El ARN circular CircDVL1 inhibe la progresión del carcinoma de células renales de células claras a través del eje MiR-412-3p/PCDH7

Abstracto

El carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) es un cáncer de riñón primario con un fenotipo altamente agresivo y un pronóstico extremadamente pobre. La evidencia acumulada sugiere que los ARN circulares (circRNA) desempeñan un papel fundamental en la aparición y el desarrollo de varios cánceres humanos. Sin embargo, la expresión, la importancia clínica y el papel regulador de los circRNA en ccRCC siguen sin estar claros. Aquí informamos que circDVL1 se reduce en los sueros y tejidos de pacientes con ccRCC y se correlaciona negativamente con las características malignas de ccRCC. La sobreexpresión de circDVL1 inhibe la proliferación, induce la detención de G1/S, desencadena la apoptosis y reduce la migración y la invasión en diferentes células ccRCC in vitro. En consecuencia, la sobreexpresión de circDVL1 suprime la tumorigenicidad de ccRCC en un modelo de xenoinjerto de ratón. Mecanísticamente, circDVL1 sirve como una esponja para miR-412-3p oncogénico, lo que evita la represión mediada por miR-412-3p de su objetivo protocadherina 7 (PCDH7) en células ccRCC. En conjunto, nuestros resultados demuestran que circDVL1 ejerce una función supresora de tumores durante la progresión de ccRCC a través del eje circDVL1/miR-412-3p/PCDH7, y sugiere que circDVL1 podría ser un nuevo marcador de diagnóstico y pronóstico y un objetivo terapéutico para ccRCC.

Palabras clave

circDVL1; Carcinoma de células renales; miR-412-3p; PCDH7; biomarcador

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Introducción

El carcinoma de células renales (CCR) es un carcinoma maligno extremadamente letal del sistema urológico y afecta gravemente a la salud humana [1]. La incidencia de CCR ha aumentado en las últimas décadas, con 73 750 casos nuevos diagnosticados en los Estados Unidos en 2020 [2, 3]. El RCC de células claras (ccRCC), el subtipo más común y agresivo de RCC, representa el 70-75 por ciento de los casos de RCC [4]. Es importante destacar que más del 30 por ciento de los pacientes con ccRCC están asociados con metástasis en el diagnóstico inicial. Además, aunque la cirugía radical es la principal opción de tratamiento para el ccRCC primario, alrededor del 40 % de los pacientes experimentaron recaídas y metástasis con una supervivencia general de 5-años inferior al 10 % [5, 6]. Estos dilemas subrayan la necesidad urgente de explorar los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de ccRCC, tanto como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico como como posibles dianas terapéuticas.

Los ARN circulares (circRNA) son ARN no codificantes con estructuras de circuito cerrado de cadena única que los hacen altamente estables [7, 8]. Estudios recientes han demostrado que los circRNA abundan en la sangre [9, 10], la saliva [11] y los exosomas [12], lo que indica que podrían servir como nuevos biomarcadores de diagnóstico [13]. Dado que la biopsia líquida es menos invasiva que la biopsia de tejido tradicional [14], los circRNA se han considerado valiosas herramientas predictivas para la medicina de precisión [15-17]. Específicamente, varios circRNA, como cricNOX4, circEGLN3 y circPRRC2A, pueden actuar como biomarcadores potenciales para el diagnóstico y/o pronóstico de RCC, que se han resumido en nuestra revisión reciente [18]. Además, la investigación actual se centra principalmente en la alternancia de la expresión de circRNA en tejidos ccRCC [19, 20]; sin embargo, sus niveles en biopsia líquida siguen siendo en gran parte desconocidos, lo que dificulta la exploración de posibles biomarcadores. Además, aunque se ha demostrado que varios circRNA, incluidos circHIAT1 [21], circ-AKT3 [22] y cRAPGEF5 [23], desempeñan funciones importantes en el inicio y la progresión de ccRCC [18], la investigación sistemática de los circRNA implicados en ccRCC todavía falta desarrollo, así como sus mecanismos moleculares subyacentes.

Aquí, primero determinamos la expresión de circRNA en muestras de suero de pacientes con ccRCC y controles sanos utilizando una micromatriz de circRNA. Significativamente, identificamos un nuevo circRNA circDVL1 asociado con ccRCC (ID de canal: hsa_circ_ 0009267), que está codificado en el gen DVL1. CircDVL1 está significativamente reducido en el suero de pacientes con ccRCC, y su expresión está inversamente correlacionada con la clasificación de ccRCC Fuhrman, lo que sugiere el potencial como biomarcador. Además, CircDVL1 está disminuido en tejidos tumorales ccRCC. En consecuencia, circDVL1 puede inhibir la proliferación, inducir la detención del ciclo celular, desencadenar la apoptosis y reducir la migración e invasión de células ccRCC. Mecánicamente, circDVL1 funciona como una esponja miR-412-3p para regular al alza la expresión de PCDH7. En conjunto, estos hallazgos identifican a circDVL1 como un supresor de tumores para ccRCC y sugieren su potencial como biomarcador de diagnóstico y diana terapéutica.

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Materiales y métodos

1. Muestras clínicas

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Zhejiang (2021-104). Dieciocho muestras emparejadas de ccRCC y tejidos no tumorales adyacentes se recolectaron de pacientes con ccRCC. Las muestras se conservaron rápidamente en nitrógeno líquido después de la cirugía y luego se almacenaron a -80 grados hasta su uso posterior. Se recogieron muestras de suero de 60 pacientes con ccRCC y 66 controles sanos. Luego, las muestras se procesaron utilizando métodos apropiados y el suero obtenido se almacenó a -80 grados hasta su uso posterior.

2. Líneas celulares y cultivo celular

Todas las líneas celulares se adquirieron de la Colección Nacional de Cultivos Celulares Autenticados (China). Las células 786-O y Caki-1 se cultivaron en RPMI 1640 (HyClone), las células ACHN se cultivaron en MEM (HyClone) y las células 293T se cultivaron en medio DMEM (Gibco). Todos los medios de cultivo celular se complementaron con suero bovino fetal al 10 por ciento (Gibco) y una mezcla de penicilina y estreptomicina al 1 por ciento (Gibco). Los cultivos celulares se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 grados y 5 por ciento de CO₂.

3. Análisis de microarrays CircRNA

El perfil de microarray CircRNA en muestras de suero se realizó utilizando un Arraystar humano CircRNA Array V2 (Capital Biotechnology, China). Se utilizó el software GeneSpring V13.0 (Agilent Technologies) para el resumen de datos, la normalización y el control de calidad de los microarrays. Los CircRNA con un umbral del cambio de pliegue mayor o igual a 2 y menor o igual a -2 y valor P <0.05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis de conglomerados jerárquicos se realizó utilizando la distancia euclidiana estandarizada con vinculación completa.

4. Secuenciación de ARN (RNA-seq) y análisis de datos

El RNA-seq de próxima generación se llevó a cabo como se detalló anteriormente [24, 25]. Se usaron miR-412-3p y células 786-0 transfectadas con imitación de control para la secuenciación del ARN. Novogene Co., Ltd. (Beijing, China) llevó a cabo la construcción de bibliotecas y los análisis bioinformáticos de los datos sin procesar. Los datos de RNA-seq se depositaron en Gene Expression Omnibus (GEO) con el número de acceso GSE175492.

5. Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)

RT-qPCR se realizó como se describió anteriormente [26, 27]. El ARN total se aisló del suero, las células y los tejidos tumorales utilizando el reactivo AG RNAex Pro (AG, Hunan, China). Para la detección de circRNA, se digirió 1 ug de RNA total con RNase R (3 U/ug, Epicenter Technologies, Madison, EE. Kit de síntesis de ADNc de cadena (Vazyme). Los niveles de expresión de CircRNA y mRNA se normalizaron a -actina. Para determinar la expresión de miARN, se llevó a cabo la transcripción inversa con un kit de síntesis de primera cadena de miARN miR-XTM (Takara Bio USA, CA, EE. UU., Cat. #638313) con expresión de U6 (Rnu6–1) como control endógeno. El nivel relativo de expresión de ARN se determinó con el método 2-ΔΔCt. Todas las secuencias de cebadores de análisis de qRT-PCR se muestran en la Tabla S2.

6. Construcción de plásmidos y transfección estable.

Para construir el vector de sobreexpresión circDVL1 y circDVL1-MUT, la secuencia circDVL1 y circDVL1 mutada se clonaron en el vector pcDNA 3.1( plus ) Laccase 2 MCS Exon, que se solicitó a Addgene (#69893) [28]. Las células ACHN y 786-O se transfectaron con circRNA y vectores de control negativo utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 48 h, se seleccionaron células transfectadas de forma estable que expresaban circDVL1 mediante la adición de 800 ug/ml de G418 al medio de cultivo.

7. Viabilidad celular

El ensayo de viabilidad celular se determinó con el kit CCK8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan, Cat# CK04), como se describió anteriormente [29]. Se sembraron células de control y de sobreexpresión de 786-O y ACHN circDVL1 en 96-placas de pocillos. Se añadió solución de CCK8 (10 μL) en el tiempo indicado y se incubó a 37 grados durante 2 h, y se midió la absorbancia usando un espectrofotómetro.

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8. Formación de colonias

Los ensayos de formación de colonias se realizaron como se describe anteriormente [24]. Se cultivaron ACHN (800 células/pocillo) y 786-células O (400 células/pocillo) durante 10 días y posteriormente se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante aproximadamente 30 min, seguido de tinción con 0,1 % solución de cristal violeta durante aproximadamente 15 min. Los clones que contenían más de 50 células se contaron como una sola colonia.

9. Análisis del ciclo celular

Las células se sincronizaron en medio RPMI 1640 sin FBS durante la noche y se cambiaron a medio con FBS al 10 % durante las siguientes 48 h. Las células se lavaron, se volvieron a suspender en etanol al 70 por ciento en PBS y se almacenaron a -20 grados durante la noche. A continuación, las células se tiñeron con una solución de yoduro de propidio (PI) que contenía RNasa A para el análisis del ciclo celular.

10. Análisis de apoptosis

El análisis de apoptosis de células ACHN y 786-O se realizó con un kit de detección de apoptosis de anexina V-FITC/PI (Beijing Biosea Biotechnology, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.

11. Ensayos de invasión y migración celular

In vitro, la capacidad de migración celular se evaluó utilizando cámaras transwell con membranas de policarbonato de poro 8 μm (Millipore, MA, EE. UU.). Los ensayos de invasión celular se realizaron con las cámaras Transwell recubiertas con 100 μL de Matrigel (BD Biosciences, EE. UU.). 786-Células O (2 × 104) o células ACHN (4 × 104) se suspendieron en 200 μL de RPMI 1640 sin suero y se sembraron en las cámaras transwell superiores, y luego se agregaron 600 μL de medio que contenía 20 % de FBS en las cámaras inferiores. Luego, las células se cultivaron durante 24 h para medir la migración y durante 48 h para evaluar la invasión. Las células de la cámara superior se rasparon cuidadosamente y las células del compartimento inferior se fijaron con paraformaldehído al 4 por ciento y se tiñeron con cristal violeta. Se obtuvieron imágenes y se contaron las células con un microscopio.

12. Transferencia de Western

La proteína total se extrajo, cuantificó y separó en geles SDS-PAGE al 10 % y luego se transfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore, MA, EE. UU.), que se incubaron con antigliceraldehído primario 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (Proteinch, 60004-1-Ig), anticuerpos primarios anti-PCDH7 (Abcam, ab139274) a 4 grados durante la noche.

13. tinción de inmunofluorescencia

Las células se sembraron en cubreobjetos durante 24 hy se fijaron con paraformaldehído al 4 %, se permeabilizaron con 0,2 % Triton X-100 durante 20 min y se incubaron con albúmina sérica bovina al 5 %. A continuación, las células se incubaron con un anticuerpo primario específico para Ki67 (1:400, ab48027, Abcam) a 4 grados durante la noche y, posteriormente, se incubaron con una IgG anti-conejo de cabra 488-conjugada (1:150, D110088, Sangon ) a 37 grados durante 1 h. Las células se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), y las imágenes se obtuvieron con un microscopio de fluorescencia Leica (DM4000).

14. Formación de tumores in vivo y tinción Ki67

Se dividieron ratones desnudos BALB/c macho de seis semanas de edad (adquiridos en Shanghai SLAC) en 2 grupos (n=5 para cada grupo). Se inocularon ratones con aproximadamente 3 x 106 células de control o células ACHN que sobreexpresan circDVL1 mediante inyección subcutánea. El tamaño del tumor se midió con un calibre deslizante cada 3 días, comenzando el día 6 después de la inyección. El volumen del tumor se calculó como largo × ancho × alto/2. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las Pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio (publicación NIH 80-23, revisada en 1996) y fueron aprobados por el Comité de cuidado de animales de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China.

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15. Hibridación fluorescente in situ (FISH)

Se sintetizó una sonda circDVL1 de doble digoxigenina (DIG)-peroxidasa de rábano picante (HRP) (Exon Biotechnology, Guangzhou, China). Se cultivaron células ACHN de control y que sobreexpresaban circDVL1 en portaobjetos y se incubaron con la sonda marcada a 37 grados durante 24 h. Después del lavado, los portaobjetos se incubaron en un anticuerpo secundario anti-DIG a 37 grados durante 1 h. Se usó un método de amplificación de señal de tiramina para detectar señales de circDVL1, y las células se contratiñeron con DAPI. Para co-FISH, los portaobjetos se incubaron con circDVL1 marcado con DIG y miR-412-3p marcado con biotina.

16. Ensayo de inmunoprecipitación de ARN (RIP)

Los ensayos RIP se realizaron con el kit de inmunoprecipitación de proteínas de unión a ARN Magna RIP™ (Millipore, MA, EE. UU.). 786-Las células O se lisaron en tampón de lisis RIP completo y luego se incubaron con tampón de inmunoprecipitación que contenía perlas magnéticas que se conjugaron con AGO2 (Abcam, MA, EE. UU.) o complejo de anticuerpos IgG a 4 grados durante la noche. Luego, los ARN inmunoprecipitados se analizaron mediante RT-qPCR.

17. Ensayo de reportero de luciferasa dual

Las secuencias CircDVL1, PPM1H-3'UTR y PCDH7-3'UTR, que contenían sitios de unión miR-412-3p mutados y sus correspondientes secuencias mutadas, se sintetizaron y luego se subclonaron en el indicador de luciferasa vector psiCHECK-2 (Promega) para producir circDVL1-WT, circDVL1-Mut1, circDVL1-Mut2, PPM1H-3'UTR-WT, PCDH{ Vectores {14}}'UTRWT, PCDH7-3'UTR-Mut1 y PCDH7-3'UTR-Mut2. Las diferentes secuencias 3'UTR de PPM1H y PCDH7 contienen el fragmento de 500 pb que contiene sitios potenciales de unión a miR-412-3p (flanqueado por 250 pb). La actividad relativa de la luciferasa se evaluó con un ensayo indicador de doble luciferasa (Promega, EE. UU.). Todos los ensayos se llevaron a cabo en tres réplicas independientes.

18. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Las diferencias entre los grupos se evaluaron con pruebas t de Student o análisis de varianza de una vía (ANOVA). Se consideró que las diferencias entre los grupos eran estadísticamente significativas cuando los valores de p eran < 0,05.

Discusión

Se han propuesto y evaluado experimentalmente diferentes tipos de biomarcadores ccRCC, incluidos mRNA [32], miRNA [33], lncRNA [34] y circRNA [35]. Sin embargo, ninguno de ellos ha sido confirmado como biomarcador de diagnóstico preciso para uso clínico de rutina en pacientes con ccRCC. Aquí, nuestro estudio ilustró que circDVL1 juega un papel importante en la progresión de ccRCC. En primer lugar, analizamos el suero de pacientes con ccRCC y controles sanos para identificar los circRNA expresados ​​diferencialmente utilizando una micromatriz de circRNA. Los datos de RT-qPCR revelaron que circDVL1 se reguló drásticamente a la baja en las muestras de ccRCC. Estudios previos han demostrado que los circRNA podrían servir como biomarcadores séricos latentes en diferentes tipos de cáncer [36, 37]. Por ejemplo, Bei et al. demostró que exosomal has-circ -0004771 se incrementó en el suero recogido de pacientes con cáncer colorrectal [38]. Sin embargo, la investigación sobre el papel específico de circRNA como biomarcador no invasivo en ccRCC aún es limitada. Nuestro estudio reveló que circDVL1 estaba significativamente regulado a la baja en el suero de pacientes con ccRCC y que la disminución de la expresión de circDVL1 en suero puede derivarse de un tumor. Además, el nivel sérico de circDVL1 tuvo un valor de diagnóstico significativo para discriminar entre pacientes con tumores de grado I-II de Fuhrman y de grado III-IV de Fuhrman. Por lo tanto, el suero circDVL1 podría ser un marcador de diagnóstico prometedor para ccRCC. Sin embargo, varios pacientes sanos mostraron niveles bajos de circDVL1 en su suero, lo que indica que la monitorización del paciente basada únicamente en el análisis de este ARN circulante podría dar lugar a resultados falsos positivos. Por lo tanto, el valor de circDVL1 como marcador de diagnóstico único es algo limitado y es posible que sea necesario analizar una combinación de diferentes ARN circulantes para obtener una predicción confiable del desarrollo tumoral y la metástasis.

Como circRNA recién identificado, no se había investigado el papel biológico y patológico de circDVL1. En este estudio, evaluamos el papel y el mecanismo regulador de circDVL1 en ccRCC. Los ensayos funcionales mostraron que circDVL1 sobreexpresado podría disminuir la proliferación de células ccRCC, la capacidad de formación de colonias y el potencial tumorigénico, probablemente debido al aumento de la apoptosis celular in vitro y la supresión del desarrollo tumoral in vivo. Los datos implicaron que circDVL1 podría tener una función supresora de tumores en ccRCC.

Los CircRNA pueden promover la iniciación y progresión tumoral al actuar como esponjas de miRNA. Por lo tanto, examinamos si circDVL1 podría regular la biogénesis de miARN durante la carcinogénesis de ccRCC. Usando el software miRanda y miRWalk, encontramos que circDVL1 tenía un sitio de unión potencial para miR-412-3p. Los ensayos de indicador de luciferasa demostraron un vínculo directo entre circDVL1 y miR-412-3p. Estudios previos han demostrado que miR-412-3p estaba involucrado en la patogénesis de diferentes tipos de cáncer a través de varios mecanismos moleculares [31, 39, 40]. Por ejemplo, miR-412-3p tuvo un papel oncogénico en el cáncer de colon, promoviendo la migración, la invasión y la proliferación celular de las células madre del cáncer [31]. Además, la expresión de miR-412-3p aumentó en vesículas extracelulares de pacientes con carcinoma de células escamosas orales (OSCC) [39]. De manera similar, nuestros resultados sugirieron que miR-412-3p era un importante promotor de tumores en ccRCC.

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Además, también se identificó el objetivo de circDVL1/miR-412-3p. Las protocadherinas (PCDH) son proteínas transmembrana pertenecientes a la superfamilia de las cadherinas, que desempeñan un papel importante en la adhesión celular y las vías de señalización. PCDH7 es un miembro de la familia PCDH y tiene funciones bien establecidas en el reconocimiento de células y la adhesión celular [41]. Se sabe generalmente que la pérdida de adhesión es un paso temprano en la invasión y metástasis de células tumorales. La evidencia emergente sugiere que PCDH7 se expresa de manera aberrante en una variedad de tipos de tumores. Por ejemplo, en el cáncer de pulmón de células no pequeñas en humanos, PCDH7 se sobreexpresaba con frecuencia y funcionaba como un oncogén para inducir la transformación celular y promover la tumorigénesis pulmonar al potenciar la señalización de MAPK [42]. Por el contrario, PCDH7 inhibió la migración y la invasión de células de cáncer gástrico a través de E-cadherina [43]. Además, se ha encontrado una expresión reducida de PCDH7 en cáncer colorrectal [44] y de vejiga [45]. Estos datos indicaron que PCDH7 tenía varias funciones en distintos tipos de tumores. En este estudio, demostramos que los niveles de PCDH7 se redujeron en muestras de tumores ccRCC. Curiosamente, los experimentos de rescate funcional revelaron que las propiedades supresoras de tumores de circDVL1 se deben en parte a su efecto sobre PCDH7. Nuestro estudio sugiere fuertemente la importancia del eje regulador circDVL1/miR-412-3p/ PCDH7 en la progresión de ccRCC.

Este estudio tiene varias limitaciones. Probamos tres siRNA específicos para circDVL1 endógeno, pero desafortunadamente, todos estos siRNA no lograron eliminar circDVL1 probablemente debido a la estructura única de este circRNA, así como a su baja expresión basal en células ccRCC. Además, nuestros resultados mostraron que circDVL1 podría ser un objetivo terapéutico en pacientes con ccRCC, se requieren estudios clínicos con grandes cohortes de pacientes para demostrar aún más su importancia clínica. En nuestro estudio, no investigamos la causa de la regulación a la baja de circDVL1 en las lesiones de ccRCC. Se ha informado que las proteínas de unión a ARN (RBP), incluidas las temblorosas (QKI), la proteína reguladora de empalme epitelial 1 (ESRP1) y las fusionadas en sarcoma (FUS) están involucradas en la formación postranscripcional de circRNA [{{10 }}]. Además, algunos factores de transcripción (p. ej., ZEB1, c-Myb y c-Jun) también están implicados en la biogénesis de circRNA específicos [49-52]. Además, los estudios han demostrado que la modificación de m6A media en la degradación de circRNA. Parque et al. informaron que los circRNA modificados con m6A también se regularon a la baja a través de un eje YTHDF2- HRSP12-RNasa P/MRP [53]. Aún no se sabe si estos RBP, los factores de transcripción y la metilación de m6A están involucrados en la regulación a la baja de circDVL1. En nuestra investigación futura, intentaremos explorar el mecanismo regulador aguas arriba de circDVL1 en el desarrollo y la tumorigénesis de ccRCC.

En resumen, demostramos que el nivel de circDVL1 se redujo en el suero de pacientes con ccRCC. En particular, investigamos más a fondo los mecanismos reguladores de circDVL1 y demostramos que circDVL1 suprimió la tumorigénesis de ccRCC al promover la expresión de PCDH7 mediante la esponja de miR-412-3p. Por lo tanto, nuestro estudio mostró que circDVL1 podría ser un objetivo terapéutico potencial para futuros tratamientos con ccRCC.

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Ying Wang1,2, Yunjing Zhang1,2, Xinwan Su3, Qiongzi Qiu4, Yuan Yuan2, Chunhua Weng2, Sailan Zou5, Yan Tian5, Weidong Han6, Pengyuan Liu4, Xingyi Guo7, Jianhua Mao8, Xianghui Fu5, Ping Wang3, Weiqiang Lin1

1. El Cuarto Hospital Afiliado e Institutos Internacionales de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Jinhua 322000, Zhejiang, China.

2. Centro de Enfermedades Renales, Primer Hospital Afiliado e Instituto de Medicina Traslacional, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou 310003, Zhejiang, China.

3. Departamento de Urología, Primer Hospital Afiliado, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou 310003, Zhejiang, China.

4. Departamento de Medicina Respiratoria, Hospital Sir Run Run Shaw e Instituto de Medicina Traslacional, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou 310016, Zhejiang, China.

5. División de Endocrinología y Metabolismo, Laboratorio Estatal Clave de Bioterapia y Centro de Cáncer, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan y Centro de Innovación Colaborativa de Bioterapia, Chengdu 610041, Sichuan, China.

6. Departamento de Oncología Médica, Hospital Sir Run Run Shaw, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou 310016, Zhejiang, China.

7. División de Epidemiología, Departamento de Medicina, Centro de Epidemiología de Vanderbilt y Centro de Cáncer Vanderbilt-Ingram, Facultad de Medicina de la Universidad de Vanderbilt, Nashville 37203, TN, EE. UU.

8. Departamento de Nefrología, Centro Nacional de Investigación Clínica para la Salud Infantil, Hospital Infantil, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou 310003, Zhejiang, China.