Virus del papiloma humano quimérico-16 partículas similares a virus que presentan péptidos P18I10 y T20 de la envoltura del VIH-1 inducen al VPH16 y al VIH-1-inmunidad humoral específica y mediada por células T en ratones BALB/c

Abstracto:

En este estudio, el péptido CTL P18I10 del VIH-1 derivado del bucle V3 de la gp120 del VIH-1 y el péptido antifusión T20 de la gp41 del VIH-1 se insertaron en la proteína de la cápside L1 del VPH16. para construir VLP quiméricas de VPH: VIH (L1:P18I10 y L1:T20) utilizando el sistema de expresión de células de mamíferos. Las VLP de VPH:VIH se purificaron mediante cromatografía. Demostramos que la inserción de péptidos P18I10 o T20 en el bucle DE de las proteínas de la cápside L1 del VPH16 no afectó la estabilidad in vitro, el autoensamblaje y la morfología de las VLP quiméricas de VPH:VIH. Es importante destacar que no interfirió ni con la reactividad de los anticuerpos contra el VIH-1 dirigidos a los péptidos P18I10 y T20 secuenciales y conformacionales presentados en VLP quiméricas de VPH: VIH ni con la inducción de anticuerpos específicos de L1- contra el VPH16 in vivo. Observamos que las vacunas quiméricas VLP L1:P18I10/L1:T20 podían inducir el VPH16- pero respuestas débiles de anticuerpos específicos del VIH-1-y provocaban respuestas T-específicas del VPH16- y del VIH-1-específicas. Respuestas celulares en ratones BALB/c. Además, podría ser un refuerzo potencial para aumentar las respuestas celulares específicas del VIH en la inmunización heteróloga después de la preparación con la vacuna BCG.HIVA. Este trabajo de investigación contribuiría un paso hacia el desarrollo de la nueva plataforma de vacuna quimérica basada en VPH: VLP del VIH para controlar la infección por VPH16 y VIH-1, que se necesita con urgencia en los países en desarrollo e industrializados.

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Palabras clave:

VIH-1; VPH16; vacuna; partículas parecidas a virus; P18I10; T20 enfuvirtida; BCG.HIVA; inmunidad humoral; Inmunidad mediada por células T

1. Introducción

El virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), que causa el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), fue descubierto a principios de la década de 1980 y desde entonces se ha convertido en una epidemia mundial [1]. Aunque el tratamiento antirretroviral de gran actividad (TARGA), junto con la profilaxis previa a la exposición (PrEP), puede tener un impacto real en el control de la infección por VIH-1, la vacunación sigue siendo un enfoque fundamental para el beneficio público y para poner fin a la enfermedad. fin de la epidemia mundial de VIH-1 [2]. A pesar de más de tres décadas de investigación exhaustiva sobre el VIH-1 y numerosos ensayos clínicos de vacunas, hasta ahora todavía es imposible lograr una vacuna autorizada contra el VIH-1. El ensayo RV144 realizado en Tailandia fue el primer caso que reveló una modesta eficacia del 31,2% contra la adquisición de la infección por VIH-1 [3]. La mayoría de las otras vacunas candidatas contra el VIH-1 que se sometieron a ensayos clínicos se basaron principalmente en ADN, vectores virales recombinantes o modelos de proteínas de subunidades [4,5]. Idealmente, una vacuna eficaz contra el VIH-1 es capaz de inducir respuestas inmunitarias innatas, anticuerpos neutralizantes para prevenir la infección viral [6], así como respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) para eliminar las células infectadas [7]. Sin embargo, obtener cada respuesta puede requerir diferentes estrategias de vacunación, lo que justifica esfuerzos de desarrollo separados pero paralelos. La selección de inmunógenos y vectores de administración tendrá impactos significativos en la función y especificidad de las vacunas contra el VIH-1 [8,9]. Los repetidos fracasos al utilizar los enfoques estándar para el desarrollo de la vacuna contra el VIH-1 llevaron a un reconocimiento de la importancia de la selección del vector de administración, los regímenes de refuerzo y la especificidad del inmunógeno en las respuestas tanto humorales como celulares. Ya se conocen más de 100 tipos de virus del papiloma humano (VPH) y se considera que los genotipos 16 y 18 del VPH son responsables de aproximadamente el 70% de los cánceres de cuello uterino en todo el mundo [10]. Las partículas similares al virus (VLP) del VPH L1, clasificadas como un tipo de vacunas de subunidades, podrían inducir predominantemente respuestas humorales específicas de L1- comparables al virión de tipo salvaje y también respuestas mediadas por células T [11-13]. Actualmente, se han autorizado en el mercado tres vacunas preventivas contra el VPH y todas ellas se basan en VLP de la proteína de la cápside L1 del VPH. Dos de ellos, Gardasil (Merck, Rahway, Nueva Jersey, EE. UU.) y Gardasil-9 (Merck) se producen mediante el sistema de expresión de levadura (Saccharomyces cerevisiae), mientras que el otro, Cervarix (GSK, Brentford, Reino Unido), se produce por el sistema de vector de expresión de baculovirus/célula de insecto (BEVS/IC) [14]. Hasta ahora, las condiciones óptimas de producción de proteínas L1 del VPH16 en el sistema de expresión de los mamíferos no se han establecido bien. Por tanto, el desarrollo de una vacuna combinada que proteja contra las infecciones por VPH y VIH es un esfuerzo lógico en la lucha contra estos dos principales patógenos mundiales.

En nuestra publicación anterior de un artículo de revisión sobre los conceptos de diseño de vacunas contra el VIH-1 basadas en partículas similares a virus (VLP), mencionamos que las VLP sin envoltura, como las VLP del virus del papiloma, podrían desempeñar un papel funcional como vectores de administración para presentar VIH-1 CTL o epítopos de anticuerpos neutralizantes [15,16]. Esta hipótesis se ha confirmado en varios virus del papiloma bovino quimérico (BPV) L1 VLP que presentan el epítopo CTL P18I10 del bucle V3 de la proteína de la envoltura gp120 VIH-1 (Env) y el epítopo 2F5 o región MPER de gp41 VIH-1 Env [17-22]. La característica estructural de las proteínas de la cápside L1 del virus del papiloma humano tipo -16 (HPV16) es similar a la del BPV y podría autoensamblarse en VLP L1 de una sola capa [23]. Cinco de las proteínas L1 del VPH16 forman un pentámero y 72 de los pentámeros se autoensamblan en una VLP del VPH16 [24]. Sin embargo, todavía no hay evidencia clara de que las proteínas quiméricas de la cápside del VPH16:VIH puedan ser estables in vitro y autoensamblarse en VLP morfológicamente integrales. Por otro lado, se ha demostrado que las VLP L1 del VPH16 son altamente inmunogénicas y son capaces de inducir respuestas inmunes de células T y B específicas de antígeno [11-13]. Aún queda por ver si la presentación de los epítopos del VIH-1 a través del VPH: las VLP del VIH podrían ser inmunogénicas. En este estudio, nuestro objetivo fue desarrollar una vacuna contra el VPH: VIH basada en VLP quimérica utilizando células 293F humanas, un sistema de expresión de células de mamíferos bien establecido. La proteína L1 del VPH 16 actuó como armazón estructural de la vacuna, y los péptidos P18I10 y T20 se seleccionaron como inmunógenos del VIH-1 y se insertaron en el bucle DE de la proteína L1 del VPH 16. El epítopo CTL P18I10 inmunodominante que comprende 10 aminoácidos (residuos 311–320: RGP GRAFVTI) se deriva del tercer dominio variable (V3) de la glicoproteína gp120 de la envoltura del VIH-1. El péptido P18I10 se ha identificado como una molécula MHC de clase I restringida a H-2Dd para inducir respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) [25,26]. El péptido T20, conocido como enfuvirtida y diseñado como un péptido de fusión multimérico antirretroviral, consta de una secuencia de 36 aminoácidos (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) que imita la secuencia de hélice de la heptada C-terminal cerca de la membrana.0 s región externa proximal (MPER) de la glicoproteína 41 de la envoltura del VIH-1 (gp41) [27]. Estos dos epítopos basados ​​en células VIH-1 T (P18I10) y B (T20) se seleccionaron como punto de partida y experimento de prueba de concepto para la plataforma de desarrollo de vacunas contra el VIH y VPH quiméricas basadas en VLP.

Durante la última década, se han probado muchos formatos diferentes de refuerzo de vacuna contra el VIH-1 basada en VLP [15]. Aunque la mayoría de las estrategias de vacunas anteriores contra el VIH-1 VLP [28] o BPV quimérica: VIH VLP [17–22] se centraron en inducir respuestas inmunitarias mediante el uso del régimen homólogo de cebado-refuerzo, dos estudios anteriores sugirieron que la inmunización heteróloga compuesto de recombinantemicobacteria bovisEl bacilo de Calmette-Guérin (rBCG) que expresa VIH-1 Gag Prime y VIH-1 Gag VLP boost puede contribuir a mejorar la inmunidad de las células T [29,30]. En nuestro grupo de investigación, hemos demostrado la preparación con rBCG que expresa el inmunógeno VIHA y el refuerzo con el vector viral recombinante MVA. HIVA fue seguro y provocó respuestas inmunes de células T específicas del VIH-1-en ratones BALB/c [31–33]. El inmunógeno VIHA, diseñado por el Dr. Tomas Hanke, está compuesto por la proteína Gag del VIH-1 de longitud completa combinada con múltiples epítopos CTL, incluidos los epítopos P18I10 en el extremo C terminal [34]. Por lo tanto, nuestro objetivo fue evaluar si BCG.HIVA podría estimular las respuestas inmunes de las células T inducidas por las VLP del VIH: VPH (L1:P18I10) en ratones BALB/c.

En este estudio, los inmunógenos quiméricos VPH: VIH (L1:P18I10 y L1:T20) se diseñaron y produjeron utilizando el sistema de expresión 293F. La expresión de las proteínas quiméricas L1:P18I10 y L1:T20 se confirmó mediante inmunotinción. Las VLP de VPH:VIH se purificaron posteriormente mediante un método cromatográfico 3-paso, que incluye cromatografía de cationes (CEC), exclusión por tamaño (SEC) y afinidad por heparina (H-AC). Luego, la estabilidad in vitro, el autoensamblaje in vitro y la morfología del VPH purificado: las VLP del VIH se confirmaron mediante SDS-PAGE no reductora, ensayo de masa molecular y microscopía electrónica de transmisión (TEM), respectivamente. Los péptidos secuenciales y conformacionales P18I10 y T20 presentados en VLP quiméricas de VPH:VIH se caracterizaron además mediante anticuerpos monoclonales anti-VIH-1gp120 V3 y 2F5 in vitro mediante el uso de Western blot y ensayo ELISA indirecto. Finalmente, se evaluó la inmunogenicidad de las VLP de VPH:VIH en el modelo de ratones BALB/c. Demostramos que las vacunas quiméricas basadas en VLP L1:P18I10 y L1:T20 podrían inducir respuestas de anticuerpos específicas de VPH16- y VIH-1- y que las VLP quiméricas L1:P18I10 podrían inducir VPH16- y VIH{ {37}}respuestas específicas de células T en ratones BALB/c. Debido a que el desarrollo y la fabricación de una vacuna inmunogénica contra el VPH y el VIH aún es inalcanzable, este estudio proporcionó una estrategia de referencia que puede valer la pena apoyar los esfuerzos globales para desarrollar nuevas vacunas quiméricas basadas en VLP para controlar las infecciones por VPH y VIH-1.

2. Materiales y métodos

2.1. Construcción de la cepa de vacuna BCG.HIVA2auxo.int

El BCG recombinante que expresa el inmunógeno VIHA se construyó previamente utilizando el vector lanzadera integrador de E. coli-micobacterias p2auxo.int. La construcción de un vector micobacteriano/E. coli que expresa el antígeno VIHA se describió previamente [31-33]. BCG.HIVA2auxo.int se diluyó en PBS-Tween20 a 2 × 107 ufc/ml, se sonicó para romper los grupos bacterianos y se inoculó en la almohadilla de alimento trasera o en ratones BALB/c (50 µl, 106 ufc/ratón).

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2.2. Cultivos bacterianos y transformación.

Se cultivaron células de la cepa auxotrófica de glicina de E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.), proporcionadas por el Dr. Pau Ferrer, en medio derivado mínimo M9- (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/l; KH2PO4, 3 g/l; NaCl, {{10}}.5 g/l; NH4Cl, 1 g/l, glucosa, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0.1 mmol/L; tiamina, 0.1 g/L; FeCl3, 0.{{56 }}25 g/L; AlCl3·6H2O, 0.13 mg/L; ZnSO4·7H2O, 2,6 mg/L; CoCl2·6H2O, 0.47 mg/L; CuSO4·H2O, 4,6 mg/l; H3BO3, 0.03 mg/l; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/l; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/l; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/l) , suplementado con glicina (70 µg/ml). Las células de E. coli M151Gly se transformaron con los plásmidos p2auxo.HIVA mediante electroporación. Para ello, los cultivos de E. coli se cultivaron hasta una densidad óptica de 0,9 a 600 nm y se transformaron utilizando un electroporador de impulsos genéticos Bio-Rad a 2,5 kV, 25 µF y 200 Ω. Las células transformadas se cultivaron posteriormente en placas de agar M9-D (componentes como se describió anteriormente, con bactoagar al 1,5 % agregado) sin suplementos de glicina para la selección o con suplementos de glicina como control. La cepa BCG auxotrófica de lisina, BCG∆lys, proporcionada amablemente por WR Jacobs Jr., BR Bloom y T. Hsu, se transformó con ADN plasmídico p2auxo.HIVAint mediante electroporación. Las micobacterias se cultivaron en medio de caldo Middlebrook 7H9 o en medio de agar Middlebrook 7H10 suplementado con albúmina-dextrosa-catalasa (ADC; Difco) que contenía Tween 80 al 0,05%. Se disolvió monoclorhidrato de L-lisina (Sigma, Kawasaki, Japón) en agua destilada y utilizado como suplemento a una concentración final de 40 µg/mL. Para la transformación, se cultivó BCG hasta una densidad óptica de 1,5 a 600 nm y se transformó utilizando un electroporador de impulsos genéticos Bio-Rad a 2,5 kV, 25 µF y 1000 Ω. Después, los transformantes se cultivaron en medio agar Middlebrook 7H10 suplementado con ADC que contenía Tween 80 al 0,05 % sin suplemento de lisina.

2.3. Líneas celulares y cultivo celular

Las células 293F (Tibco), derivadas de células 293 de riñón embrionario humano (HEK), se cultivaron en medio de expresión FreeStyle 293 (Tibco) suplementado con 5 ml/l de penicilina-estreptomicina (Tibco) y se incubaron en una incubadora a 37 ◦C que contenía una atmósfera humidificada de 5% de CO2 sobre una plataforma agitadora orbital que gira a 125 rpm.

2.4. Producción de proteínas L1:P18I10 y L1:T20 utilizando el sistema de expresión 293F

La construcción pCDNA3.1 contenía secuencias codificantes de ADN L1:P18I10 o L1:T20 correspondientes a las proteínas quiméricas L1:P18I10 y L1:T20, respectivamente. El péptido CTL VIH-1 P18I10 (RGPGRAFVTI) o el péptido T20 (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) se insertaron en el bucle DE de la proteína de la cápside L1 de HPV16. La secuencia del bucle DE HPV16 L1 que codifica entre 130 y 136 aminoácidos se reemplazó con el péptido P18I10I10 o T20. Las secuencias codificantes de ADN L1:P18I10 o L1:T20 se modificaron con la secuencia Kozak, se optimizaron con codón humano, se flanquearon por los sitios de enzimas de restricción HindIII y XbaI y se clonaron en el vector pcDNA3.1(+) utilizando los servicios de síntesis de genes GeneArt ( Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.). El ADN plasmídico recombinante (ADNp) se transformó en células competentes DH5 de E. coli (Invitrogen) para su amplificación y se extrajo utilizando kits de plásmido Maxi (QIAGEN, Hilden, Alemania). Las células 293F se cultivaron con 30 ml de medio de expresión FreeStyle 293 en un matraz Erlenmeyer de 125 ml (Corning, Nueva York, NY, EE. UU.) hasta una densidad de 1,0 x 106/ml y se transfectaron transitoriamente con pDNA L1:P18I10 o L1:T20 utilizando el sistema ramificado. polietilenimina con un PM de 25 kDa (PEI-25K) (Polysciences) en una relación optimizada de ADN a PEI 1:3 (p/p) y ADN a medio de cultivo 1:1 (p/v), según según las instrucciones del fabricante [35]. Las células 293F se recogieron 96 h después de la transfección. Las células 293F pueden alcanzar una densidad confluente de 3,6 × 106 células/ml con aproximadamente un 50 % de viabilidad.

2.5. Tinción de inmunofluorescencia

Las células se permeabilizaron sobre el portaobjetos de vidrio con acetona fría al 100%. Posteriormente, las células fijadas se sondaron con el anticuerpo anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y se capturaron con IgG-FITC anti-ratón (Sigma). Las monocapas de células teñidas inmunes se lavaron minuciosamente con PBS y se cubrieron con un medio de montaje con DAPI (Abcam). Las imágenes de inmunofluorescencia se inspeccionaron bajo un microscopio invertido con un aumento de 40X. La eficiencia de la transfección se determinó mediante la proporción de células positivas para FITC (verde) y células teñidas con DAPI (azul).

2.6. Purificación de VPH: VLP de VIH (L1:P18I10 y L1:T20)

Se recogieron un total de 108 células 293F transfectadas en un matraz Erlenmeyer de 125 ml (30 ml de medio de cultivo/matraz) mediante centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos y se lavaron dos veces con PBS. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis formulado con Triton X-100 al 1 %, un inhibidor de proteasa (1:100) (Millipore) y Benzonase (25 U/ml) (Millipore). Los lisados ​​​​celulares se clarificaron con un filtro de jeringa de PVDF de 0,45 µm (Millipore). Las muestras de VLP de VPH: VIH (L1:P18I10 y L1:T20) se purificaron en serie mediante intercambio catiónico (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, EE. UU.), exclusión por tamaño (Capto Core 700, GE) y afinidad (HiTrap Heparin HP). , GE) cromatografía. Los protocolos cromatográficos se describieron en nuestros estudios anteriores [36,37] y siguieron el protocolo del fabricante [38]. La señal de la proteína L1 en cada paso de purificación se caracterizó mediante análisis de transferencia Western y se sondeó con el anticuerpo L1 anti-VPH16 CAMVIR-1 [39].

2.7. PÁGINA SDS no reductora

Las VLP HPV16 L1, L1:P18I10 y L1:T20 se mezclaron con 2 x tampón de muestra Laemmli (BIO-RAD) en ausencia o presencia de 5 % (v/v) 2-mercaptoetanol ({{11} }ME) y reaccionó a temperatura ambiente (RT) durante 24 h. Las muestras se separaron mediante geles de proteína sin manchas TGX al 8-16% (BIO-RAD). Luego, los geles se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se sondaron con el mAb anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 a una dilución de 1:4000. Después de eso, las membranas se incubaron con conjugado de peroxidasa anti-IgG de ratón (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) a una dilución de 1:4000. La señal se desarrolló y visualizó mediante quimioluminiscencia utilizando el kit de sustrato Western Blot ECL (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Las imágenes de transferencia se adquirieron utilizando el sistema de imágenes Odyssey Fc.

2.8. Análisis de masa molecular

Las VLP HPV16 L1, L1:P18I10 y L1:T20 sin tratamiento con 2-ME se filtraron a través de dispositivos de ultrafiltración de corte de peso molecular (MWCO) de 1000 kDa (SARTORIUS). Las VLP HPV16 L1, L1:P18I10 y L1:T20 con tratamiento 2-ME se pasaron a través de dispositivos de ultrafiltración MWCO de 100 kDa (Amicon). Los retenidos se reconstituyeron al volumen original y se recogieron del depósito de muestra del dispositivo de filtrado, mientras que los filtrados se recogieron en el fondo del tubo de centrífuga. La señal L1 se midió utilizando una transferencia puntual sondada con mAb L1 anti-VPH16 y se detectó mediante conjugado IgG anti-ratón-peroxidasa (Sigma-Aldrich). Las imágenes se adquirieron utilizando el sistema de imágenes Odyssey Fc en un canal de quimioluminiscencia.

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2.9. Tinción negativa y microscopía electrónica de transmisión.

Después de cargar las rejillas de cobre recubiertas de carbono (Sigma-Aldrich) bajo luz ultravioleta durante 5 minutos, VLP HPV16 L1 comercial (Abcam), L1:P18I10 y L1:T20 purificadas se equilibraron con Tris-HCl 20 mM (pH 7,4, NaCl 137 mM). ) se absorbieron en rejillas durante 1 min y se enjuagaron tres veces con agua miliQ. Las VLP de VPH: VIH se tiñeron negativamente con acetato de uranilo al 2% a pH 4,5 (Sigma-Aldrich) durante 1 min. El exceso de agentes colorantes se eliminó con papel de filtro cualitativo Whatman (Sigma-Aldrich). Las rejillas se colocaron en una cámara deshumidificadora al menos 2 h antes de la observación. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio electrónico de transmisión (Tecnai Spirit 120 kV) con aumentos SA135K (100 nm) y SA59000 (200 nm), respectivamente.

2.10. Electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida y análisis de transferencia Western

Se mezclaron cantidades iguales (500 ng) de proteína L1 de HPV16 (Abcam), VLP purificadas de L1:P18I10 y L1:T20 con 2 x tampón de muestra Laemmli que contenía 5 % de 2-ME y se hirvieron a 95 ◦C durante 5 min. . Las muestras se separaron mediante geles de proteína sin manchas TGX al 8-16% y luego se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore, Burlington, MA, EE. UU.) utilizando un dispositivo de transferencia semiseco (Bio-Rad). La membrana se bloqueó con leche desnatada al 5% en TBST. Luego, las membranas se sondaron con el mAb anti-VPH16 L1 CAMVIR-1 en una dilución de 1:4000, mAb anti-VIH-1 gp120 V3 loop (NIBSC, EVA3012) en una dilución de 1: 40 y mAb VIH1 gp41 (2F5) (NIBSC, ARP3063) a una dilución de 1:4000, respectivamente. Después de eso, las membranas se incubaron con conjugado de peroxidasa anti-IgG de ratón (Sigma-Aldrich) a una dilución de 1:4000. Se utilizó el kit de sustrato Western ECL (BIO-RAD) para el desarrollo de la señal. Las imágenes de transferencia se adquirieron utilizando el sistema de imágenes Odyssey Fc en un canal de quimioluminiscencia.

2.11. Inmunización de ratones, recolección de sueros y aislamiento de esplenocitos.

Este es un estudio preliminar de prueba de concepto para demostrar la inmunogenicidad del VPH: VLP del VIH (VLP L1:P18I10 y L1:T20). La dosis, la vía de administración y el intervalo de refuerzo de nuestras VLP de VPH: VIH se referían a estudios previos que inmunizaron ratones con VLP de virus del papiloma bovino (BPV): VIH para inducir respuestas de anticuerpos [20, 21]. VPH purificado: las VLP del VIH se emulsionaron con un volumen igual de (225 µg por cada dosis de 0,5 ml) sulfato de hidroxifosfato de aluminio (Thermo Fisher), para garantizar una formulación similar a la vacuna contra el VPH autorizada Gardasil-9 [40]. Todos los grupos de ratones tuvieron la misma distribución de género (macho n=4 y hembra n=4 por grupo). En los grupos A y B, se inmunizaron ratones BALB/c por vía intramuscular (im) con 10 µg de VLP L1:P18I10 o L1:T20, respectivamente, siguiendo un régimen de refuerzo homólogo. En el grupo C, se inocularon ratones con 106 ufc de BCG.HIVA2auxo.int por vía intradérmica (id, en la plataforma de alimentación) y se les reforzaron con 10 µg de VLP L1:P18I10 por vía intramuscular. En el grupo D, se inoculó a ratones de control positivo con Gardasil- 9 prime seguido de Gardasil-9 boost por vía intramuscular con 10 µg de VLP L1 de HPV16. En el grupo E, los ratones de control negativo se inmunizaron dos veces con tampón PBS. El intervalo de cebado-refuerzo fue de 2 semanas. Los ratones se sacrificaron el día 28. Se recogieron muestras de sangre de los corazones de los ratones. Los sueros se recuperaron mediante centrifugación y se almacenaron a -20 ◦C para el ensayo ELISA. Se extrajeron los bazos murinos y se presionaron individualmente a través de un colador celular (Falcon) con un émbolo de goma de jeringa de 5 ml. Después de la eliminación de los glóbulos rojos con tampón de lisis ACK (Lonza), los esplenocitos se lavaron y se resuspendieron en medio de linfocitos R10 (RPMI 1640 suplementado con suero fetal de ternera (FCS) al 10 %, penicilina-estreptomicina, HEPES 20 mM y {{ 46}}ME) a ​​una concentración de 2 × 107 células/ml.

2.12. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Para probar los anticuerpos específicos de HPV16 L1- y VIH-1-que se unen al HPV quimérico: construcciones de VLP de VIH in vitro, 50 µL de concentración igual (200 ng/mL) de proteína L1 de HPV16 recombinante (Abcam, ab119880 ), las VLP L1:P18I10 y L1:T20 purificadas en tampón carbonato-bicarbonato 50 mM (pH=9.6) (Sigma) se diluyeron 2- veces en serie y se recubrieron sobre las placas Maxisorb (Nunc). Las placas se incubaron a 4 ◦C durante la noche. Las placas se bloquearon con el tampón de bloqueo (5% de leche desnatada en TBST) a 37 ◦C durante al menos 2 h. Después de lavar dos veces con TBST, las placas recubiertas con VLP se incubaron con mAb anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 a una dilución de 1:8000, mAb 2F5 (NIBSC, ARP3063) a una dilución de 1:8000 y anti- VIH-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) a una dilución de 1:40 en tampón de bloqueo, respectivamente, a 37 ◦C durante 2 h. Después de lavar tres veces con TBST, las placas se incubaron con conjugado de peroxidasa de proteína G recombinante (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) a una dilución de 1:4000 en tampón de bloqueo a 37 ◦C durante 1 h. Se utilizó TMB para desarrollar la señal del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y se detuvo con 50 µl de H2SO4 2 M. La densidad óptica (OD) de cada pocillo se midió y registró a una longitud de onda de 450 nm utilizando un lector de microplacas de absorbancia EL × 800.

Para medir los anticuerpos inducidos por VLP en ratones BALB/c, las placas de microtitulación se recubrieron con 50 µl de proteína L1 de HPV16 recombinante de 2 µg/ml (Abcam, ab119880), péptido VIH-1 P18I10 (NIBSC, ARP734), Péptido T20 (NIBSC, ARP984), respectivamente, con tampón carbonato-bicarbonato 50 mM (pH=9.6). Las placas se incubaron a 4 ◦C durante la noche. Las placas se bloquearon con el tampón de bloqueo (5% de leche desnatada en TBST) a 37 ◦C durante al menos 2 h. Al mismo tiempo, los sueros recolectados del grupo de ratones inmunizados con AE se diluyeron con leche desnatada al 5% en TBST en una proporción de 1:50. Después de lavar dos veces con TBST, las placas se incubaron con los sueros diluidos a 37 ◦C durante 2 h. Después de lavar tres veces con TBST, a las placas se les añadió conjugado de proteína G HRP recombinante a una dilución de 1:4000 en tampón de bloqueo y se incubaron a 37 ◦C durante 1 h. Se usó TMB para desarrollar la señal ELISA y se detuvo con 50 µL de H2SO4 2 M. La DO de cada pocillo se midió a una longitud de onda de 450 nm utilizando un lector de microplacas de absorbancia EL × 800 (Biotek).

2.13. Ensayo IFN-ELISpot

El ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISpot) se realizó utilizando el kit comercial IFN-ELISpot murino (Mabtech, Nacka Strand, Suecia), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las placas ELISpot (MSISP4510, 96-placas de pocillos con membranas de difluoruro de polivinilideno, Millipore, condado de Middlesex, MA, EE. UU.) se trataron con EtOH al 70 % y se recubrieron con anticuerpo monoclonal de captura de interferón (IFN-) anti-ratón purificado diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta una concentración final de 5 µg/ml a 4 ◦C durante la noche. Luego, se agregaron 2,5 x 105 esplenocitos frescos a cada pocillo. Posteriormente, las células de los grupos A y B fueron estimuladas con 2 µg/mL de péptidos VLP L1 de HPV16 y P18I10 de VIH-1, respectivamente. Todas las muestras y controles se sembraron en pocillos por duplicado. Los ensayos ELISpot se incubaron durante 16 h a 37 ◦C, 5% de CO2. Posteriormente, las placas se lavaron 5 veces con PBS, se incubaron durante 2 h con un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-IFN biotinilado diluido en PBS 2% de suero fetal bovino (FCS) hasta una concentración final de 2 µg/ml, se lavaron 5 veces. en PBS, y se incubaron con el conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina en PBS 2% FCS. Luego, las placas se lavaron 5 veces con PBS antes de incubarlas con 100 µL de solución de sustrato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)/azul nitro de tetrazolio (NBT) (Sigma-Aldrich). , San Luis, MO, EE.UU.). Después de 5 a 10 minutos, las placas se lavaron con agua del grifo, se secaron y las manchas resultantes se contaron utilizando un lector ELISPOT (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Alemania). Para cada animal, la media de las respuestas de fondo se restó individualmente de todos los pocillos para permitir una comparación de las células formadoras de manchas de IFN (SFC)/106 entre grupos. Para definir las respuestas positivas, se definió un umbral como al menos cinco puntos por pocillo y respuestas que excedían el número medio de puntos en los pocillos de control negativo más tres desviaciones estándar de los pocillos de control negativo.

2.14. Análisis estadístico

Todo el análisis estadístico se realizó utilizando el software Prism 6 GraphPad (CA, EE. UU.). Utilizamos datos de experimentos realizados con 5 concentraciones diferentes de recubrimiento de placas ELISA (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) de proteína L1 de HPV16 recombinante (Abcam, ab119880) y VLP de HPV:VIH. Recopilamos datos de 2 grupos (VPH16 L1 y VPH: VLP de VIH) y recolectamos tres réplicas para cada concentración de recubrimiento. El gráfico en Prism mostró los datos como un diagrama de dispersión que muestra la concentración de recubrimiento (ng/mL) en el eje X y la DO450 en el eje Y. Dado que planteamos la hipótesis de que nuestros datos de ELISA in vitro están relacionados en un patrón lineal, realizamos el análisis de regresión lineal y comparamos las pendientes de las dos líneas para confirmar que el conjunto de datos-1 y el conjunto de datos-2 (anticuerpo reactividad entre HPV16 L1 y HPV: VIH VLP) son diferentes en sus acciones. Seleccionamos intervalos de confianza del 95% junto con la línea de mejor ajuste. Prism superpuso automáticamente una línea de regresión lineal en ambos conjuntos de datos y trazó una línea de puntos que representa intervalos de confianza del 95%. Durante el análisis de regresión lineal, el software calculó solo el valor Y medio de nuestro conjunto de datos que indicaba la bondad del ajuste. Además, Prism nos hizo un comentario, por lo que podemos concluir que las diferencias entre ambas vertientes son sumamente significativas.

Tuvimos 5 conjuntos (ELISA) y 4 conjuntos (ELISPOT) de datos recopilados de experimentos de inmunización en ratones. Estos conjuntos de datos tenían un número igual (hombres n=4 y mujeres n=4) en cada grupo. Utilizamos ratones inmunizados con Gardasil-9-como grupo de control positivo y ratones inmunizados con PBS como grupo de control negativo. Los datos de nuestros experimentos diseñados no coincidían ni se emparejaban. Realizamos un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para ver si estas medias eran diferentes. Primero comprobamos que nuestros datos se ajustaban a la distribución normal gaussiana. Encontramos que algunos grupos de datos en el ensayo ELISA no pasaron la prueba de distribución normal gaussiana. Por ello, realizamos un análisis estadístico no paramétrico de estos datos. Por el contrario, todos los grupos de datos del ensayo ELISPOT superan la prueba de distribución normal gaussiana. Por tanto, realizamos un análisis estadístico paramétrico de estos datos. El umbral de significancia y el nivel de confianza se establecieron en 0.05 (equivalente a un intervalo de confianza del 95%). Valor de p que muestra en general la probabilidad de que existan diferencias entre grupos. Dado que nuestra principal preocupación para este experimento es cuáles son las diferencias entre nuestros grupos, las comparaciones múltiples en Prism nos dieron el resultado de la comparación de todos los grupos con todos los demás grupos.

2.15. Declaraciones de ética

Se compraron ratones BALB/c de seis a ocho semanas de edad de Envigo (una empresa de Inotiv, Chicago, IL, EE. UU.) y fueron aprobados por las autoridades locales (Generalitat de Catalunya, número de proyecto 11157) y el Comité de Ética de la Universitat Autònoma de Barcelona. Los experimentos con animales se ajustaron estrictamente a la legislación de bienestar animal de la Generalitat de Catalunya. Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Investigación local (Procedimiento 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).

3. Resultados

3.1. Diseño de inmunógenos L1:P18I10 y L1:T20 y evaluación del VPH: expresión de proteínas del VIH mediante el uso del sistema de expresión 293F

El péptido P18I10 del bucle del tercer dominio variable (V3) de Env del VIH-1 y el péptido T20 de la región externa proximal (MPER) de la membrana de Env del VIH-1 se insertaron en la proteína del bucle DE L1 DE del VPH16 para generar L1 quimérica. :P18I10 y L1:T20 inmunógenos. Las secuencias codificantes de ADN quiméricas L1:P18I10 y L1:T20 se clonaron en el vector de expresión de ADN plasmídico pcDNA3.1 (+) para la transfección transitoria en células 293F (Figura 1A). Las estructuras monoméricas de las proteínas de la cápside HPV16 L1, quimérica L1:P18I10 y L1:T20 se predijeron preliminarmente utilizando el servidor de modelo SWISS (Figura 1B). Se seleccionó la proteína L1 de la cápsida principal de HPV16 (7cn2.1.R) como plantilla estructural para construir el modelado de homología de proteínas de la cápsida de HPV16 L1, L1:P18I10 y L1:T20. En comparación con la conformación del péptido P18I10 unido en el estudio anterior [41], la dirección de la cadena principal del extremo N al C del péptido P18I10 en nuestra proteína quimérica L1:P18I10 va de derecha a izquierda (Figura 1B, panel central y superior). y las cadenas laterales de P18I10 expuestas podrían interactuar potencialmente con los receptores de células T (Figura 1B, panel central e inferior). En comparación con la estructura del péptido inhibidor de la fusión del VIH-1 en el artículo de revisión anterior [42], el péptido T20 insertado en la proteína de la cápside L1 del VPH16 se presenta como una formación similar a una hélice (Figura 1B, panel derecho y superior). ), y las cadenas laterales T20 expuestas podrían ser reconocidas por los receptores de células B (Figura 1B, panel derecho e inferior). Dado que las proteínas de la cápside L1 del VPH16 podrían ensamblarse homogéneamente en una partícula icosaédrica T=7 con 72 capsómeros pentaméricos [43], la presentación de alta densidad de los péptidos P18I10 o T20 en la superficie exterior de las VLP quiméricas del VPH: VIH es potencialmente altamente inmunoestimuladora. para inducir respuestas inmunes específicas de epítopos.

Figura 1. Diseño de inmunógeno L1:P18I10 y L1:T20 y construcción de VLP quiméricas de VPH:VIH mediante el uso del sistema de expresión 293F. (A) Las secuencias codificantes de ADN quiméricas L1:P18I10 y L1:T20 se clonaron en vectores de expresión pcDNA3.1+, respectivamente, para la transfección transitoria en células 293F. (B) Predicción de estructuras monoméricas de HPV16 L1 y HPV quimérico: proteínas de la cápside del VIH mediante el uso del servidor modelo SWISS. Se seleccionó la proteína L1 de la cápsida principal de HPV16 (7cn2.1.R) como plantilla estructural para construir el modelado de homología de proteínas de la cápsida de HPV16 L1 (panel izquierdo), L1:P18I10 (panel central) y L1:T20 (panel derecho). Los elementos estructurales secundarios de la proteína de la cápside L1 del VPH16 están etiquetados, con letras h1–h5 para las 5 -hélices. Los bucles de la proteína de la cápside L1 del VPH16 entre las hebras están etiquetados como BC, CD, DE, EF, FG y HI. Los elementos estructurales secundarios de los péptidos L1 del VIH-1 P18I10 y T20 están marcados por las flechas (panel superior). La parte del péptido P18I10 y T20 que sobresale por encima de la superficie de la proteína de la cápside L1 del VPH16 está indicada por las flechas (panel inferior). (C) Tinción por inmunofluorescencia de la proteína L1 en células 293F. Los siguientes pDNA.L1:P18I10 (izquierda), pDNA.L1:T20 (centro) y pDNA.sin inserción (derecha) se transfectaron en células 293F. Las células transfectadas se sondaron con mAb L1 anti-VPH16 y se detectaron con IgG-FITC anti-ratón (canal verde). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (canal azul). Las imágenes de inmunofluorescencia se fusionaron utilizando Adobe Photoshop.

Dado que la secuencia terminal de la proteína C del VPH16 L1 media la maquinaria de importación nuclear celular durante la infección [44], las señales de localización nuclear (NLS) de la proteína L1 del VPH16 se han identificado en estudios previos [45]. Se seleccionó el anticuerpo monoclonal CAMVIR-1 para reconocer el epítopo L1 del VPH16 (GFGAMDF, 230–236 aa) [39], y se utilizó el colorante FITC a base de fluoresceína como indicador para monitorear la expresión de L1:P18I10 y L1: Proteínas T20. Las imágenes de inmunofluorpresencia mostraron claramente que HPV16 L1 (en verde) estaba localizado principalmente en los núcleos (en azul) de las células 293F. No se observó señal L1 en células 293F transectadas con plásmido de control (plásmido pcDNA3.1 sin inserto) (Figura 1C). Los resultados sugirieron que las proteínas quiméricas de la cápside L1:P18I10 y L1:T20 podrían expresarse mediante transfección mediada por polietilenimina (PEI) y ser reconocidas por el anticuerpo monoclonal HPV16 L1 CAMVIR-1.

3.2. Purificación de VLP L1:P18I10 y L1:T20 mediante métodos cromatográficos

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa y una banda inferior heteróloga<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Figura 2. Purificación y caracterización de VLP L1:P18I10 y L1:T20. (A) Diagrama de flujo del proceso esquemático de purificación de VLP L1:P18I10 y L1:T20 mediante cromatografía. (B, C) Análisis de transferencia Western de muestras de VLP L1:P18I10 y L1:T20 de cada paso de purificación. La señal de L1 en cada paso de purificación se caracterizó mediante análisis de transferencia Western sondada con mAb anti-HPV16 L1. La flecha indica el peso molecular de ~56 kDa de proteínas L1:P18I10 y ~58 kDa de L1:T20. Carril 1: lisado celular clarificado (CCL); Carril 2: flujo continuo (FT) de la carga de muestras de cromatografía de intercambio catiónico (CEC); Carril 3: eluato de CEC; Carril 4: FT del paso de regeneración con NaCl 2 M de CEC; Carril 5: cromatografía de exclusión molecular (SEC) FT-1; Carril 6: SEC FT-2; Carril 7: FT de carga de muestra de cromatografía de afinidad con heparina (H-AC); Carril 8: eluato de H-AC; Carril 9: FT de la etapa de regeneración de NaCl 2 M con H-AC; Carril 10: 10- veces diafiltración.

3.3. Estabilidad in vitro y autoensamblaje de VLP L1:P18I10 y L1:T20

Para confirmar que las VLP purificadas de VPH: VIH mostraron una estabilidad in vitro similar a las VLP L1 de VPH16, realizamos SDS-PAGE no reductora para evaluar el entrecruzamiento de disulfuro de las proteínas de la cápside de VPH: VIH (Figura 3A). Se sabe que el pH, la fuerza iónica, la temperatura [52] y el entorno redox se correlacionan con los enlaces disulfuro de las proteínas de la cápside L1 del VPH16 [53]. Las VLP de HPV L1 tienden a autoensamblarse a pH bajo y fuerza iónica alta. El desmontaje máximo de las VLP generalmente requiere la exposición a una alta concentración de agente reductor, como 2-mercaptoetanol (2-ME) al 5% durante un período relativamente largo [54]. En ausencia de agentes reductores 2-ME, solo una pequeña porción de la proteína HPV-16 L1, L1:P18I10 y L1:T20 migró a monómeros con un peso molecular aparente (MW) de 55 kDa. . Aproximadamente el 70% de las proteínas L1 tenían enlaces disulfuro en dímeros o pentámeros más grandes, con un PM previsto de 110 kDa y 280 kDa (Figura 3A, carriles 2, 4 y 6). Por el contrario, casi todas las proteínas HPV-16 L1, L1:P18I10 y L1:T20 en el tampón de desensamblado aparecieron estructuras monoméricas en SDS-PAGE no reductora (Figura 3A, carriles 3, 5 y 7). Estos resultados indicaron que la estabilidad in vitro de las VLP L1:P18I10 y L1:T20 purificadas presentaba patrones de entrecruzamiento de disulfuro similares a los de las VLP L1 de HPV16 bajo el mismo pH, fuerza iónica y condiciones térmicas. Las VLP purificadas parecen descomponerse al nivel de pentámeros, trímeros y dímeros después de una exposición prolongada a altas concentraciones de agentes reductores. Estos datos concuerdan con estudios previos [53,54]. Sin embargo, el desmontaje de las VLP del VPH: VIH aún estaba lejos de estar completo (monómeros).

Figura 3. Estabilidad in vitro de las VLP L1:P18I10 y L1:T20. (A) Reticulación de disulfuro de VLP L1:P18I10 y L1:T20 en SDS-PAGE no reductora. Las VLP L1 de HPV16, las VLP L1:P18I10 y L1:T20 purificadas se mezclaron con tampón de muestra Laemmli en ausencia o presencia de 2-mercaptoetanol (2-ME), respectivamente, y se analizaron mediante métodos no reductores. PÁGINA SDS. La posición del monómero L1 (55 kDa), el dímero L1 (110 kDa) y el pentámero L1 (280 kDa) se indican con la flecha. Carril 1: marcador de peso molecular de proteína; Carril 2: VLP L1 de HPV16; Carril 3: VLP de L1 de HPV16 tratada con 2-ME; Carril 4: L1: P18I10 VLP; Carril 5: L1:P18I10 VLP tratada con 2-ME; Carril 6: L1: VLP T20; Carril 7: L1:T20 VLP tratada con 2-ME. (B) Análisis de masa molecular de L1:P18I10 y L1:T20 VLP. Las VLP ensambladas sin tratar con 2-ME (carriles 2, 4 y 6) se filtraron a través de dispositivos de diafiltración de corte de peso molecular (MWCO) de 1000 kDa (panel superior). Las VLP desensambladas tratadas con 2-ME (carriles 3, 5 y 7) se filtraron a través de dispositivos de filtro centrífugo MWCO de 100 kDa (panel inferior). Los retenidos (R) se recogieron de los depósitos de muestras del dispositivo de filtrado, mientras que los filtrados (F) se recogieron en el fondo de los tubos de centrífuga. La señal de la proteína L1 se detectó utilizando una transferencia puntual sondada con mAb L1 anti-VPH16.

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) y se conservaron en retenidos. El patrón coincidió con los datos observados en SDS-PAGE no reductor. Aunque todos los grupos de VLP tratados con 2-ME se mostraron en una banda monomérica (~55 kDa) en la SDS-PAGE no reductora (Figura 3A, carriles 3, 5 y 7). Sin embargo, las VLP reducidas correspondientes no se filtraron a través de membranas de ultrafiltración de 100 kDa (Figura 3B, panel inferior). Estos resultados sugirieron que las proteínas quiméricas VPH: VIH eran capaces de autoensamblarse en partículas más grandes, pero el desensamblaje máximo de las VLP en monómeros requería no solo la reducción de los enlaces disulfuro sino también otros factores desnaturalizantes, como el pH o la fuerza iónica.

3.4. Caracterización morfológica de las VLP L1:P18I10 y L1:T20.

Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para examinar la conformación morfológica de HPV16 L1 y HPV:VIH VLP. Los péptidos VIH-1 P18I10 y T20 se insertaron en bucles DE de la proteína L1 de HPV16, respectivamente. Estas proteínas comerciales de la cápside del VPH16 L1 y del VPH quimérico: VIH pueden autoensamblarse espontáneamente in vitro en VLP integrales con un diámetro de aproximadamente 50 a 60 nm (Figura 4A-C, panel derecho). En comparación con las micrografías electrónicas de las VLP de HPV16 L1 publicadas en estudios anteriores [55,56], la estructura icosaédrica de las VLP de HPV16 L1, L1:P18I10 y L1:T20 aquí era menos contrastada y vaga. Podría atribuirse al reactivo de tinción negativo que utilizamos en este estudio. En nuestro estudio reciente publicado en un estudio anterior [37] y en otro artículo en curso bajo revisión por pares (datos no mostrados), obtuvimos buena calidad y resolución de micrografías electrónicas cuando se utilizan VLP L1:P18I10 derivadas de levaduras y baculovirus (las mismas quiméricas). constructo) se equilibraron en PBS y se tiñeron negativamente con ácido fosfotúngstico (PTA). Debido a que utilizamos los diferentes sistemas de producción y purificación de VLP en este estudio, las VLP L1: P18I10 y L1: T20 derivadas de células de mamíferos se equilibraron con Tris-HCl y se tiñeron negativamente con acetato de uranilo. Aunque las micrografías electrónicas podrían mejorarse, aún pudimos observar un patrón claro de que la mayoría de las proteínas de la cápside HPV16 L1, L1:P18I10 y L1:T20 podrían autoensamblarse en VLP morfológicas bajo la pantalla TEM (Figura 4A-C, panel izquierdo). ). Básicamente, las VLP del VPH están protegidas contra la agregación en condiciones de alto contenido de sal [57]. Parte de la agregación detectable de HPV16 L1 y HPV: VLP de VIH en tampón Tris-HCl bajo en sal se pudo ver con el aumento inferior (Figura 4A-C, panel izquierdo). A partir de estos resultados, llegamos a la conclusión de que la modificación de la secuencia parcial del bucle DE L1 mediante la inserción de péptidos VIH-1 P18I10 o T20 no afectó significativamente la morfología de las VLP de VPH: VIH.

Figura 4. Micrografías electrónicas de VLP L1:P18I10 y L1:T20. (A) Morfología de las VLP del VPH16. (B) Morfología de las VLP L1:P18I10. (C) Morfología de las VLP L1:T20. Las VLP purificadas se absorbieron en rejillas de cobre recubiertas de carbono cargadas de UV y se tiñeron negativamente con acetato de uranilo al 2%. Las imágenes se adquirieron bajo microscopía electrónica de transmisión. La barra representa 200 nm con un aumento de 59,000 (panel izquierdo) y 100 nm con un aumento de 135 K (paneles derechos), respectivamente

3.5. Presentación y reactividad de los epítopos del VPH-16 y del VIH-1 

Para confirmar que los epítopos secuenciales de VIH-1 P18I10 o 2F5 se presentaron en VLP L1:P18I10 o L1:T20 purificadas por cromatografía, se realizaron análisis de transferencia Western y ELISA indirecto utilizando mAb específicos de epítopo. Seleccionamos un anticuerpo monoclonal (mAb) bien conocido, denominado CAMVIR-1, para reconocer el epítopo altamente conservado (GFGAMDF, aa 230–236) de la proteína L1 del VPH16 [39,58]. Se eligió un mAb previamente publicado dirigido al epítopo del bucle V3 gp120 del VIH -1 (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) para detectar epítopos secuenciales P18I10 (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59]. Por otro lado, para la caracterización del péptido T20 se eligió el anticuerpo neutralizante amplio (bnAb) que reconoce el epítopo F5 de la gp-1VIH (ELDKWA) contra una amplia variedad de cepas de VIH-1 de laboratorio. 60,61]. El ensayo de transferencia Western sondado con mAb HPV16 L1 mostró bandas de 55, 56 y 58 kDa correspondientes a las proteínas HPV16 L1, L1:P18I10 y L1:T20, respectivamente (Figura 5A, B, izquierda). El peso molecular (PM) de la proteína L1:P18I10 fue similar al de la proteína L1 del VPH16 (Figura 5A, izquierda). La banda correspondiente a la proteína L1:T20 se observó ligeramente más alta que la proteína L1 del VPH16, como se predijo a partir de la secuencia de aminoácidos adicional (Figura 5B, izquierda). Las bandas de aproximadamente 56 y 58 kDa, correspondientes a las proteínas L1:P18I10 y L1:T20, se detectaron en un ensayo de transferencia Western sondado con mAb anti-VIH-1gp120 V3 y 2F5, respectivamente (Figura 5A, B, derecha). ). Pensamos que el peso molecular (MW) de la proteína L1:T20 teñida con anti-2F5- era correcto y se ajustaba a los 58 kDa esperados (Figura 5B, derecha). Sin embargo, el PM de la proteína L1:P18I10 teñida con gp120 V-1 anti-VIH es un poco menor (Figura 5A, derecha). Esto podría atribuirse a la estructura heterogénea de las proteínas quiméricas L1:P18I10. Dado que la conformación secuencial del epítopo podría perderse bajo la condición desnaturalizante en SDS-PAGE. Por lo tanto, realizamos además ELISA indirecto para demostrar el péptido conformacional P18I10 presentado correctamente en nuestras VLP quiméricas L1:P18I10 (Figura 5E). Por otro lado, el anticuerpo anti-VIH-1 gp120 V3 loop que utilizamos reconoció todo el bucle VIH-1 V3 en lugar del epítopo P18I10. En consecuencia, la señal general anti-V3 fue menor (Figura 5A, B, paneles derechos). Aun así, estos resultados indicaron que los péptidos secuenciales VIH-1 P18I10 y T20 se presentan en las VLP VPH:VIH.

Figura 5. Presentación de los epítopos de VPH-16 y VIH-1. (A, B) Detección secuencial de epítopos de VLP quiméricas L1:P18I10 y L1:T20. Las VLP L1:P18I10 y L1:T20 purificadas se analizaron mediante transferencia Western, utilizando mAb anti-HPV16 L1, anti-VIH-1gp120 V3 y 2F5. Las VLP HPV16 L1 se utilizaron como control. El peso molecular de las proteínas L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) y L1:T20 (58 kDa) se indica con la flecha. Carril 1: marcador de peso molecular de proteína; Carril 2: proteína L1 de HPV16; Carril 3: L1: proteína P18I10; Carril 4: proteína L1:T20. (C, D) Unión de mAb HPV16 L1 a VLP quiméricas L1:P18I10 y L1:T20. (E) Unión de mAb anti-VIH-1 gp120 V3 a VLP quiméricas L1:P18I10. (F) Unión del mAb VIH-1 2F5 a VLP quiméricas L1:T20. El gráfico de líneas de ELISA indirecto se realizó para detectar los epítopos conformacionales de las VLP recombinantes L1, L1:P18I10 y L1:T20 del VPH16 unidas a mAb anti-L1, anti-VIH-1gp120 V3 o 2F5, respectivamente. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Se realizó una prueba de regresión lineal simple para comparar la diferencia de líneas de las VLP L1:P18I10 y L1:T20 purificadas con la curva estándar de las VLP L1 comerciales; ns: no significativo; **p<0,01.

Además, para determinar si los epítopos conformacionales del VIH{{{{50}}}} presentados en el VPH: las VLP del VIH podrían identificarse mediante los anticuerpos neutralizantes gp120 V3 y 2F5 in vitro, realizamos un ensayo ELISA indirecto para verificar la especificidad y reactividad de unión al epítopo. Como se muestra en la Figura 5C, D, las VLP HPV16 L1, L1:P18I10 y L1:T20 fueron reconocidas por mAb anti-L1. Realizamos un análisis de regresión lineal para comparar la pendiente de cada línea de dilución. Los resultados revelaron que la especificidad de unión al epítopo L1 de las VLP L1:P18I10 o L1:T20 no era diferente de las VLP L1 de HPV16. Además, el mAb anti-VIH-1 gp120 V3 fue capaz de unirse a las VLP L1:P18I10, pero no a las VLP L1 de HPV16 (Figura 5E). Además, el mAb 2F5 podría reconocer las VLP L1:T20, pero no las VLP L1 de HPV16 (Figura 5F). Después del análisis de regresión lineal, la diferencia en la especificidad de unión al epítopo gp120 V3 entre L1:P18I10 y HPV16 L1 fue extremadamente significativa (p < 0,01%). La especificidad de unión al epítopo 2F5 de las VLP L1:T20 fue significativamente diferente de la de las VLP L1 de HPV16 (p <0,01%). Este patrón reveló que los lípidos celulares hidrofóbicos no eran necesarios para la unión de los anticuerpos neutralizantes 2F5-a las VLP del VPH:VIH in vitro. Aunque la reactividad de los anticuerpos neutralizantes anti-VIH-1 gp120 V3 y 2F5 contra el VPH: VLP del VIH es relativamente leve, la unión del mAb anti-VIH-1 gp120 V3 y 2F5 con el VPH: VLP del VIH fue significativamente específico de epítopo.

3.6. Inmunogenicidad de las VLP L1:P18I10 y L1:T20 después de la inmunización en ratones BALB/c

Evaluamos las respuestas inmunitarias específicas del VPH16- y del VIH-1-después de la inmunización de ratones BALB/c con VLP L1:P18I10 y L1:T20. El calendario de vacunación se muestra en la Figura 6A. Debido a que la inmunogenicidad inducida por VLP después de la administración mucosa fue generalmente más débil que después de la administración sistémica, los ratones fueron inmunizados por vía intramuscular con una sexta parte de la dosis de Gardasil-9 HPV16 L1 [22,62]. El adyuvante de sulfato de hidroxifosfato de aluminio para una dosis (10 µg/100 µl) de VLP quiméricas de VPH:VIH se ajustó a la misma concentración (1 mg/1 ml) que Gardasil-9. Para evaluar la diferencia de sexo en los resultados de la vacunación, se evaluó una comparación de las respuestas de anticuerpos entre ratones machos (n=4) y hembras (n=4). En el grupo de L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP y Gardasil-9, las respuestas de anticuerpos anti-HPV16 L1 de ratones hembra fueron en promedio más altas que las de los ratones macho (Figura 6B). 2 de 4 (50%) hembras inmunizadas con L1:P18I10 VLP, 3 de 4 (75%) hembras inmunizadas con L1:T20 VLP y todas (100%) las hembras inmunizadas con Gardasil provocaron títulos más altos de anticuerpos anti-L1 que los ratones macho. Las respuestas anti-L1 inducidas por ratones hembra en el grupo Gardasil-9 fueron significativamente mayores que las de los ratones macho (p=0.0041) (Figura 6B). Se detectó un nivel muy bajo de respuestas de anticuerpos anti-L1 en el grupo de cebado BCG.HIVA y refuerzo de VLP L1:P18I10. Este patrón se corresponde con hallazgos previos que describen que BCG induce predominantemente respuestas de células T en lugar de producción de IgG [63].

Figura 6. Inducción de respuestas inmunes humorales por las VLP L1:P18I10 y L1:T20 en ratones BALB/c. El calendario de vacunación se muestra en (A) Todos los grupos de ratones tenían la misma distribución de género (macho n=4 y hembra n=4). Grupos A y B: inmunización homóloga de refuerzo con 10 µg de VLP L1:P18I10 o L1:T20 por vía intramuscular (im); Grupo C: preparación con 106 ufc de rBCG.HIVA por vía intradérmica (id) y refuerzo con 10 µg de VLP de L1:P18I10 im; Grupo D: vacunación homóloga de refuerzo con Gardasil-9 que contiene 10 µg de VLP L1 de VPH16 im; Grupo E: inmunización dos veces con tampón PBS. El intervalo de cebado-refuerzo fue de 2 semanas. El criterio de valoración de este ensayo fue el día 28. Se recogieron los sueros y se diluyeron a un título de 1:50 para el ensayo ELISA. (B) IgG específica del VPH L1-en ratones machos y hembras. (C-E) IgG específica de epítopo inducida por VLP L1:P18I10 y L1:T20. Se realizó ELISA para analizar IgG anti-L1, anti-P18I10 y anti-T20 inducida por ratones BALB/c después de diferentes combinaciones de cebado-refuerzo como se describió anteriormente. Los datos se muestran como media ± DE. Se realizó una prueba ANOVA unidireccional (no paramétrica) para comparar las diferencias entre los grupos. OD: densidad óptica. Ns no significativo; **p<0,01

Evaluamos si los ratones inmunizados con las VLP L1: P18110 y L1: T20 podían inducir anticuerpos específicos del epítopo del VPH-16 L1-y del VIH-1 en ratones BALB/c. Los anticuerpos IgG inducidos por VLP en sueros murinos se midieron mediante ELISA recubierto con proteína L1 de HPV16 recombinante, péptidos P18I10 o T20, respectivamente. Se detectó una diferencia estadística en la IgG específica de L1- a un título sérico de 1:50 en el grupo de Gardasil-9 en comparación con el grupo de control de PBS (p=0.0039). Las respuestas anti-L1 entre los ratones inmunizados con Gardasil-9, L1:P18I10 y L1:T20 VLP fueron similares y no difirieron significativamente (Figura 6C). Los ratones BCG.HIVA2auxo.int prime y L1:P18I10 VLP boost provocaron un nivel muy bajo de IgG anti-L1. Estos resultados sugirieron que los ratones inmunizados con VLP de VPH: VIH produjeron el mismo nivel de IgG anti-L1 que los ratones inmunizados con Gardasil-9-(Figura 6C). Aunque el grupo VLP L1:P18I10 numéricamente parece tener una tendencia hacia un nivel más alto de IgG específica del epítopo P18I10 que otros grupos de inmunización, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (Figura 6D). En algunos de los ratones inmunizados con VLP L1:P18I10 (4 de 8, 50%), se observaron anticuerpos de unión anti-P18I10 más altos en comparación con los ratones inmunizados con Gardasil-9-. Alternativamente, un análisis de prueba T reveló que la diferencia entre el grupo L1:P18I10 VLP y Gardasil-9 fue significativa (p=0.005) (datos no mostrados). En el grupo L1:T20 VLP, se detectó una respuesta de anticuerpos significativamente mayor contra el péptido T20 en comparación con el grupo Gardasil-9 (p=0.0083). Como se esperaba, los títulos anti-T20 fueron indetectables en Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP y BCG.HIVA prime combinados con grupos de refuerzo L1:P18I10 VLP (Figura 6E). El título del anticuerpo específico del péptido T20 fue relativamente bajo. Es probable que esto se deba a: (1) T20 es un péptido subdominante; (2) la obtención de anticuerpos neutralizantes MPER o 2F5 requiere conjugados péptido-lípido (Figura 6E). En general, nuestros resultados demostraron que las VLP L1:P18I10 y L1:T20 podrían inducir respuestas de anticuerpos específicas contra el VPH16- pero débiles contra el VIH-1-en ratones.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Para evaluar las respuestas inmunes de las células T específicas del VPH y del VIH en ratones, seguimos el programa de inmunización que se muestra en la Figura 7A. Además, se comparó la preparación heteróloga de BCG.HIVA2auxo.int y el refuerzo de VLP L1:P18I10 con la inmunización de refuerzo y preparación de VLP L1:P18I10 homóloga para evaluar la frecuencia de las respuestas inmunitarias de células T específicas de VPH16 y VIH-1. No hubo diferencias entre los grupos Gardasil-9 y PBS con respecto a la secreción de IFN- después de la estimulación de esplenocitos con VLP L1 de HPV16. Las diferencias en la secreción de IFN-específico de L1- tampoco fueron significativas entre los grupos L1:P18I10 VLP y Gardasil-9. Dedujimos que la débil secreción de IFN-específica de L1- podría atribuirse a la baja concentración (2 µg/mL) de VLP L1 de HPV16 utilizadas como estímulo. El grupo de BCG.HIVA2auxo.int prime y L1:P18I10 VLP boost indujeron una mayor frecuencia de esplenocitos secretores de IFN y se observaron diferencias significativas en la secreción de IFN en comparación con los ratones vacunados con el grupo Gardasil-9 (p {{36 }}.0103). 3 de 8 ratones (~38%) provocaron las respuestas de IFN- específicas de L1- más altas (Figura 7B). Esto podría atribuirse a la adyuvancia inespecífica de BCG según nuestros estudios previos [64-66]. El evidente efecto de preparación, incluso con la BCG de tipo salvaje, está en consonancia con la capacidad de los derivados de rBCG de actuar como potentes adyuvantes para vacunas de refuerzo posteriores [64,65]. Con respecto a las respuestas de las células T específicas del VIH-1-, la magnitud total más alta de células formadoras de manchas de IFN (SFC)/106 esplenocitos se observó en ratones preparados con BCG.HIVA2auxo.int en comparación con los ratones que recibieron Gardasil{{54} } vacunas o VLP L1:P18I10. Los ratones preparados con BCG.HIVA y reforzados con VLP L1:P18I10 provocaron una secreción de IFN- significativamente mayor en comparación con los ratones vacunados con refuerzo cebador homólogo de VLP L1:P18I10 (p=0.0268). Además, se observó una secreción de IFN- significativamente mayor en ratones vacunados con VLP L1:P18I10 en comparación con ratones que recibieron vacunas Gardasil-9 (p=0.0157) (Figura 7C). Como se esperaba, la secreción de IFN- fue indetectable en los grupos Gardasil-9 y PBS. Estos resultados demostraron que (1) las VLP L1:P18I10 provocaron respuestas inmunitarias de células T específicas del VIH-1-; (2) Las VLP L1:P18I10 provocaron respuestas inmunitarias de células T específicas del VPH y (3) BCG.HIVA2auxo.int podría estimular las respuestas inmunitarias de células T específicas del VIH-1-inducidas por las VLP L1:P18I10.

Figura 7. Inducción de respuestas de células T específicas de VPH16 y VIH-1 mediante VLP quiméricas L1:P8I10 y BCG.HIVA en ratones BALB/c. El calendario de vacunación se muestra en (A). Todos los grupos de ratones tuvieron la misma distribución de género (macho n=4 y hembra n=4). Grupo A: inmunización homóloga de refuerzo con 10 µg de VLP L1:P18I10 por vía intramuscular (im); Grupo B: preparación con 106 ufc de rBCG.HIVA por vía intradérmica (id) y refuerzo con 10 µg de VLP de L1:P18I10 im; Grupo C: vacunación homóloga de refuerzo con Gardasil-9 que contiene 10 µg de VLP L1 de VPH16 im; Grupo D: inmunización dos veces con tampón PBS. El intervalo de cebado-refuerzo fue de 2 semanas. El criterio de valoración de este ensayo fue el día 28. Se aislaron esplenocitos para el ensayo IFN-ELISpot. Las respuestas inmunes de las células T al VPH16 y al VIH-1 se evaluaron ex vivo mediante IFN-ELISpot después de la estimulación de los esplenocitos con VLP L1 de VPH16 y el péptido P18I10. (B, C) Respuestas de células T específicas de HPV16 L1- y VIH-1 P8I10-inducidas por L1:P8I10 VLP y BCG.HIVA Prime combinado con refuerzo de L1:P18I10 VLP. Los datos se muestran como mediana ± DE. Se realizó una prueba ANOVA unidireccional para comparar las diferencias entre los grupos. Ns no significativo; *p < 0,05.

4. desdiscusión

Tanto el VPH16 como el VIH-1 son enfermedades de transmisión sexual y actualmente son el foco de muchos estudios de vacunas. Aunque se han comercializado vacunas profilácticas contra el VPH y la transmisión del VIH-1 se ha controlado en gran medida mediante el tratamiento antirretroviral (TAR) y la PrEP, una vacuna quimérica VPH: VIH eficaz, segura y asequible contra ambos virus es una necesidad urgente. En este estudio, (1) demostramos que el sistema de expresión 293F y el método de purificación cromatográfica podrían ser enfoques factibles para producir y purificar VLP quiméricas L1:P18I10 y L1:T20; (2) confirmamos que la inserción de péptidos P18I10 o T20 en el bucle DE de las proteínas de la cápside L1 del VPH16 no afectó la estabilidad in vitro, el autoensamblaje y la morfología de las VLP quiméricas de VPH:VIH; (3) Los péptidos P18I10 o T20 secuenciales y conformacionales expuestos a bucles DE de VPH quiméricos: VLP de VIH podrían detectarse mediante anticuerpos neutralizantes anti-VIH-1gp120 V3 y 2F5 in vitro; (4) Las VLP quiméricas L1:P18I10 y L1:T20 podrían provocar VPH pero anticuerpos de unión débiles específicos de VIH-1-en ratones BALB/c. Además, la inserción de los péptidos VIH-1 P18I10 o T20 en la proteína HPV16 L1 no afectó la inducción de anticuerpos específicos de HPV16 L1-in vivo; (5) Las VLP L1:P18I10 podrían inducir respuestas de células T específicas tanto del VPH16 como del VIH-1-; (6) La estimulación BCG.HIVA y el refuerzo de VLP L1:P18I10 provocaron la mayor magnitud de esplenocitos productores de IFN en comparación con el refuerzo de VLP homólogo de L1:P18I10 en ratones BALB/c. Estos hallazgos respaldaron un mayor desarrollo de vacunas contra el VIH-1 basadas en rBCG y VPH quimérico: VLP del VIH. Considerándolo todo, este estudio proporciona una estrategia de referencia que puede ser valiosa para apoyar los esfuerzos globales para desarrollar nuevas vacunas quiméricas basadas en VLP para controlar las infecciones por VPH y VIH.

En este estudio, las VLP L1:P18I10 y L1:T20 podrían inducir el mismo nivel de anticuerpos de unión a L1 anti-VPH16 que la vacuna VPH Gardasil-9. Sin embargo, las VLP L1:P18I10 y L1:T20 solo provocan niveles bajos de respuestas de anticuerpos de unión al VIH específicos de los epítopos P18I10 y T20. Nuestra hipótesis fue que esto podría deberse a que las placas de ensayo ELISA estaban recubiertas con la proteína L1 del VPH16 recombinante, el péptido P18I10 del VIH-1 y el péptido T20 del VIH-1, respectivamente. Los anticuerpos murinos anti-L1 inducidos por nuestras VLP L1:P18I10 y L1:T20 podrían apuntar a múltiples epítopos de unión de la proteína L1. Por el contrario, los anticuerpos murinos anti-VIH-1 provocados por nuestras VLP L1:P18I10 y L1:T20 solo se dirigen a un único péptido del VIH (P18I10 o T20) en las VLP del VPH:VIH. En consecuencia, los valores máximos generales de DO450 de los anticuerpos de unión anti-VIH-1 fueron mucho más bajos que los de los anticuerpos anti-VPH16 L1.

La razón por la que seleccionamos el bucle DE de la proteína de la cápside L1 del VPH16 como región de inserción preliminar del inmunógeno del VIH-1 se refiere a un estudio previo que inmunizó ratones con el virus del papiloma bovino (BPV): VLP del VIH para inducir respuestas de anticuerpos [20]. Se sabe que los epítopos ubicados dentro de los bucles DE y FG expuestos a la superficie de las proteínas principales de la cápside L1 del VPH contribuyen de manera dominante a los anticuerpos de neutralización cruzada inducidos por la vacuna [67]. Además, estudios previos han demostrado que la inserción de VIH-1 MPER en el bucle BPV L1 DE podría inducir anticuerpos parcialmente neutralizantes que reconocen específicamente la conformación nativa de MPER en VIH-1 Env [20]. Sin embargo, ningún dato ha demostrado si el BPV L1:MPER VLP recombinante afecta la inmunogenicidad y la neutralización contra BPV después de la inserción de VIH-1 MPER en la proteína BPV L1. En nuestro estudio utilizando VLP L1 de HPV16 como vector de administración de antígeno del VIH, hemos observado que la inserción del péptido VIH-1 no ha modificado la estructura L1 del VPH y que las proteínas quiméricas VPH:VIH aún mantienen la capacidad de formar VLP. Además, llevamos a cabo el concepto de inmunopuente para demostrar respuestas inmunitarias comparables entre una vacuna candidata a VLP de VPH: VIH (la nuestra) y una vacuna contra el VPH basada en VLP aprobada (con licencia Gardasil-9). Nuestros datos revelaron que la inserción del péptido VIH-1 P18I10 o T20 en VPH quimérico: VLP de VIH podría provocar un título similar de anticuerpos de unión específicos de HPV16 L1-, en comparación con el VPH Gardasil-9 vacuna. Los anticuerpos de unión a L1 anti-HPV16 específicos del tipo observados con la vacuna HPV Gardasil-9 VLP autorizada en comparación con las versiones quiméricas de la vacuna HPV Gardasil-9 VLP coincidieron con nuestros datos.

La longitud y el sitio del antígeno extraño VIH-1 óptimo incorporado en las VLP L1 del VPH16 y la estabilidad in vitro de las VLP quiméricas VPH:VIH resultantes deben verificarse antes de la inmunización de los ratones. Nuestro estudio actual ha demostrado que la inserción de péptidos P18I10 o T20 en la proteína L1 del VPH16 no afectó la estabilidad, el autoensamblaje y la morfología in vitro de las VLP quiméricas del VPH:VIH. Estos resultados concordaron con estudios previos que indicaban que la inserción del dominio MPER del VIH-1 en la secuencia del bucle DE de BPV L1 no influyó en la capacidad de autoensamblaje de la proteína de la cápside de BPV L1 en VLP [20]. Básicamente, los epítopos ubicados dentro de los bucles DE y FG expuestos a la superficie de las proteínas de la cápside L1 del VPH contribuyen de manera dominante a inducir anticuerpos de neutralización cruzada específicos de L1- [67]. Aquí, demostramos que la inserción de péptidos VIH-1 P18I10 o T20 en el bucle DE L1 de HPV16 no afectó la inducción de anticuerpos específicos de L1-por VLP quiméricas de VPH:VIH después de la inmunización de ratones. Además, los epítopos VIH-1 P18I10 o T20 en bucles DE HPV16 de VLP quiméricas de VPH:VIH se detectaron in vitro y fueron inmunogénicos in vivo. Las VLP L1 del VPH16 constituyen un soporte potencial para la visualización en superficie del epítopo del VIH-1 de interés. En este estudio, hemos realizado ELISA indirecto para demostrar los péptidos conformacionales P18I10 y T20 presentados en la superficie de nuestras VLP quiméricas de VPH: VIH. En el futuro, la microscopía inmunoelectrónica también podría ser un enfoque adicional para demostrar la localización y organización estructural del antígeno P18I10 o T20 dentro de las VLP del VPH: VIH.

El autoensamblaje es un índice representativo de la estabilidad in vitro de las VLP L1 del VPH16. Se sabe que el pH, la fuerza iónica, la temperatura [52] y el entorno redox se correlacionan con los enlaces disulfuro de las proteínas de la cápside L1 del VPH16 [53]. Los trabajos anteriores sobre las VLP del virus del papiloma sugirieron la importancia de los enlaces disulfuro para el autoensamblaje de la cápside principal L1 [68,69]. La formación de disulfuro indicó una mayor cisteína de la proteína de la cápside L1 en una geometría apropiada [53]. Estos enlaces cruzados de disulfuro conectan los residuos 175 y 428 (para HPV16) que estabilizan los viriones y VLP del HPV [70]. En este estudio, analizamos los patrones de entrecruzamiento de disulfuros intermoleculares como evidencia indirecta para demostrar que nuestras proteínas de la cápside L1:P18I10 y L1:T20 tienden a autoensamblarse in vitro. En la Figura 3A, demostramos que las VLP L1:P18I10 y L1:T20 purificadas presentaban patrones de entrecruzamiento de disulfuro intermolecular similares a las VLP L1 de HPV16 bajo el mismo pH, fuerza iónica y condiciones térmicas. En la Figura 3B, demostramos además que las proteínas L1:P18I10 y L1:T20 purificadas eran capaces de autoensamblarse en partículas más grandes (más grandes que el pentámero L1 MW 280 kDa) in vitro. Por lo tanto, junto con el patrón morfológico de VLP de autoensamblaje (aunque la estructura icosaédrica no era del todo buena) observado en la Figura 4, concluimos que nuestras VLP quiméricas purificadas de VPH: VIH son estables in vitro. Además de la estabilidad de las VLP, se deben considerar muchos otros factores críticos que podrían afectar la inmunogenicidad del VPH quimérico: las VLP del VIH, como el sitio de inserción del inmunógeno entre los diferentes bucles de las VLP [71], la dosis, los intervalos de cebado-refuerzo y la vía de administración [22]. , etc.

Los péptidos P18I10 derivados del bucle VIH-1gp120 V3 se presentan en células infectadas por VIH mediante moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC-I) [26]. Los CD8+, linfocitos T citotóxicos (CTL), podrían reconocer antígenos P18I10 restringidos por MHC-I y secretar una variedad de citocinas, como IFN-, para eliminar las células infectadas por el VIH [72–75]. El ADN viral o plasmídico recombinante son buenos vehículos de vacunas para expresar los péptidos P18I10 en las células huésped e inducir respuestas celulares específicas de P18I10-a través de la vía MHC-I [76–79]. Por ejemplo, un régimen combinado de preparación de ADN y refuerzo del virus vaccinia modificado Ankara (MVA) fue suficiente para la inducción de respuestas de IFN y CTL contra el epítopo P18I10 [79]. Por el contrario, los péptidos P18I10 exógenos no se presentan eficientemente a las células T CD8+ mediante la vía MHC-I [80,81] y requieren la participación de adyuvantes apropiados [82–85] o portadores de antígenos, como VLP. Por ejemplo, la inmunogenicidad de los péptidos P18I10 sintéticos suplementados con adyuvantes fue marginal debido a la ausencia de determinantes T auxiliares [82–85]. Se ha informado anteriormente que las VLP del VIH-1 Gag [86], las VLP del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) [87], las VLP del parvovirus VP2 [88] y las VLP del papilomavirus L1 [17-19] podrían actuar como vectores de administración para la presentación de epítopos de CTL restringidos por MHC-I in vivo. Aunque el mecanismo de las respuestas de células T restringidas por MHC-I inducidas por VLP aún no está claro, la estructura particulada de las VLP podría beneficiar la captación endocítica de macrófagos o células dendríticas, accediendo así al citosol y posteriormente entrando en la vía típica de MHC-I [89, 90]. Además, se observó que el determinante P18I10 restringido a MHC-I induce respuestas de células T auxiliares CD4+ a través de una vía de MHC-II [91,92]. Las VLP híbridas de BPV1 L1 se pueden utilizar como portadores de epítopos antigénicos para provocar respuestas terapéuticas de CTL específicas de virus a través de las vías MHC-I y MHC-II [17,19], lo que proporciona una estrategia prometedora para el diseño de vacunas para controlar la infección viral. Algunos estudios iniciales también indicaron VLP de BPV L1 que expresan el epítopo E7 de HPV16 o el epítopo P18I10 de superficies mucosas inducidas por bucle gp120 V3 del VIH-1 y también inmunidad humoral y de células T específica del epítopo de VLP sistémicas [18]. De acuerdo con estudios previos, hemos demostrado preliminarmente que nuestras VLP quiméricas de VPH: VIH (L1:P18I10) podrían inducir respuestas inmunes de células T específicas del VIH en ratones BALB/c después de la estimulación de esplenocitos con el péptido P18I10. Además, la preparación con BCG.HIVA mejoró las respuestas inmunitarias de las células T específicas del VIH en ratones. Sin embargo, las respuestas inmunes multifuncionales de células T inducidas por las VLP L1:P18I10 necesitarían más estudios inmunológicos.

Las respuestas más amplias de las células T CD8+ contra múltiples epítopos CTL conservados son beneficiosas para superar la diversidad genética del VIH-1 y escapar [7,93–100]. El diseño racional de inmunógenos de células T del VIH-1, como el VIHA, debería tener el potencial de responder a múltiples epítopos de CTL [34]. El inmunógeno VIH-1 VIHA, diseñado por el Dr. Tomas Hanke, está compuesto por la proteína Gag VIH-1 de longitud completa combinada con múltiples epítopos CTL, incluidos los epítopos P18I10 en el extremo C terminal [34]. El ADN, MVA y rBCG se seleccionaron como vehículos de administración de inmunógeno VIHA e indujeron una alta magnitud y amplitud de respuestas celulares específicas de epítopos de CTL mediante el uso de regímenes heterólogos de refuerzo-cebado en modelos de ratón y primate no humano (NHP) [34,101]. Nuestros estudios anteriores han demostrado que la preparación de BCG.HIVA en combinación con el refuerzo de MVA.HIVA provocó células T CD8+ productoras de IFN específicas del VIH-1-en ratones BALB/c [31–33,102]. Curiosamente, las VLP podrían ser un refuerzo potencial para aumentar las respuestas celulares específicas del VIH en la inmunización heteróloga con rBCG [29,30] o vacunas de ADN [103,104]. Por ejemplo, rBCG que expresa la proteína Gag del VIH-1 podría preparar eficazmente el sistema inmunológico de células T para un refuerzo con VLP de Gag en modelos NHP [29,30]. En el estudio actual, hemos demostrado que la preparación con BCG.HIVA podría estimular las respuestas inmunitarias de las células T inducidas por las VLP del VPH: VIH (L1:P18I10). Investigaremos más a fondo la magnitud de las respuestas polifuncionales de las células T CD4+, CD8+ y de memoria generadas por este régimen de estimulación de rBCG y VLP.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Actualmente, nuestro grupo de investigación se centra en el desarrollo de rBCG prometedores: vacunas contra el VIH que expresan nuevos inmunógenos de células T del VIH-1, como tHIVconsvX y VIHACAT (HTI), inmunógeno de células T, para mejorar el VIH-1 coincidencia de variantes y amplitud de respuesta de células T. Los inmunógenos VIHconsvX de segunda generación se diseñaron redefiniendo las regiones conservadas del grupo M y utilizando un diseño de mosaico bivalente para maximizar la coincidencia de los posibles epítopos de células T 9-mer en la vacuna con las variantes globales [64]. El inmunógeno HTI se diseñó para cubrir objetivos de células T contra los cuales se observan predominantemente respuestas de células T en personas infectadas por VIH-1-con cargas virales de VIH-1 bajas [65,66]. Debido a que se ha demostrado que las VLP de papiloma son portadoras de múltiples epítopos de CTL [17], nuestro objetivo fue construir VLP quiméricas de L1 de VPH16 que porten múltiples epítopos de CTL de VIH-1 conservados en combinación con rBCG que exprese inmunógenos de células T ThivconsvX o HTI para inducir una respuesta más amplia. Respuestas inmunes de CTL contra el VIH-1. La alta densidad y las múltiples copias del epítopo CTL del VIH-1 presentado en el VPH quimérico: las VLP del VIH podrían mejorar la entrega de antígeno al sistema inmunológico e inducir una mayor frecuencia de respuestas de CTL. Por el contrario, es más probable que el BCG recombinante genere una menor frecuencia de respuestas de CTL debido a la lenta replicación in vivo. Debido a que BCG tiene una clara influencia en la diferenciación de las células T, lo que significa que BCG puede inducir la memoria de las células T CD8+ mediante la participación de las células T auxiliares CD4+ [105], esta propiedad inmunogénica podría hacer que BCG sea adecuado como agente de preparación en regímenes heterólogos de preparación y refuerzo. Por lo tanto, esperábamos que nuestras VLP de VPH: VIH pudieran parecer un refuerzo prometedor para aumentar la magnitud y amplitud de las respuestas de CTL del VIH-1 cuando se preparan con un BCG recombinante que expresa un nuevo inmunógeno de células T del VIH-1. .

El péptido T20 contiene un epítopo lineal altamente conservado 2F5 (ELDKWA). Se informó que el anticuerpo 2F5 recolectado de pacientes con infección por VIH a largo plazo tenía una eficacia ampliamente neutralizante [106,107]. Se considera que el MPER de gp41 es poco inmunogénico, quizás relacionado con su ubicación cerca de la bicapa de fosfolípidos celular y viral [108]. El uso de vectores de ADN que presentan MPER en un entorno lipídico es beneficioso para inducir nAb específicos de gp41- [109-111]. Por ejemplo, se ha demostrado que las vacunas de ADN que codifican VIH-1 T20-, diseñadas por la Dra. Britta Wahren, inducen respuestas de anticuerpos neutralizantes (nAb) entre clados [109]. Por el contrario, muchos de los primeros intentos de inducir nAb dirigidos a gp41 mediante el uso de estrategias de vacunas peptídicas o de subunidades han fracasado [112-116]. Recientemente, algunos estudios indicaron que las VLP de BPV L1 que expresan el epítopo 2F5 o MPER de VIH-1gp41 indujeron anticuerpos específicos 2F5-en ratones dieron como resultado una neutralización entre clados [20,21]. Se encontró un patrón de inmunogenicidad similar cuando el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) se fusionó con el epítopo F5 del VIH-1 2o MPER [59,117–119]. Aquí, demostramos que la presentación del péptido VIH-1 T20 y P18I10 en nuestra VLP quimérica HPV16 L1 podría inducir respuestas de anticuerpos contra el VIH-1 y HPV16. Los epítopos neutralizantes estabilizados en una estructura conformacional, como los picos funcionales o VLP del VIH-1, podrían ser la corriente principal del diseño de inmunógenos de células B para lograr anticuerpos neutralizantes amplios (bnAb) [93]. Sin embargo, la mayoría de los nuevos epítopos de bnAb (aproximadamente el 90%) son regiones no continuas y constituidas reunidas en 3-configuraciones dimensionales [120]. Aunque la presentación de epítopos discontinuos en una estructura proteica podría predecirse mediante modelos computacionales [121], se podría desafiar que estos epítopos bnAb se incrusten en una estructura proteica L1 de VPH16 sin envoltura. Por el contrario, una minoría de inmunógenos de células B del VIH-1, como MPER (2F5) de la gp41 del VIH-1 o el bucle V3 (P18IIB) de la gp120, contienen epítopos neutralizantes lineales y podrían ser adecuados para la VPH: columna vertebral de la proteína del VIH. Por lo tanto, seleccionamos el epítopo neutralizante lineal 2F5 que se incluye en un péptido T20 extendido de VIH-1 MPER en términos de estructura favorable para la formación de hélice [122]. Los péptidos T20 podrían fusionarse y estabilizarse en estructuras de cápside L1 para provocar respuestas de anticuerpos neutralizantes si pudiera presentarse la configuración nativa del epítopo 2F5. En este estudio, encontramos que los nAb 2F5 se unían a VLP quiméricas de VPH: VIH (L1:T20) in vitro. Además, las VLP L1:T20 también pueden inducir anticuerpos de unión específicos de T20-en ratones BALB/c. Había cada vez más pruebas de que los anticuerpos inducidos por el péptido inhibidor de la fusión (T20) del VIH-1 tienen propiedades similares al péptido de fusión anti-VIH-1 enfuvirtida para unirse al residuo hidrofóbico transmembrana T20 ubicado en MPER de gp41 durante fusión del VIH-1 y contribuir al control viral [109,123,124]. Según nuestras revisiones anteriores, el diseño racional de vacunas quiméricas basadas en VLP para inducir respuestas de CTL y anticuerpos neutralizantes específicos del VPH y el VIH siempre debería considerarse en términos de selección de inmunógenos, vectores de administración de antígenos y regímenes de refuerzo. En conclusión, este estudio ha mostrado una plataforma de expresión alternativa basada en células de mamíferos y un método de purificación cromatográfica escalable para diseñar VLP quiméricas de VPH:VIH. Consideramos que nuestros nuevos métodos de purificación ayudarán a recuperar VLP antigénicas del VPH: VIH a partir de células de mamíferos con el objetivo de reducir tiempo, costos y mano de obra y al mismo tiempo aumentar la capacidad de producción industrial. Además, demostramos que las VLP L1 del VPH16 pueden funcionar como plataforma de entrega para transportar el antígeno peptídico del VIH-1 porque la inserción de los péptidos P18I10 o T20 en el bucle DE de las proteínas de la cápside L1 del VPH16 no afectó la estabilidad in vitro, el autoensamblaje y la morfología del VPH quimérico: las VLP del VIH y sí lo hicieron. no interfiere con la inducción de anticuerpos específicos de HPV16 L1-in vivo. Por otro lado, las VLP quiméricas de VPH: VIH podrían provocar respuestas inmunes de células B y T específicas del VPH16 y del VIH contra ambos virus. Este informe exploró la posibilidad de desarrollar vacunas contra el VIH-1 basadas en BCG recombinante que expresa inmunógenos del VIH-1 y VPH: VLP del VIH, que pueden usarse para la inmunización infantil contra el VIH-1. Dado que el desarrollo de una vacuna quimérica eficaz contra el VPH16 y el VIH-1 sigue siendo un desafío, este trabajo contribuye un paso hacia el desarrollo de la nueva plataforma de vacuna quimérica basada en VPH: VLP del VIH para controlar el VPH16 y el VIH{{118 }} infección, que se necesita con urgencia en los países en desarrollo e industrializados.

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