, China (n.º YB2017061), el Programa de Desarrollo Científico y Tecnológico de Suzhou, China (n.º SYSD2015172), el Proyecto de Innovación Tecnológica Industrial de Suzhou, China ( n.º SYSD2016136, n.º SYS201775 y n.º SYS201776), y el Proyecto Universitario del Hospital de Medicina Tradicional China de Suzhou, China (YQN2015007). Los autores agradecen el apoyo financiero de un proyecto financiado por China Postdoctoral Science Foundation (2017M620220).

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