El deserticola de Cistanche mejora la lesión de las células nerviosas del hipocampo en las ratas de la enfermedad de Parkinson mediante la regulación de la ruta antioxidante Keap1/Nrf2/Ho -1

Abstracto:

 

Objetivo explorar el efecto deDeserticola de Cistanche sobre lesión en las células nerviosas en la enfermedad de Parkinson (PD)ratas y su mecanismo relacionado. Métodos Las ratas macho Sprague-Dawley (SD) se dividieron aleatoriamente en tres grupos (1 0 en cada grupo): grupo de control, grupo de modelos y grupo Cistanche. Las ratas en el grupo de modelos y el grupo de tratamiento se inyectaron intracranealmente con 6- hidroxydopamina (6- ohda). Las ratas en el grupo Cistanche recibieron 0.216 g/ ml de solución de Cistanche, las ratas en el grupo en blanco y el grupo modelo recibieron riego salino normal, la cantidad de riego fue 1 ml/ (100g · d) durante dos semanas. La morfología y la ultraestructura de las células nerviosas en el hipocampo fueron observados por manchas de hematoxilina eeosina y microscopía electronshissississississississississississississon. La morfología de los cuerpos de Nishi en la región de Hemimani fue observada por la tinción de Nishi. Los niveles de malondialdehído (MDA) y superóxido dismutasa (SOD) se detectaron mediante el método de ácido tiobarbitúrico y el método de tetrazolio nitroblue. Los cambios de la proteína 1 relacionada con ECH tipo kelch (Keap 1), el factor nuclear E 2- factor 2 (NRF 2) y las proteínas de ciclooxigenasa 1 (Ho {17}}) se analizaron mediante transferencia Western. Resultados Después del tratamiento de la medicación por deserticola de Cistanche, se mejoró la estructura del tejido hipocampal de las ratas PD, se mejoró la morfología de las neuronas, se alivió la piretosis nuclear, se alivió el contenido de la enzima antioxidante SOD en el hipocampo se incrementó gradualmente, mientras que el contenido del producto oxidativo MDA se disminuyó gradualmente y la expresión de la proteín de la proteína de Keap 1 en el hippocustio en el hippocustio. La expresión proteica de NRF 2 y Ho -1 aumentó. Conclusiones Cistanche Deserticola puede mejorar el daño de las neuronas del hipocampo y reducir el nivel de respuesta al estrés oxidativo en el hipocampo de ratas PD. ElEfecto de la desértica de Cistancheen elTratamiento de la EPLas ratas están estrechamente relacionadas con la regulación de la ruta de señalización KEAP -1 /nrf 2 /ho -1.

 

 

 

Cistanche de alta calidad para el tratamiento de la EP

 

Palabras clave: Deserticola de Cistanche;Enfermedad de Parkinson; Estrés oxidativo; hipocampo; neuronas; Keap1; Nrf2; Ho -1

 

Según las estadísticas del Estudio Global de Datos de Enfermedades, las enfermedades neurológicas se han convertido en la principal causa de discapacidad en todo el mundo. En este campo, la enfermedad de Parkinson (EP) se ha convertido en una de las enfermedades de más rápido crecimiento con su significado aumento de prevalencia estandarizado por edad, aumento de los casos de discapacidad y el aumento de la tasa de mortalidad. uno.
De 1990 a 2020, el número de pacientes con EP en todo el mundo aumentó en un 118%, alcanzando 6.2 millones, y la incidencia sigue aumentando año tras año [{5}}]. Los pacientes con EP generalmente presentan síntomas motores como temblor, rigidez muscular, bradicinesia y dificultad de equilibrio en la etapa tardía. Sin embargo, los síntomas no motores, como el deterioro cognitivo, pueden ocurrir en la etapa temprana de la enfermedad. A medida que avanza la enfermedad, el deterioro cognitivo empeorará progresivamente y se volverá más severo.

Cistanche de alta calidad para el tratamiento de la EP

Afectar la calidad de vida de los pacientes [3]. El hipocampo es una organización importante en el cerebro para el aprendizaje espacial y recibir información externa. Es la estructura principal para realizar funciones cognitivas humanas. La disfunción del hipocampo está estrechamente relacionada con el inicio de la disfunción cognitiva en pacientes con EP. El estrés oxidativo está involucrado en el desarrollo de células nerviosas en el tejido del hipocampo. Daño [4-5]. Por lo tanto, si las neuronas del hipocampo están protegidas en pacientes con EP, puede mejorar la cognición del paciente y retrasar la progresión de la enfermedad.
En los últimos años, se ha demostrado que una variedad de medicamentos herbales chinos son efectivos en el tratamiento de enfermedades relacionadas con las neurológicas [6]. Cistanche Deserticola es una medicina tradicional china que puede nutrir el riñón yang y reponer la esencia y la sangre. Se ha utilizado para tratar enfermedades neurológicas como el accidente cerebrovascular isquémico y la neuromielitis [7]. Estudios previos del grupo de investigación han demostrado que la deserticola de Cistanche puede mejorar el comportamiento de las ratas modelo PD y reducir la apoptosis de las células nerviosas de dopamina en el área sustancial nigra del cerebro medio [8-9]. Sin embargo, no está claro si Cistanche Deserticola puede mejorar el daño del tejido del hipocampo en las ratas modelo PD. Por lo tanto, este estudio estableció un modelo de rata PD para observar el efecto de la desértica de Cistanche en el daño del tejido del hipocampo y explorar su mecanismo, para proporcionar nuevas ideas para el tratamiento con EP. Compañía biológica tiana); Reactivo de tinción NISSL (Nanjing Senbeijia Biological Company); Isoflurano (Shanghai Yaji Biological Company).

 

1 Materiales y métodos

1.1 Materiales

1.1.1 animales experimentales

Se utilizaron 30 6- ratas machas SD de semana que pesaban 210-230 G. El Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Fujian de la Medicina Tradicional China proporcionó animales experimentales e instalaciones generales de entorno animal experimental. El experimento fue aprobado por el comité de ética animal de esta institución, y el número de registro de ética es 1N2023019.

1.1.2 Reactivos experimentales
Gránulos de deserticola de Cistanche (Fujian Third People's Hospital); 6- Hydroxydopamine (6- OHDA) Reagent (Beijing Biolabor Technology Co., Ltd.); Reactivo de tinción de hematoxilina-eosina (HE) (Taizhou Yunke Biotechnology Co., Ltd.); Lisado de proteína de tejido animal (Beijing Solebao Biological Company); Inhibidores de la proteína fosfatasa (Compañía Biológica de Wuhan Pujian); Inhibidores de la proteasa (Hunan Yunbang Biotechnology Company); Proteína asociada a ECH tipo kelch -1 (Keap1) anticuerpo monoclonal (Compañía de Biotecnología Wuhan Sanying); Gliceraldehído 3- fosfato deshidrogenasa (GAPDH) anticuerpo monoclonal (Wuhan Huamei Biological); Factor nuclear E2 Factor 2 (NRF2), hemo oxigenasa 1 (hemoxygenas -1, ho -1) anticuerpo monoclonal (Wuhan Pujian Biotechnology Co., Ltd.); kits de detección de superóxido dismutasa (SOD) y malondialdehído (MDA) (Shanghai Biotech Co., Ltd.); Reactivo de tinción NISSL (Nanjing Senbeijia Biotechnology Co., Ltd.); isoflurano (Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd.).

 

1.1.3 instrumentos

Balance electrónico JEA3001 (Shanghai Puchun Meduring Instrument Co., Ltd.); BSA224S Balance electrónico (Sartorius, Alemania); STAB S2T Shaker de baja temperatura (Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., Ltd.); RM2235 Slicer de parafina totalmente automática (Leica, Alemania); Lector de microplacas multifuncional Pectramax i3x (Molecular Devices, EE. UU.); BX63
microscopio de fluorescencia (Olympus, Japón); Centrífuga de mano DLAB D1008/D1008E (Beijing Dalong Xingchuang Experimental Instrument Co., Ltd.); Refrigerador de temperatura Ultra-Low de Cryocube F740HI (Epend, Alemania); Minipro EPBasic Basic Electroforesis Instrument Fugent Soide (Shanghai Yisheng Biotechnology Co., Ltd.); horno de secado de temperatura constante (Hangzhou Notting Scientific Equipment Co., Ltd.); Ascent Max sin ductos sin ductos (Shanghai Yishike Enterprise Development Co., Ltd.).

 

1.2 Métodos

1.2.1 Establecimiento del modelo y agrupación de animales

Rats were placed in an environment with a temperature of 24-25℃, a humidity of 55%-60%, and a 12/12 h light/dark cycle, with free access to food and water. SD rats were randomly divided into 3 groups (10 rats in each group): blank group, model group, and Cistanche deserticola group. According to the PD animal model establishment method [5], SD rats in the model group and Cistanche deserticola group were anesthetized by 2% isoflurane inhalation and fixed on a brain stereotaxic instrument. The skin was incised along the midline of the skull, and the skull membrane was bluntly separated. The coordinates of the right striatum were determined by referring to the rat brain stereotaxic atlas. 8μL of 6-OHDA was injected intracranially at the above target at a concentration of 2μg/μL, and the blank group rats were injected with an equal volume of saline. Successful modeling criteria: One week after modeling, apomorphine (0.5 mg/kg) was intraperitoneally injected to induce rat rotation. The rats rotated from the healthy side to the affected side, and the number of rotations within 30 min was >21 0 círculos, que se consideró un modelado exitoso. Después de eso, las ratas en el grupo de deserticola de Cistanche se endurecieron con 0.216 g/ml de solución de deserticola de Cistanche todos los días, y el grupo en blanco y el grupo modelo se enjustaron con solución salina normal. El volumen de sonda de los tres grupos de ratas fue de 1 ml/(100 g · d) durante dos semanas [9]. Después de que se completó el tratamiento de cada grupo de ratas, las ratas fueron sacrificadas por anestesia por inhalación de isoflurano al 2% y se recolectaron tejidos cerebrales para estudios experimentales posteriores.

 

1.2.2 Observación de los cambios patológicos en el tejido del hipocampo mediante tinción de hematoxilina-eosina

 

Se recogieron los tejidos del hipocampo de las ratas en cada grupo, se colocaron en solución de formaldehído, deshidratados con etanol gradiente, horneados en un horno de secado, cera disuelta, seca, rociada, teñida con HE, transparentizada con xileno, sellado con goma neutral y observada bajo un microscopio.

 

1.2.3 Observación de microscopía electrónica de transmisión de la ultraestructura de las células nerviosas del hipocampo

El tejido del hipocampo se colocó en fijador de glutaraldehído al 3%, se deshidrató con etanol gradiente, se preparó secciones incrustadas (resina epoxi) y ultrafinas. Se usaron tinción con citrato de plomo y acetato de uranilo para observar los cambios ultraestructurales de las células nerviosas del hipocampo (bajo microscopía electrónica de transmisión).

 

1.2.4 Tinción de NISSL para observar los cambios de los cuerpos NISSL en el tejido del hipocampo

Las secciones de parafina de tejido hipocampo mencionadas anteriormente se hidrataron en etanol anhidro, 95% y 70% de etanol en gradiente, respectivamente. Después de lavar con agua destilada 3 veces, tinte con solución de tinción con NISSL durante 5 minutos, luego lave con alcohol gradiente deshidratado y agua destilada, y aclare con xileno. Las secciones se sellaron con pegamento neutro y se observaron y registraron bajo un microscopio óptico después de la solidificación.

 

1.2.5 Método colorimétrico químico para detectar el contenido de MDA y SOD en el tejido del hipocampo

Después de que los tejidos del hipocampo de diferentes grupos experimentales fueron homogeneizados, se centrifugaron a 1000 g durante 20 minutos y se recogió el sobrenadante de cada grupo experimental. Según las instrucciones del kit, los kits de ensayo MDA y SOD se usaron para detectar el contenido de MDA y SOD en cada grupo de muestras experimentales.

 

1.2.6 inmunotransferencia de proteínas para detectar la expresión específica de proteínas Keap1, Nrf 2 y Ho -1 en el tejido del hipocampo

Los tejidos del hipocampo de cada grupo se agregaron con tampón de lisis y se centrifugaron a 12, 000 r · min -1 durante 15 min. El sobrenadante fue recogido para uso en espera. La concentración de proteína se determinó por el método BCA. Según los resultados de la cuantificación de proteínas, se agregó el volumen correspondiente de proteína total y se cargó con electroforesis en gel de proteína. Las muestras se desnaturalizaron a 95 grados durante 10 minutos, se transfirieron a la membrana, se cortaron y se bloquearon en solución de bloqueo durante 1 h. Los anticuerpos primarios diluidos Keap1, NRF 2, Ho -1 y GAPDH (1: 500) se agregaron, reaccionaron durante la noche a 4 grados, se lavaron con 1 × TBST, incubados con anticuerpos secundarios (1: 4000) y se lavaron con 1 × TBST nuevamente para imágenes de color.

 

1.3 Análisis estadístico

Los datos de conteo se expresaron como media ± desviación estándar. Los datos que se ajustaban a la distribución normal y la homogeneidad de la varianza se sometieron a la prueba t, los datos que se ajustaban a la distribución normal y la varianza desigual se sometieron a la prueba t corregida; Los datos que no se ajustaron a la distribución normal se sometieron a una prueba no paramétrica. Se usó ANOVA unidireccional para comparar las diferencias entre diferentes grupos, y luego se usó el método LSD para comparar los dos grupos. P <0. 05 se consideró estadísticamente significativo.

 

2 resultados

2.1 Efecto de la desértica de Cistanche en la estructura morfológica de la región del hipocampo CA1 en ratas modelo PD Los resultados de tinción mostraron que las neuronas en la región CA1 del hipocampo de las ratas grupales en blanco se organizaron de manera ordenada y estrecha, con una morfología regular y una distribución uniforme, y sin daños de células neuronales obvias; Las células neuronales en el grupo modelo se organizaron más desordenados, los núcleos celulares se redujeron, la tinción nuclear se profundizó y el daño de las células neuronales era obvio; Las células neuronales en el grupo de deserticola de Cistanche se organizaron más regularmente que las del grupo modelo, el número de condensación nuclear se redujo relativamente y se alivió el daño de las células neuronales. Los resultados se muestran en la Figura 1.

 

 

Figura 1 Efecto de la desértica de Cistanche en la estructura patológica en la región CA1 del hipocampo en la rata de Parkinson (HE, × 400) Nota: A: grupo de control; B: grupo modelo; C: Grupo Cistanche. Las flechas negras indican células nerviosas dañadas.

 

2.2 Efecto de la desértica de Cistanche en la ultraestructura de las neuronas del hipocampo en ratas modelo PD

En el grupo en blanco, al observar las neuronas del hipocampo, se puede observar que la estructura celular mantiene una morfología clara, el núcleo presenta una forma redonda u ovalada regular, la membrana nuclear permanece suave e intacta, y la cromatina en el núcleo se distribuye uniformemente, y no hay una agregación de borde de la cromatina nuclear. Por el contrario, las neuronas del hipocampo del grupo modelo mostraron cambios obvios: la densidad de electrones general de las células aumentó, el núcleo condensado, la cromatina en el núcleo agregó y se unió al fondo de la membrana nuclear, la membrana nuclear engrosó y las vacuolas se observaron en la citoplasma. After intervention with Cistanche deserticola, compared with the model group, the hippocampal neurons of the Cistanche deserticola group showed a certain recovery trend: the size of the neuronal cell body was restored, the cell membrane remained intact, the edge aggregation of nuclear chromatin was alleviated to a certain extent, the thickening of the nuclear membrane was also alleviated, and the number of vacuoles in the El citoplasma disminuyó, lo que indica que el deserticola de Cistanche tiene un cierto efecto protector o de reparación en las células nerviosas. Ver Figura 2.

 

Figura 2 Efecto de la desértica de Cistanche sobre la ultraestructura neuronal en el hipocampo de las ratas de la enfermedad de Parkinson (× 7000) Nota: A: Grupo de control; B: grupo modelo; C: Grupo Cistanche.

 

2.3 Efecto de la desértica de Cistanche en los cuerpos NISSL en las neuronas del hipocampo de ratas modelo PD

Los resultados de la tinción de NISSL mostraron que las neuronas en el grupo en blanco estaban ordenadas de cerca, con morfología regular, abundantes cuerpos NISSL y tinción oscura; Las neuronas en el grupo modelo estaban dispuestas, hinchadas, y la mayoría de los cuerpos NISSL se disolvieron y se mancharon ligeramente; Las neuronas en el grupo de deserticola de Cistanche estaban ordenadas estrechamente, con una morfología regular, y el número y la tinción de los cuerpos NISSL se mejoraron en comparación con el grupo modelo. Los resultados se muestran en la Figura 3.

 

Figura 3 Efecto de la desértica de Cistanche en el cuerpo de células nerviosas del hipocampo de NISSL en la rata de la enfermedad de Parkinson (NISSL, × 200) Nota: A: grupo de control; B: grupo modelo; C: Grupo Cistanche.

 

2.4 Efectos de la desértica de Cistanche en el contenido de SOD y MDA en el hipocampo de las ratas de la enfermedad de Parkinson

 

En comparación con el grupo en blanco, el contenido de SOD en el hipocampo del grupo modelo disminuyó, mientras que el contenido de MDA aumentó; En comparación con el grupo modelo, el contenido de SOD en el hipocampo del grupo de deserticola de Cistanche aumentó, mientras que el contenido de MDA disminuyó. Ver Tabla 1.

 

Pestaña. 1 Efectos de la desértica de Cistanche en el contenido de SOD y MDA en el hipocampo de las ratas de la enfermedad de Parkinson

Grupo	Césped (PG/ml)	MDA (PG/ml)
Control	12.36±2.75	2.85±0.83
Modelo	2.75±0.83*	9.95±0.37*
Rhynchophylla	7.22±1.32#	5.16±1.75#

Nota: En comparación con el grupo de control, *P<0.05; compared with model group, #P<0.05.

 

2.5 Efecto de la desértica de Cistanche sobre las proteínas de la expresión de Keap1, Nrf2 y Ho -1 en el hipocampo de las ratas de la enfermedad de Parkinson

Los resultados de los experimentos de transferencia Western mostraron que la expresión de proteínas Nrf2 y Ho -1 en el hipocampo de ratas en el grupo modelo disminuyó, mientras que la expresión de proteína Keap1 aumentó; En comparación con el grupo modelo, la expresión de proteínas Nrf2 y Ho -1 en el hipocampo de ratas en el grupo de deserticola de Cistanche aumentó, mientras que la expresión de proteína Keap1 disminuyó. Ver Figura 4 y Tabla 2.

Figura 4 Efecto de la desértica de Cistanche sobre la expresión de Keap1, Nrf2 y Ho -1 en Hippocampus de las ratas de la enfermedad de Parkinson

Nota: A: Grupo de control; B: grupo modelo; C: Grupo Cistanche

 

 

Pestaña. 2 Efecto de la desértica de Cistanche sobre la expresión de Keap1, Nrf2, Ho -1 en Hipocampo de las ratas de la enfermedad de Parkinson

 

Grupo	Keaplito	Nrf2	Ho -1
Grupo en blanco	0.16±0.05	0.38±0.07	0.33±0.05
Grupo de modelos	0.85±0.23*	0.12±0.09*	0.11±0.02*
Grupo positivo	0.22±0.03#	0.86±0.06#	0.79±0.05#

 

Nota: en comparación con el grupo de control, *p <{{0}}. 05; En comparación con el grupo modelo, #P <0.05.