Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Para obtener más información, póngase en contacto:Joanna.jia@wecistanche.com

Resumen

La tecnología LC es un método reconocido que se utiliza en todo el mundo para evaluar la calidad de los medicamentos tradicionales chinos (MTC). La calidad de la medicina tradicional china tiene un impacto directo en su eficacia. Por lo tanto, para revelar a fondo cómo la MTC ejerce su eficacia, en primer lugar, es necesario comprender la base material de su eficacia y luego controlar la calidad de los compuestos activos. La aplicación del método de relación espectro-efecto es crucial para determinar la base del material farmacológico. El objetivo de este trabajo fue investigar las correlaciones subyacentes entre los perfiles químicos y la actividad estrogénica deCistanche, para revelar los compuestos activos. Los perfiles químicos deCistanchese registraron mediante HPLC/Q-TOF-MS/MS, y la actividad estrogénica se determinó mediante la prueba de crecimiento del útero y el ensayo MTT. Luego, combinando los resultados del análisis bivariado, el análisis de componentes principales y el método de análisis de correlación de grises, se identificaron quince compuestos activos. Son 8-ácido epilogánico, salidroside, syringalide A 3'- -l-ramnopiranósido, cistanoside A, echinacoside, cistanoside F, cistanside B, cistanside C, osmanthuside B, acteoside, isoacteoside, tubuloside B, 2 '-acetylacteoside, y dos compuestos desconocidos. Este estudio sienta las bases para estudios in vivo deCistanche, y para el desarrollo de su aplicación clínica.

Cistanchetubulosa

Palabras clave:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; actividad estrogénica; análisis de componentes principales (PCA); Prueba de crecimiento del útero.

abreviaturas

MTC: Medicina Tradicional China

HPLC/Q-TOF-MS: cromatografía líquida de alta resolución/espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo

BA: análisis bivariado

PCA: análisis de componentes principales

GCAM: método de análisis de correlación de grises

MTT :tripsina, 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-bromuro de difeniltetrazolio

DMSO: dimetilsulfóxido

RPMI1640 Instituto Conmemorativo del Parque Roswell 1640

1. Introducción

Recientemente, la MTC se ha vuelto cada vez más popular en los países asiáticos y occidentales debido a sus efectos terapéuticos estables y su baja toxicidad en la clínica. Como resultado, es necesario desarrollar nuevos tipos de MTC y comprender las composiciones efectivas utilizadas durante su aplicación clínica [1-6].

En primer lugar, se estudia la relación espectro-efecto para discernir la correlación entre la huella cromatográfica y la eficacia farmacodinámica. Luego, usar la relación para buscar componentes efectivos en TCM y formular estándares de control para reflejar su calidad interna. La relación espectro-efecto se ha aplicado en muchas áreas de investigación de la medicina tradicional china, como la base material de la medicina tradicional china única y compuesta, la compatibilidad de los componentes, el mecanismo de procesamiento, el pronóstico del efecto farmacológico y la optimización de la tecnología [7-12]. La relación espectro-efecto se utiliza para presentar nuevas ideas y métodos para explorar sustancias activas, optimizar fórmulas, mejorar los procesos de preparación, rastrear y separar los ingredientes objetivo y para el desarrollo de nuevos medicamentos de la MTC [13-17].

Cistancheha sido ampliamente utilizado para el tratamiento de la disfunción sexual, el estreñimiento, la prostatitis y la deficiencia renal. Tiene un amplio espectro de bioactividades que incluyen efecto estrogénico, antienvejecimiento, antioxidante y acción inmunológica [18-19]. En general, los glucósidos feniletanoides (como el cistanosido A, el tubulosido A), los lignanos y los glucósidos iridoides se consideraron constituyentes farmacológicos y marcadores químicos para el control de calidad de Cistanche y sus productos [20-21]. Los espectros químicos de Cistanche de diferentes áreas se registraron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) [22-23]. En este estudio, seleccionamos la prueba de crecimiento del útero y el ensayo de proliferación celular MCF7 para evaluar sus actividades estrogénicas. Se utilizaron métodos de análisis de componentes principales, análisis bivariado y análisis de correlación de grises para correlacionar la actividad estrogénica con los componentes individuales. Este estudio tuvo como objetivo identificar los compuestos bioactivos de Cistanche responsables de los efectos estrogénicos in vivo. El estudio sienta las bases para estudios en profundidad de Cistanche.

Todos los procedimientos experimentales fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Comercio de Harbin.

Cistanchedeserticola (cd-20120227-005) fue adquirida en el mercado de drogas e identificada por el profesor Zhang Delian (Universidad de Comercio de Harbin). El dietilestilbestrol se adquirió de HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 y RPMI1640 sin rojo fenol se adquirieron de HyClone Company (EE. UU.). MTT y DMSO se compraron todos de Sigma-Aldrich Co. LLC (St Louis, EE. UU.). La línea celular MCF7 de cáncer de mama humano fue proporcionada por el Centro de Investigación de Ciencias de la Vida y Ciencias Ambientales (Universidad de Comercio de Harbin). Los estándares utilizados fueron los siguientes: acteósido (111530- 200505), equinacósido (111670-200503) y salidrosido (110736-200628) se obtuvieron del Instituto Nacional para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos (Beijing , Porcelana). El acetonitrilo, el metanol y el ácido fórmico eran de grado MS, mientras que el agua era ultrapura. Otros reactivos eran de grado analítico y estaban disponibles comercialmente.

2 Procedimiento Experimental

2.1 Materiales

El sistema HPLC Agilent 1290, el sistema LC/MS de tiempo de vuelo (Q-TOF) cuadrupolo serie Agilent 6530 y las estaciones de trabajo HPLC químicas-3D se utilizaron para experimentos de química analítica y procesamiento de datos. Se utilizó agua ultrapura Milli-Q para la preparación de muestras y estándares. Los instrumentos adicionales incluyeron la balanza analítica electrónica AR1140 (Ohaus International Ltd), el lector de microplacas 680 (Bio-Rad Corporation) y la centrífuga de alta velocidad 64R (Beckman Coulter Allegra).

Se compraron ratones Kunming hembra inmaduros (alrededor de 21 días de nacimiento, destetados) que pesaban (12 ± 2) g en el Centro de animales de laboratorio base de la industria biológica nacional de Changchun (Changchun, China). Los ratones se alojaron en una habitación con temperatura regulada (22 ± 2 grados) con acceso ilimitado a comida y agua. La experimentación con animales se inició después de cinco días de aclimatación. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche con libre acceso al agua antes de administrar las soluciones de prueba. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

2.2 Preparación de la solución de muestra

CistancheSe recolectaron muestras de diez hábitats diversos, a saber, Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan y la provincia de Hubei.

La solución (1.0 g/mL) de laCistancheLa muestra se preparó en agua destilada para administración oral. La concentración de dietilestilboestrol fue de 20ug/mL y se utilizó como solución de control positivo. La solución (1,0 g/mL) de la muestra de Cistanche se preparó en acetonitrilo al 50 por ciento. Acteósido, equinacósido y salidrosido (2,0 mg cada uno) se disolvieron en 10 ml de solución de acetonitrilo al 50 por ciento. Tanto la muestra como las soluciones estándar se filtraron con un filtro de 0,45-μm antes del análisis.

2.3 Condiciones de LC-MS

Se usó un Waters Symmetry Shield RP18 (3,9 mm × 150 mm, 5 μm; Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.) para analizar las muestras. La fase móvil constaba de acetonitrilo (A) y 0,2 por ciento (v/v) de solución acuosa de ácido fórmico (B) y se bombeó a un caudal de 0,5 ml/min. El volumen de inyección de cada muestra fue de 10 μL. El programa de elución en gradiente fue el siguiente: la fase móvil A se inició al 5 por ciento y se incrementó linealmente al 23 por ciento a los 35 min. La solución A se aumentó posteriormente al 25 por ciento (35 a 65 min). Luego se redujo la fase móvil A al 5 por ciento durante los últimos 5 min de la serie (65 a 70 min). La temperatura de la columna se mantuvo a 30 grados. Los cromatogramas se controlaron a 254 nm. La presión del gas de atomización fue de 30 psi y el voltaje del capilar fue de 3,5 kV. El caudal del gas seco se fijó en 8 L/min con una temperatura de 30 grados. Los espectros de masas se registraron dentro del rango de exploración de 100- 3,000 Da y estaban en modo de exploración de iones negativos.

2.4 Evaluación de huellas dactilares

Las huellas digitales de LC de las muestras recolectadas de 10 lotes diferentes se establecieron y compararon automáticamente utilizando el Sistema de evaluación de similitud para huellas dactilares cromatográficas de TCM (versión 2012; Comité de Farmacopea de China, Beijing, China). Además, el mapa del cromatograma de referencia se generó utilizando el método de la mediana. Además, se aplicó el análisis de conglomerados para evaluar la calidad de las muestras de diez hábitats diversos.

2.5 Análisis de componentes principales (PCA)

PCA es un método estadístico multivariado. Puede retener suficiente información de la adquisición de datos. En el presente estudio, los picos característicos de los cromatogramas de LC se examinaron más a fondo mediante PCA y tenían como objetivo identificar los compuestos activos en función de la relación espectro-efecto.

2.6 Prueba de crecimiento del útero

Los ratones se dividieron en 12 grupos (10 por grupo). Las soluciones de muestra que se prepararon a partir de Cistanche se recolectaron de diez hábitats diversos y se administraron dos veces al día (mañana y tarde) por sonda a una dosis de 30 g/kg de peso corporal durante cuatro días. Los grupos de control positivo y en blanco comprendían volúmenes iguales de agua destilada y solución de dietilestilboestrol y se administraron dos veces al día durante cuatro días. El quinto día, se extrajeron las muestras de sangre que contenían el fármaco de los ratones anestesiados. Las muestras se centrifugaron (5, 000 rpm, 10 min) y los sobrenadantes (muestras de suero que contenían el fármaco) se separaron. Las muestras de suero que contenían el fármaco se inactivaron calentándolas a 56 grados en un baño de agua durante 30 minutos y se filtraron a través de un filtro de 0,22-μm antes del ensayo MTT. Al mismo tiempo, los úteros de los ratones se extirparon inmediatamente y se pesaron para calcular los índices de peso uterino. La experimentación con animales se inició después de cinco días de aclimatación. Los ratones ayunaron durante la noche con libre acceso al agua antes de la administración de las soluciones de prueba. El presente estudio se realizó siguiendo estrictamente las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los procedimientos experimentales fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Comercio de Harbin. Todos los procedimientos potencialmente estresantes se realizaron bajo anestesia con pentobarbital sódico.

2.7 Ensayo MTT

Las células MCF7 se cocultivaron con RPMI 1640 sin rojo fenol (que contenía CDT-FBS al 5 por ciento) durante cuatro días. Las células se sembraron en 96-placas de pocillos a una densidad de 2,000 células/pocillo. Se logró un cultivo adherente y después de 72 h de cultivo, las células se cocultivaron en medio RPMI 1640 que contenía muestras de suero de ratones tratados con Cistanche. Los experimentos se realizaron en seis réplicas. Posteriormente, se añadieron a cada pocillo 20 μL de solución de MTT (5 mg/mL en PBS) y las células se incubaron durante 4 h. Después de la eliminación del medio, se añadieron 150 µl de DMSO para producir el producto de formazán y las placas se agitaron en la oscuridad para disolverlas por completo. La absorbancia se midió a 570 nm utilizando un lector de microplacas. La tasa de proliferación se calculó como el valor de absorbancia promedio del grupo de suero que contenía el fármaco dividido por el valor de absorbancia promedio del grupo de control en blanco (células cocultivadas en RPMI 1640 sin suero).

2.8 Análisis estadístico

Se usó la prueba t de muestras pareadas (dos colas) para identificar diferencias estadísticamente significativas entre los valores en el control en blanco y en los grupos experimentales. Las diferencias se consideraron significativas a un nivel de confianza del 95 por ciento (p <>

PCA se utilizó para evaluar áreas de picos característicos en los cromatogramas de las muestras de diez hábitats diversos. Se utilizaron el análisis bivariado y el análisis de correlación de Gray para evaluar la correlación de las áreas pico y su actividad estrogénica. La correlación se calculó mediante el software de estadísticas SPSS (SPSS para Windows 21.0, SPSS Inc., EE. UU.). Las diferencias se consideraron significativas a un nivel de confianza del 95 por ciento (dos colas).

Aprobación ética: La investigación realizada no está relacionada con el uso humano o animal.

3. Resultados y discusión

3.1 Análisis de conglomerados y evaluación de similitud

La desviación estándar relativa del tiempo de retención y el área del pico de los picos característicos fueron {{0}}.58 y 0.34 por ciento para la precisión, 0.52 y {{8} },31 por ciento de reproducibilidad, y {{10}},19 y 0,13 por ciento de estabilidad, respectivamente. Estos hallazgos indicaron que nuestro método LC de establecimiento de huellas dactilares era razonable y confiable. Las similitudes de los cromatogramas de diez muestras fueron superiores a 0,9. Los picos comunes para todas las muestras no pudieron representar completamente los componentes característicos de Cistanche, ya que el pico podría haberse perdido. Por lo tanto, el número de coincidencia de la muestra se ajustó de 26 a 20 para obtener un mapa de cromatograma más preciso. Se obtuvieron un total de 26 picos, y la suma de sus áreas fue superior a 0,8 en comparación con las del área total del pico en la muestra. Por lo tanto, concluimos que estos picos cromatográficos podrían reflejar efectivamente los principales constituyentes químicos de Cistanche. Los resultados del análisis de conglomerados se muestran en la Figura 1. Un total de diez hábitats diversos se dividieron en tres categorías de la siguiente manera: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang y 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia y 5, Alashan. (C) 9, Hubei. La tendencia del análisis de conglomerados mostró que los hábitats de las hierbas medicinales son similares cuando se encuentran en la parte inferior del umbral. Pero con el aumento del umbral, el clima y las condiciones de crecimiento de los hábitats se acercan. Muestra que el análisis de conglomerados no solo puede distinguir bien los diversos hábitats sino también reflejar las afinidades entre ellos.

3.2 Identificación de los constituyentes químicos

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Cuanto mayor sea el valor absoluto de la carga propia, mayor será la influencia de los compuestos sobre los índices estrogénicos.

Los cromatogramas de Cistanche y las muestras estándar se compararon para identificar los componentes individuales en las mismas condiciones de LC-MS. Como se muestra en la Tabla 1, se identificaron un total de 26 constituyentes según el tiempo de retención y los datos de MS [24-26]. Los ingredientes activos se administran por vía oral en forma de mezclas en lugar de monómeros, como lo hace la medicina tradicional china en forma de mezcla para desempeñar un papel terapéutico. No se encontró que un solo compuesto después de ser separado individualmente jugara un papel. Nuestro objetivo es revelar compuestos que tengan actividad estrogénica en los componentes conocidos de Cistanche [23-30] y, por lo tanto, no seleccionamos RMN ni otros medios técnicos para validar su identidad. El pico 1 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 373 (C16H22O10), que era idéntica a la composición elemental del ácido geniposídico. Esto fue respaldado por la pérdida de un resto de glucosa que produjo un fragmento de ion con una relación m/z de 211. El pico 2 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 461 (C20H30O12), que era idéntico a la composición elemental de decaffeoylacteoside, y fue apoyado por la pérdida de un resto ramnosilo, formando una fragmentación con una relación m/z de 315. El pico 4 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 375 (C16H24O10), que era idéntico al composición elemental de 8-ácido epilogánico. La pérdida de un resto de glucosa, que formó una fragmentación con una relación m/z de 213, apoyó aún más la inferencia. El pico 6 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 607 (C29H36O14), que era idéntica a la composición elemental de la siringalida A3'- - l-ramnopiranósido.

La pérdida de un resto caff, formó un ion de fragmento con una relación m/z de 445, apoyó aún más la inferencia. El pico 8 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 799 (C36H48O20), que era idéntico a la composición elemental del cistanosido A. La pérdida de un resto caff formó un fragmento de ion con una relación m/z de 637, apoyó aún más la inferencia. El pico 11 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 487 (C21H28O13), que era idéntico a la composición elemental del cistanosido F. Esto fue respaldado por la pérdida de un resto ramnosilo que produjo un fragmento de ion con una relación m/z proporción de 341, y la pérdida de otro resto caff formó un fragmento de ion con una proporción m/z de 179, respaldaron aún más la inferencia. El pico 12 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 813 (C37H50O20), que era idéntico a la composición elemental del cistanosido B. La pérdida de un resto de glucosa formó un fragmento de ion con una relación m/z de 651, apoyó aún más la inferencia. El pico 13 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 827 (C37H48O21), que era idéntico a la composición elemental del tubulosido A. La pérdida de un resto ramnosilo formó una fragmentación con una relación m/z de 681, más apoyó la inferencia. El pico 14 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 637 (C30H38O15), que era idéntico a la composición elemental del cistanosido C. La pérdida de un resto ramnosilo formó un fragmento de ion con una relación m/z de 491, apoyó aún más la inferencia.

El pico 15 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 591 (C29H36O13), que era idéntico a la composición elemental del osmanthuside B. La pérdida de un resto ramnosilo formó un fragmento de ion con una relación m/z de 445, apoyó aún más la inferencia. El pico 16 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 623 (C29H36O15), que era idéntica a la composición elemental del acteósido. La pérdida de un resto café, formó un ion fragmento con una relación m/z de 461, apoyó aún más la inferencia. El pico 18 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 623 (C29H36O15), que era idéntica a la composición elemental del isoactósido. La pérdida de un resto café, pico anterior 15, indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 591 (C29H36O13), que era idéntica a la composición elemental del osmanthuside B. La pérdida de un resto ramnosilo formó un ion fragmentado con un relación m/z de 445, apoyó aún más la inferencia. El pico 16 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 623 (C29H36O15), que era idéntica a la composición elemental del acteósido. La pérdida de un resto café, formó un ion fragmento con una relación m/z de 461, apoyó aún más la inferencia. El pico 17 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 623 (C29H36O15), que era idéntica a la composición elemental del cis-actósido. La pérdida de un resto cafe, formó un fragmento iod un ion fragmento con una relación m/z de 461, apoyó aún más la inferencia. El pico 21 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 653 (C30H38O16), que era idéntica a la composición elemental del campneósido Ⅰ.

La pérdida de un resto caff formó un ión fragmento con una relación m/z de 491, y la pérdida de otro resto ramnosilo formó un ión fragmento con una relación m/z de 345, lo que respalda aún más la inferencia. El pico 22 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 665 (C31H38O16), que era idéntico a la composición elemental del tubulosido B. La pérdida de un resto CH3 CO formó un fragmento de ion con una relación m/z de 623, y la pérdida de otro resto caff formó un ion de fragmento con una relación m/z de 461, lo que respalda aún más la inferencia. El pico 23 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 639 (C29H36O16), que era idéntica a la composición elemental del campneósido. La pérdida de un resto de ramnosilo, formó un ion de fragmento con una relación m/z de 493, apoyó aún más la inferencia. El pico 24 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 665 (C31H38O16), que era idéntica a la composición elemental del 2'-acetilacteoside. La pérdida de un resto Ac formó un ion fragmento con una relación m/z de 623, y la pérdida de otro resto caff formó un ion fragmento con una relación m/z de 461, lo que respalda aún más la inferencia. El pico 25 indicó un ion desprotonado predominante con una relación m/z de 445 (C20H30O11), que era idéntico a la composición elemental del cistanosido G. La pérdida de un resto ramnosilo formó un fragmento de ion con una relación m/z de 299, apoyó aún más la inferencia. Las estructuras de los compuestos se enumeran en la Figura 2.

3.3 ACP

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Estos picos fueron los siguientes: 9, 12, 14 y 15. En consecuencia, el equinacósido, el cistanosido B, el osmanthusido B y el acteósido, correspondientes a un total de 4 picos, fueron seleccionados como variables representativas de la actividad estrogénica (Figura 3).

.

3.4 Determinación de la actividad estrogénica

Se calculó la relación entre el peso húmedo uterino y el peso corporal de cada ratón (Figura 4). Los animales expuestos a Cistanche de nueve hábitats exhibieron actividades estrogénicas significativas al aumentar su peso uterino en comparación con los ratones del grupo de control en blanco. La Figura 4 muestra además la tasa de proliferación de células MCF7 tratadas con el suero de ratones tratados con Cistanche. Las células tratadas con los sueros de ratones a los que se les administró Cistanche de diez hábitats exhibieron un crecimiento significativamente mayor en comparación con las células sin tratamiento.

3.5 Análisis bivariado

En el presente estudio, observamos que los pesos uterinos de ratones Kunming hembra inmaduros aumentaron y se promovió la proliferación de células de cáncer de mama humano MCF7. Estos hallazgos verificaron la actividad estrogénica de Cistanche. La Figura 5 indica los índices uterinos y las tasas de proliferación de células MCF7 de estos constituyentes. Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson para calcular las áreas máximas relativas, que correspondían a la actividad estrogénica de las muestras. Los coeficientes de correlación superiores a 0.3 se consideraron significativos (p < 0.05),="" mientras="" que="" los="" coeficientes="" de="" correlación="" superiores="" a="" 0.5="" se="" consideraron="" altamente="" significativos="" (p=""><0,01). según="" los="" resultados,="" se="" demostró="" que="" cistanche="" posee="" actividad="">

Un total de nueve compuestos se correlacionaron significativamente con el aumento del peso uterino (p < {{0}}.05),="" mientras="" que="" diez="" compuestos="" se="" correlacionaron="" significativamente="" con="" la="" proliferación="" celular="" mcf7="" (p="">< 0.05).="" los="" compuestos="" que="" se="" correlacionaron="" significativamente="" con="" el="" peso="" uterino="" y="" la="" proliferación="" celular="" fueron="" 8-ácido="" epilogánico,="" salidroside,="" syringalide="" a3'-="" -="" l-ramnopiranósido,="" cistanósido="" a,="" cistanósido="" b,="" cistanósido="" c,="" osmanthuside="" b,="" acteoside,="" isoactoside,="" tubuloside="" b,="" 2'-acetilacteoside="" y="" dos="" compuestos="" desconocidos="" (figura="" 5).="" estos="" trece="" compuestos="" ejercieron="" actividades="">

3.6 Método de análisis de correlación de grises

La Figura 6 muestra la correlación relativa de los picos característicos de 26 compuestos con los índices uterinos, y la Figura 7 muestra la correlación relativa de los picos característicos de los 26 compuestos con sus índices de proliferación celular. Un total de tres compuestos exhibieron la mayor correlación con los índices uterinos, a saber, 8-ácido epilogánico, cistanosido F y acteósido (Figura 6, en orden descendente); mientras que los seis compuestos que exhibieron la correlación más alta con la proliferación de células MCF7 fueron el equinacósido, el cistanosido F, el cistanosido B, el osmanthusido B, el isoactósido y el tubulosido B (Figura 7, en orden descendente). Las correlaciones relativas de echinacósido, osmanthusido B, acteósido e isoactósido fueron superiores a 0.5.

3.7 Optimización de las condiciones de LC-MS

Para obtener un mejor mapa cromatográfico, se compararon metanol y acetonitrilo. Finalmente, la combinación de ácido fórmico acuoso (0.2 por ciento, v/v) - acetonitrilo fue la mejor fase móvil para la separación. En el rango de escaneo de longitud de onda completa de 200-400nm, se seleccionó 254nm como el óptimo. Además, también se mejoraron los parámetros de MS. Se seleccionó el modo de escaneo de iones negativos porque mejoró los valores de respuesta de la mayoría de los ingredientes en Cistanche.

4. Conclusión

Se utilizó la tecnología LC-Q-TOF-MS para identificar los componentes activos estrogénicos de Cistanche. El presente estudio ilustró que 8-ácido epilogánico, salidroside, syringalideA3'- -l-ramnopiranósido, cistanoside A, echinacoside, cistanoside F, cistanside B, cistanside C, osmanthuside B, acteoside, isoacteoside, tubuloside B, 2'-acetylacteoside y dos compuestos desconocidos fueron los principales componentes activos de Cistanche. Sin embargo, estos hallazgos requieren más estudios para explorar los efectos in vivo y el mecanismo de acción de los constituyentes.

Expresiones de gratitud:

Este proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81073015), la Fundación Científica de la Naturaleza de la provincia de Heilongjiang (ZD2017014) y el plan de formación de jóvenes talentos innovadores del Colegio en la Provincia de Heilongjiang (UNPYSCT-2017209) . Los autores declaran que no existe ningún conflicto de interés con respecto a la publicación de este artículo.

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