El polisacárido Cistanche Deserticola induce la melanogénesis en los melanocitos, reduce el estrés oxidativo y promueve el blanqueamiento
Mar 24, 2022
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Yibo Hu1|JinhuaHuang1|Yixiao Li2|Ling Jiang1|Yujie Ouyang1|lun yang1|Xiaojiao Zhao1|Lihua Huang3|Hongxiang3|Jing Chen1 Qinghai Zeng1
Resumen
Como la parte principal de los trastornos de pigmentación, las enfermedades de despigmentación de la piel como el vitiligo y el nevus acromático son muy comunes y ahora reciben más atención. La patogenia de la despigmentación incluye la disfunción y la pérdida de melanocitos, que posiblemente sean causadas por herencia, autoinmunidad yestrés oxidativos. Entre ellos, el estrés oxidativo juega un papel fundamental; sin embargo, pocos tratamientos clínicos pueden tratar el estrés oxidativo. Como se informó,Cistanche deserticola polisacárido(CDP) es un antioxidante eficaz; en base a eso, evaluamos su papel en los melanocitos y revelamos aún más los mecanismos. En este estudio, encontramos que CDP podría promovermelanogénesisen melanocitos epidérmicos humanos (HEM) y células B16F10 de melanoma de ratón, también indujo pigmentación en pez cebra. Es más,CDPpodría activar la vía de señal de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK), luego regulaba al alza la expresión del factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF) y los genes aguas abajo TYR, TRP1, TRP2 y RAB27A. De lo contrario, descubrimos que la CDP podría atenuar la citotoxicidad y la apoptosis inducidas por H2O2-en los melanocitos. Más pruebas revelaron que la CDP podría mejorar la vía antioxidante NRF2/HO-1 y eliminar las ROS intracelulares. En resumen, CDP puede promovermelanogénesisy evitar que los melanocitosoxidativoestréslesión, lo que sugiere que la CDP ayuda a mantener el estado normal de los melanocitos. De este modo,CDPpuede ser un fármaco novedoso para el tratamiento de enfermedades despigmentantes.
PALABRAS CLAVE
Cistanche deserticola polisacárido, enfermedad despigmentante, melanocito, melanogénesis, NRF2, estrés oxidativo
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1|INTRODUCCIÓN
Las enfermedades despigmentantes de la piel, como el vitíligo y el nevus acromático, se caracterizan por una despigmentación cutánea extensa o en parches.1 Aunque las lesiones cutáneas rara vez causan lesiones físicas graves, afectan la apariencia del paciente y crean una carga psicológica grave, incluso trastornos de salud mental.2 Los principales cambios patológicos en la despigmentación incluyen la disfunción y pérdida de melanocitos, lo que afecta en gran medida la síntesis y el transporte de melanina,3 lo que lleva a una acumulación insuficiente de melanina en la piel.
Actualmente se desconocen los mecanismos involucrados en la despigmentación, pero los estudios han identificado algunos factores relacionados. Por un lado, la función de los melanocitos depende en parte del factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF), que es bien conocido por promover la expresión demelanogénesisgenes relacionados que incluyen tirosinasa (TYR), proteína relacionada con tirosinasa 1 (TRP1), proteína relacionada con tirosinasa 2 (TRP2), proteína relacionada con ras Rab-27a (RAB27A) y proteína agrupadora de actina fascin 1 (FSCN1) ).4 Entre estos genes, TYR juega un papel clave en la síntesis de melanina a través de la oxidación de l-dopa en dopaquinona.5 Por otro lado, los estudios sugieren una combinación de varios factores que pueden ser responsables de la pérdida de melanocitos, incluida la herencia, el medio ambiente, la autoinmunidad , yestrés oxidativo.6-9 Entre estos factores, el estrés oxidativo se considera el más importante.
Los mecanismos deestrés oxidativoque causan la despigmentación han sido parcialmente revelados; la sobrecarga de especies reactivas de oxígeno (ROS) es un factor clave.10 La sobrecarga de ROS en la despigmentación implica un desequilibrio entre los sistemas pro y antioxidante.11 Uno de los elementos que participan en este desequilibrio es el factor nuclear eritroide 2-relacionado deterioro de la vía antioxidante del factor 2/elemento de respuesta antioxidante (NRF2/ARE).12 La vía consta de NRF2 y enzimas antioxidantes como la hemooxigenasa-1 (HMOX-1, HO-1) , catalasa (CAT), glutatión peroxidasa 1 (GPX1) y NAD(P)H quinona deshidrogenasa 1 (NQO1).13 Cuando los melanocitos están expuestos a un exceso de ROS, NRF2 puede trasladarse al núcleo y unirse a los ARE conservados, luego promover la expresión de enzimas antioxidantes. Sin embargo, en algunas enfermedades despigmentantes, como el vitíligo, una vía antioxidante NRF2/ARE deteriorada no puede eliminar eficazmente las ROS.14
Las terapias clínicas comúnmente utilizadas en la despigmentación incluyen corticosteroides tópicos o sistémicos, inhibidores de la calcineurina, ultravioleta B de banda estrecha (NBUVB; 311 nm), luz excimer 308-nm, trasplante epidérmico autólogo y terapia de medicina tradicional china (MTC). Los corticosteroides y los inhibidores de la calcineurina pueden reducir la activación inmunitaria anormal,15 mientras que las fototerapias se utilizan como tratamiento de primera línea; en particular, NBUVB estimula la proliferación de melanocitos y la destrucción de células T,16 mientras que la luz excimer 308-nm induce la apoptosis de las células T.17 Además, los efectos de las terapias de la MTC están relacionados con la promociónmelanogénesis.18 Hasta cierto punto, estos métodos son útiles para mejorar la despigmentación, pero el control de la progresión de la enfermedad sigue siendo un desafío. Es necesario desarrollar nuevas terapias, especialmente paraestrés oxidativo, que antes estaba descuidado.
Cistanche deserticola se conoce como 'ginseng del desierto'.19 Sus componentes son útiles en el daño hepático inducido por etanol y la hiperplasia inflamatoria intestinal; también se puede usar como reactivo antifatiga, antiinflamatorio y antitumoral.20-22 Recientemente, Guo et al informaron queCistanche deserticola polisacárido(CDP), uno de sus principales componentes, poseía actividad antioxidante y hepatoprotectora20; otros dos estudios identificaron su papel en la protección de las células de unestrés oxidativolesión en condiciones de privación/reperfusión de oxígeno-glucosa y osteoporosis.23,24 Sin embargo, el papel de CDP en enfermedades de despigmentación no ha sido dilucidado. Aquí, nuestro objetivo era confirmar siCDPpodría afectarmelanogénesisy proteger los melanocitos del estrés oxidativo.
2|MATERIAL Y MÉTODOS
2.1|Químicos y anticuerpos
Cistanche deserticola polisacárido(CDP) y l-dopa se adquirieron de Yuanye Biotec (pureza mayor o igual al 98 por ciento; Shanghái, China). Peróxido de hidrógeno (H2O2), dimetilsulfóxido (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-bromuro de difeniltetrazolio ( MTT), y un kit de detección de apoptosis de Anexina V-FITC se adquirieron de Sigma-Aldrich. Se adquirió paraformaldehído neutro al 4 por ciento de Biosharp (Hefei, China); y un kit de tinción de inmunofluorescencia (Alexa Fluor 488) y diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (DCFH-DA) se adquirieron de Beyotime Biotec (Shanghai, China). Se adquirieron un kit de tinción de Fontana-Masson y un kit de extracción de proteínas nucleoplasmáticas de Sloarbio (Beijing, China). El suplemento de crecimiento de melanocitos humanos (HMGS), el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y el medio 254 se adquirieron de Gibco. El suero bovino fetal (FBS) se adquirió de BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israel). Los anticuerpos primarios para actina, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, NRF2 y HO-1 se adquirieron de Cell Signaling Technology, un el anticuerpo para MITF se compró en St John's Laboratory, un anticuerpo primario para p-MITF se compró en Affinity Biosciences, un anticuerpo primario para GAPDH se compró en Bioworld y el anticuerpo primario para TRP1 se compró en EMD Millipore.
2.2|Cultivo celular y tratamiento.
Se cultivaron células B16F10 de melanoma de ratón en medio DMEM suplementado con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de mezcla de antibióticos de penicilina-estreptomicina. Los melanocitos epidérmicos humanos (HEM, por sus siglas en inglés) se separaron del prepucio humano (consulte nuestro estudio anterior25) y se cultivaron en medio 254 complementado con HMGS, 5 % de FBS y 1 % de mezcla de antibióticos de penicilina y estreptomicina. Todas las células se cultivaron en una incubadora húmeda a 37 grados con 5 por ciento de CO2. CDP se disolvió en DMSO y se diluyó con el medio antes de su uso, la concentración final de DMSO fue inferior al 0,1 por ciento. El H2O2 se diluyó con el medio antes de su uso.
2.3|Cultivo y tratamiento de pez cebra
Los embriones de pez cebra y el medio se adquirieron de EzeRinka Biotech. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Central del Sur. Los peces cebra se cultivaron en 12-placas de pocillos a 37 grados de la luz y se trataron con diferentes concentraciones de CDP. Se utilizó un microscopio invertido para observar y registrar diariamente las melaninas en la cabeza y la cola del pez cebra. Después de la observación, cambiamos el medio y volvimos a agregar elCDP. La densidad de melanina en las colas del pez cebra se midió con la imagen J y los valores se presentan como densidades ópticas integradas (IOD).
2.4|Viabilidad celular
La viabilidad celular se midió utilizando un ensayo MTT. Para investigar la citotoxicidad deCDPSe implantaron células HEM y B16F10 en 96-placas de pocillos a una densidad de 2 × 103 células/pocillo y se cultivaron hasta que las células se unieron a las placas. A continuación, las células se trataron con diferentes concentraciones (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 y 320 ug/mL) deCDPdurante 24, 48 o 72 horas. Antes de la medición, se agregaron 20 μL de MTT a cada pocillo y las placas se incubaron a 37 grados durante 4 horas. Después de eso, descartamos el sobrenadante y agregamos 160 μL de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales de formazán. El valor de absorbancia a 490 nm se midió mediante un lector de placas multimodo (PerkinElmer). Para investigar el efecto de CDP en la condición de citotoxicidad inducida por H2O2-, se sembraron HEM y células B16F10 en 96-placas de pocillos a una densidad de 4 × 103 células/pocillo. Las células fueron tratadas con diferentes concentraciones deCDP({{0}}, 20, 40 u 80 ug/ml) durante 24 horas, momento en el que añadimos H2O2 (concentraciones finales: 500 μm para HEM y 1,0 mm para células B16F10) a cada pocillo y Se incubaron las células durante otras 24 horas. Establecimos grupos de control negativo (NC) y tratados con CDP. Los pasos de detección fueron los mismos que los descritos anteriormente.
2.5|Ensayo de NaOH del contenido de melanina
Las células se cultivaron en placas petri de 100- mm y se trataron conCDPa diferentes concentraciones (0, 20, 40 y 80 ug/mL) durante 48 horas, luego se digirió con tripsina y se recolectó en tubos de 1.5-mL. Lavamos las células dos veces con agua bidestilada, las resuspendimos en 1 ml de etanol y las agitamos en vórtex para liberar la melanina. Luego centrifugamos (200 g, 5 minutos) la mezcla y descartamos el sobrenadante, agregamos 1 ml de DMSO al 10 por ciento (diluido con solución de NaOH 1 mm) en cada tubo y suspendimos el sedimento. Incubamos la suspensión en un baño de agua a 80 grados durante 1 hora para disolver la melanina. Finalmente, transferimos 200 μL del líquido a una placa de pocillos 96-y usamos un lector de placas multimodo para medir el valor de absorbancia a 470 nm.
Cistanchecríticas: inhibemelaninaproducción.
2.6|Mediciones de actividad de tirosinasa
Las células se cultivaron en placas Petri de 100- mm y se trataron conCDPantes de la medición, se digirió con tripsina y se recogió en tubos de 1,5-mL y se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Pasamos 106 células de cada muestra a un tubo nuevo y descartamos el sobrenadante después de la centrifugación, luego agregamos 1 ml 0.5 por ciento de Triton X-100 al sedimento celular y almacenamos el mezcla a 0 grados durante 15 minutos. A partir de entonces, agregamos 1 ml de l-dopa (1 mm, diluido con 0tampón de fosfato 1 M) como sustrato y mezclamos la solución, movimos 200 μL de la mezcla a un { {16}}placa de pocillos inmediatamente y midió el valor de absorbancia (A0) a 475 nm usando un lector de placas multimodo, repitiendo la medición a los 10 minutos (A10). La actividad tirosinasa se calculó mediante (A10-A0)/105, y los resultados se expresan como porcentaje ( por ciento ) frente al control negativo.
2.7|Tinción de melanina de Fontana-Masson
Las células se cultivaron en 12-placas de pocillos hasta alcanzar una densidad del 50 por ciento. Después del tratamiento, las células se fijaron con paraformaldehído neutro al 4 por ciento durante 30 minutos y se lavaron con agua destilada. Luego agregamos 500 μL de solución de plata y amoníaco de Fontana a cada pocillo y almacenamos las placas en la oscuridad durante 16 horas para teñir la melanina. A continuación, lavamos las células con agua destilada cinco veces (1 minuto cada vez) y las empapamos en 500 μL de hiposulfito durante 5 minutos; finalmente, retiramos el hiposulfito y lavamos las células nuevamente con agua destilada durante 1 minuto. Luego usamos un microscopio invertido para observar y registrar las melaninas.
2.8|Extracción de ARN y reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa
Las células se cultivaron en 6-placas de pocillos. Después del tratamiento, las células se digirieron con tripsina y se recogieron en tubos de 1,5-mL. Lavamos las células dos veces con PBS, luego agregamos 1 ml de tampón de lisis, agitamos la mezcla y colocamos los tubos en hielo durante 5 minutos para lisar las células por completo. El ARN se extrajo con un kit de ARN total (Omega Bio-Tek) y se transcribió inversamente (RT) con ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (PCR) se realizó utilizando KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). El volumen de reacción de la mezcla de RT fue de 20 μL, mientras que el volumen de reacción de la mezcla de PCR fue de 20 μL (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, primer F 1 μL, primer R 1 μL, agregue DEPC H2O a 20 μL ). Los experimentos se realizaron de acuerdo con los protocolos. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla S1.
2.9|Extracción de proteínas y Western blotting/inmunofluorescencia
Las células se cultivaron en placas Petri de 100- mm. Después del tratamiento, las células se digirieron con tripsina y se recogieron en tubos de 1,5-mL. Lavamos las células dos veces con PBS, luego añadimos 500 μL de tampón de lisis RIPA (Thermo Fisher) complementado con 1 mm de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (Thermo Fisher) y cóctel inhibidor de fosfatasa diluido 1:100 (Roche). La proteína nuclear y del citoplasma se extrajo utilizando el kit de extracción de proteínas nucleoplasmáticas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Colocamos los tubos en hielo durante 30 minutos y los agitamos cada 5 minutos para lisar completamente las células. Centrifugamos las células (200 g, 4 grados, 15 minutos), movimos el sobrenadante a un tubo nuevo y medimos la concentración de proteína total usando un kit de ensayo de proteína BCA (KeyGEN Biotec). Hervimos las proteínas con tampón de carga 5x (Beyotime Biotec, China) a 100 grados durante 10 minutos, luego las almacenamos a -80 grados. Se usó el método de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en transferencia Western, y se separaron 20 ug de proteína de cada grupo y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno. Después del bloqueo del antígeno, incubamos la membrana en un anticuerpo primario diluido 1:1000 durante 16 horas a 4 grados, luego lavamos la membrana con PBST y la incubamos en anticuerpo secundario fluorescente diluido 1:10 000 durante 1 hora a 37 grados. . La intensidad de la fluorescencia se detectó utilizando un sistema de imágenes Odyssey CLx (LI-COR). La inmunofluorescencia se realizó utilizando el kit de tinción de inmunofluorescencia (Alexa Fluor 488) con una dilución 1:100 del anticuerpo primario.
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2.10|Medición de la apoptosis celular
Las células se cultivaron en placas Petri de {{0}}mm y se trataron con diferentes concentraciones (0, 20, 40 y 80 ug/mL) deCDPdurante 24 horas y se añadió H2O2 (concentraciones finales: 500 μm para HEM, 1,0 mm para células B16F10) a cada pocillo y se incubó durante otras 24 horas. También establecimos grupos tratados con CDP y NC. Después del tratamiento, digerimos las células con tripsina libre de EDTA y las recolectamos en tubos, luego lavamos las células dos veces con PBS y las resuspendimos en 100 μL de PBS. Las células se tiñeron con un kit de detección de apoptosis de Anexina V-FITC de acuerdo con el protocolo y se detectaron por citometría de flujo (FCM). Se utilizó el software FlowJo para analizar la tasa de apoptosis.
2.11|Medición de ROS intracelular
Las células se cultivaron en {{0}}placas de pocillos y se trataron con diferentes concentraciones (0, 20, 40 y 80 ug/mL) deCDPdurante 24 horas, a lo que agregamos H2O2 (concentraciones finales: 500 μm para HEM, 1,0 mm para células B16F10) a cada pocillo, los incubamos durante otras 24 horas y configuramos grupos tratados con CDP y NC. Después del tratamiento, lavamos las células dos veces con PBS para eliminar todo el medio y FBS, luego diluimos la sonda DCFH-DA a 1:1000 con medio y la añadimos a cada pocillo. Incubamos las células a 37 grados durante 30 minutos y las lavamos tres veces con un medio sin suero. usamos unmicroscopio de fluorescencia invertido para observar y registrar la fluorescencia, luego usó ImageJ para medir la intensidad de la fluorescencia.
2.12|Estadísticas y análisis
Los datos de este trabajo se presentan como media ± desviación estándar (DE) y el análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism (versión 7.0) o SPSS (versión 22.0) y Student's Se usó la prueba t o el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para las comparaciones de grupos múltiples. El valor gris de las bandas de proteína WB se estandarizó con GAPDH o -actina. Se consideraron significativos valores de p < 0,05.="" todos="" los="" experimentos="" fueron="" repetidos="" al="" menos="" tres="">
3|RESULTADOS
3.1|Melanogénesis inducida por CDP en células HEM y B16F10
Antes de comenzar, utilizamos el ensayo MTT para investigar la citotoxicidad potencial de CDP en HEM y células B16F10 de melanoma de ratón. Las células fueron tratadas conCDPa diferentes concentraciones durante 24, 48 o 72 horas. Las pruebas de viabilidad HEM demostraron que cuando las concentraciones eran inferiores a 320 ug/ml, la CDP no influía en la viabilidad celular; sin embargo, la viabilidad disminuyó significativamente cuando la concentración alcanzó 320 ug/mL a las 24, 48 y 72 horas (P < 0,05;="" figura="" 1a).="" la="" viabilidad="" de="" las="" células="" b16f10="" también="" disminuyó="" a="" las="" 48="" y="" 72="" horas="">CDPalcanzó 320 ug/mL (P < 0,01)="" pero="" no="" se="" observaron="" cambios="" a="" concentraciones="" más="" bajas="" (figura="" 1b).="" luego="" exploramos="" preliminarmente="" el="" papel="" de="" cdp="">melanogénesisy comparó sus efectos con los de la hormona estimulante de melanocitos (-MSH; concentraciones: 20, 100 y 400 nm) y DMSO (0,1 por ciento) en HEM. Los resultados de los ensayos de tinción de melanina, actividad de tirosinasa y contenido de melanina sugirieron que CDP era comparable con -MSH para promover la melanogénesis, mientras que el tratamiento con DMSO al 0,1 por ciento no hizo ninguna diferencia (Figura S1).
Refinamos aún más nuestra exploración en consecuencia. Los HEM fueron tratados conCDPa diferentes concentraciones (20, 40 y 80 ug/mL) durante 48 horas; Se realizaron los ensayos de tinción de melanina, contenido de melanina y actividad de tirosinasa, y todos mostraron aumentos significativos después del tratamiento con CDP de una manera dependiente de la concentración que alcanzó su punto máximo en el grupo de 80 ug/mL (P < 0,05,="" figura="" 2a-c).="" luego="" medimos="" los="" niveles="" de="" mrna="" y="" proteína="">melanogénesisgenes relacionados (MITF, TYR, TRP1, TRP2, RAB27A y FSCN1). CDP aumentó significativamente los niveles de ARNm de esos genes en HEM (P < 0,05;="" figura="" s2a).="" además,="" los="" niveles="" de="" proteínas="" mitf,="" tyr,="" trp1="" y="" rab27a="" aumentaron,="" al="" igual="" que="" la="" proporción="" de="" mitf="" fosforilado="" a="" mitf="" total="" (p="">< 0,05),="" mientras="" que="" trp2="" y="" fscn1="" no="" mostraron="" diferencias="" (figura="" 2d,="" e).="" los="" resultados="" indicaron="" que="" la="" cdp="" puede="" promover="" la="" melanogénesis="" y="" regular="" al="" alza="" la="" expresión="" de="" genes="" relacionados="" con="" la="" melanogénesis="" en="" los="" melanocitos="">
Además, volvimos a verificar los efectos deCDPnuevamente con células B16F10 y descubrió que el contenido de melanina de las células B16F10 aumentó significativamente (P < 0,01;="" figura="" s2b).="" además,="" cdp="" aumentó="" significativamente="" los="" niveles="" de="" arnm="" de="">melanogénesisgenes relacionados (P < 0,05; Figura S2C), y los niveles de proteína de MITF, TYR, TRP1, TRP2 y RAB27A también aumentaron después del tratamiento con CDP (P < 0,05; Figura S2D-E).
FIGURA 1 La citotoxicidad de CDP en células HEM y B16F10.
3.2|CDP promovió la melanogénesis en el pez cebra
Para investigar siCDPpodría promovermelanogénesisin vivo, utilizamos embriones de pez cebra. Los embriones de pez cebra se dividieron en cuatro grupos y se trataron continuamente con medio solo (NC) o CDP en diferentes concentraciones (20, 40 y 80 ug/mL); la densidad y distribución de los gránulos de melanina se observaron y registraron todos los días. A medida que crecían los embriones de pez cebra, encontramos que la densidad de melanina aumentaba gradualmente en la cabeza y la cola. En el tercer día, las diferencias entre grupos eran distinguibles y la diferencia siguió aumentando hasta que finalizamos el experimento en el sexto día (Figura 3A). Usamos la Imagen J para medir la densidad de melanina en las colas del pez cebra; la densidad de melanina en los grupos tratados con CDP fue significativamente mayor que la del grupo de control (P < 0,05;="" figura="">
3.3|Vía de señal MAPK activada por CDP en células HEM y B16F10
Revelar los mecanismos por los cualesCDPpromovidomelanogénesis, tratamos los HEM con CDP a diferentes concentraciones (20, 40 y 80 ug/mL) durante 48 horas y luego investigamos los niveles fosforilados y totales de las proteínas ERK, JNK y p38 en la vía de señalización de MAPK. Según lo medido por transferencia Western, los niveles de p-ERK, p-JNK y p-p38 aumentaron después del tratamiento con CDP (P < 0,05),="" mientras="" que="" los="" niveles="" totales="" de="" ellos="" no="" cambiaron="" (figura="" 4a,="" b).="" los="" experimentos="" se="" repitieron="" con="" células="" b16f10="" y="" los="" niveles="" fosforilados="" de="" las="" proteínas="" erk,="" jnk="" y="" p38="" aumentaron="" (p="">< 0,05),="" pero="" los="" niveles="" totales="" de="" mapk="" no="" cambiaron="" (figura="" 4c,="" d),="" de="" acuerdo="" con="" los="" resultados.="" en="">
3.4|CDP atenuó la citotoxicidad y la apoptosis inducidas por H2O2-en células HEM y B16F10
Utilizamos H2O2 para simular el entorno de estrés oxidativo y exploramos más a fondo el papel de CDP en los melanocitos bajo estrés oxidativo. La concentración final de H2O2 utilizada en los HEM fue de 500 μm, mientras que en las células B16F10 fue de 1,0 mm. Para investigar el efecto de CDP en la citotoxicidad inducida por H2O2-, pretratamos HEM y células B16F10 conCDPa diferentes concentraciones (20, 40 y 80 ug/mL) durante 24 horas, luego se agregó H2O2 y se continuó el tratamiento durante 24 horas antes de realizar la observación y el ensayo MTT.
El H2O2 provocó una aparente formación de ampollas en la membrana y una contracción celular en los HEM; en los grupos tratados previamente con CDP, la situación se alivió. El tratamiento con CDP solo no tuvo efecto (Figura 5A). El ensayo MTT mostró un resultado similar en el sentido de que el tratamiento con H2O2 disminuyó la viabilidad de HEM, mientras que CDP mejoró significativamente este impacto dañino (P < 0,01);="" tratamiento="">CDPsolo no hizo ninguna diferencia (Figura 5C). Luego verificamos nuevamente el efecto protector en las células B16F10. El tratamiento con H2O2 indujo una aparente formación de ampollas en la membrana y una contracción celular, mientras que la condición desfavorable también mejoró con CDP en las células B16F10 (Figura 5B). Mientras tanto, el ensayo MTT mostró que la viabilidad de las células B16F10 disminuyó después del tratamiento con H2O2, pero la situación mejoró significativamente en los grupos tratados previamente con CDP (P < 0,05;="" figura="">
Además, utilizamos FCM para medir la apoptosis inducida por H2O2-de células HEM y B16F10. Los resultados mostraron que el H2O2 causó una apoptosis significativa en las células HEM y B16F10, pero el pretratamiento conCDPa diferentes concentraciones podría reducir significativamente la apoptosis; de lo contrario, el tratamiento con CDP solo no supuso ninguna diferencia (Figura 5E, F). La tasa de apoptosis aumentó después del tratamiento con H2O2, pero disminuyó en los grupos tratados previamente con CDP; el cambio fue significativo tanto en las células HEM como en las B16F10 (P < 0,05,="" figura="" 5g,="">
FIGURA 2 CDP promueve la melanogénesis en HEM.
3.5|CDP eliminó H2O2-inducida por ROS intracelulares en células HEM y B16F10
Para investigar los mecanismos deCDPpara disminuir la citotoxicidad y la apoptosis inducidas por H2O2-, detectamos además las ROS intracelulares en células HEM y B16F10 utilizando una sonda de fluorescencia DCFH-DA. Los tratamientos fueron los mismos que los descritos anteriormente, se midió la intensidad de la fluorescencia para representar el nivel de ROS. Como observamos en los HEM, el tratamiento con H2O2 fue eficaz para elevar las ROS, pero la CDP eliminó significativamente las ROS intracelulares en los grupos tratados con H2O2- (P < 0,01;="" figura="" 6a,="" c);="" además,="" el="" uso="" de="" cdp="" solo="" no="" hizo="" ninguna="" diferencia.="" reconfirmamos="" los="" resultados="" en="" células="" b16f10.="" en="" las="" células="" b16f10,="" el="" tratamiento="" con="" cdp="" solo="" no="" afectó="" el="" nivel="" de="" ros,="" mientras="" que="" el="" tratamiento="" con="" h2o2="" aumentó="" el="" nivel="" de="" ros="" obviamente,="" pero="" este="" cambio="" también="" se="" redujo="" significativamente="" con="" el="" pretratamiento="" con="" cdp="" (p="">< 0,05;="" figura="" 6b,="">
3.6|Vía antioxidante NRF2/HO-1 regulada al alza por CDP en melanocitos
Para revelar aún más los mecanismos por los cuales CDP elimina ROS, primero medimos los niveles de proteína de la vía antioxidante NRF2/HO-1 en células B16F10. Descubrimos que el tratamiento con CDP solo no afectó significativamente a las proteínas NRF2 y HO-1, pero en los grupos tratados con H2O2-, el nivel de estas dos proteínas aumentó significativamente yCDPel pretratamiento mejoró aún más la elevación (p<.05; figure="" s3).="" moreover,="" we="" investigated="" the="" protein="" levels="" of="" nrf2="" and="" ho-1="" in="" hems="" after="" h2o2="" and/or="" cdp="" treatment.="" the="" results="" showed="" that="" ho-1="" level="" was="" elevated="" in="" h2o2-treated="" groups,="" and="" further="" increased="" in="" cdp="" pretreatment="" groups=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" to="" know="" the="" distribution="" of="" nrf2,="" we="" compared="" the="" level="" of="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" with="" the="" total="" level="" of="" β-actin="" in="" hems.="" similarly,="" we="" found="" that="" both="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" were="" elevated="" under="" h2o2="" treatment;="" their="" levels="" further="" increased="" in="" the="" cdp="" pretreated="" groups.="" based="" on="" that,="" we="" calculated="" the="" ratio="" of="" nuclear="" nrf2="" to="" cytoplasmic="" nrf2.="" the="" result="" suggested="" that="" cdp="" increased="" the="" ratio="" significantly="" at="" concentrations="" of="" 40="" and="" 80="" μg/ml=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" using="" immunofluorescence,="" we="" observed="" the="" fluorescence="" of="" nrf2="" in="" hems="" and="" knew="" that,="" under="" h2o2="" treatment,="" the="" nucleus="" seemed="" to="" have="" expanded="" and="" the="" levels="" of="" nrf2="" in="" the="" nucleus="" and="" cytoplasm="" were="" enhanced.="" among="" them,="" the="" cells="" pretreated="" with="">CDPmostró algunas diferencias, ya que pudimos ver que la fluorescencia en el núcleo era más fuerte que en el citoplasma, y la distribución era cercana a tres concentraciones de CDP (Figura 7C).
FIGURA 3 CDP promueve la melanogénesis en el pez cebra.
4|DISCUSIONES Y CONCLUSIONES
En este estudio, investigamos el papel deCDPen células HEM y B16F10. Por primera vez, descubrimos que la CDP podría promover la melanogénesis en los melanocitos y promover la pigmentación en el pez cebra. Un experimento posterior mostró que la ruta de señalización de MAPK se activó bajo el tratamiento con CDP. Investigamos más a fondo su papel enestrés oxidativoy descubrió que la CDP podía atenuar la citotoxicidad y la apoptosis inducidas por H2O2- en los melanocitos; mientras tanto, CDP podría activar la vía antioxidante NRF2/HO-1 y eliminar las ROS intracelulares en condiciones de estrés oxidativo.
La proteína quinasa activada por mitógenos es una vía vital involucrada en la regulación de MITF, un factor de transcripción clave que promueve la expresión demelanogénesisrelacionados con los genes y, posteriormente, afecta la síntesis y el transporte de melanina.26,27 En nuestro estudio, la activación de ERK, JNK y p38 en los melanocitos aumentó significativamente después del tratamiento con CDP; mientras tanto, las expresiones de MITF / p-MITF y MITF-driven TYR, TRP1, TRP2 y RAB27A se regularon en consecuencia. Por lo tanto, sugerimos que CDP puede promovermelanogénesisa través de la activación de la vía MAPK, pero ¿cómoCDPactiva MAPK sigue siendo desconocido. Según estudios recientes, el receptor tipo toll 4 (TLR4) se expresa en gran medida en los melanocitos y está implicado enmelanogénesis.28,29 TLR4 es una importante proteína transmembrana que puede unirse específicamente a los lipopolisacáridos (LPS)30; los estudios informaron que el LPS puede inducir la melanogénesis.29 Curiosamente, varios polisacáridos extraídos de plantas o hongos supuestamente activaron los TLR y las vías de señalización posteriores como MAPK y el factor nuclear kappa beta (NF-κB).31,32 Por lo tanto, sospechamos queCDPpuede ser reconocido y unido por TLR, luego activa la vía de señalización MAPK aguas abajo y promuevemelanogénesis. Además, se sabe que los receptores similares a dominios de oligomerización de unión a nucleótidos (NLR, por sus siglas en inglés) reconocen ligandos intracelulares e impulsan la activación de las vías de señalización de MAPK y NF-κB.33,34 Como se informó, los polisacáridos extraídos de Ganoderma lucidum y Astragalus pueden ingresar a las células y afectar a los NLR.35,36 Por lo tanto, es posible que la CDP pueda ingresar a los melanocitos y regular la vía de señalización de MAPK a través de los NLR. Sin embargo, se necesitan más estudios para verificar esta hipótesis.
Algunos estudios hasta la fecha reportaron la aplicación de polisacáridos herbales en la melanogénesis para inhibir la producción de melanina.37,38 Sin embargo, en este estudio,CDPpromovidomelanogénesisen los melanocitos, y este efecto se confirmó después de la comparación con -MSH. El CDP también es un tipo de polisacárido extraído de las hierbas, sospechamos que el efecto opuesto del CDP puede estar relacionado con las diferencias estructurales entre el CDP y otros polisacáridos. Los polisacáridos se forman por polimerización de monosacáridos pero varían en tipo de monosacárido, composición de monosacárido, enlace glucosídico, estructura de la cadena lateral y peso molecular39,40; se cree que estos factores determinan sus funciones biológicas.41 Los estudios existentes han propuesto la estructura deCDPy sugirió que la estructura de la CDP influye posteriormente en su función.42 Por lo tanto, se necesitan más pruebas para comprender completamente la CDP y confirmar nuestra hipótesis.
Melanogénesises un mecanismo protector importante para resistir el daño ultravioleta y mantener la homeostasis del cuerpo43; al mismo tiempo, los melanocitos se exponen fácilmente a entornos desfavorables como la sobrecarga de ROS.11 Se sabe que las ROS participan en la promoción de la melanogénesis, uno de los mecanismos es la activación de las MAPK.44 Pero los estudios también revelaron que este efecto existe solo dentro de un determinado ROS. nivel, mientras que la sobrecarga de ROS perjudicamelanogénesissignificativamente.45 La relación entre ROS, MAPK y la melanogénesis es variable en diferentes condiciones, por lo tanto, el equilibrio entre los sistemas prooxidantes y antioxidantes es obviamente importante. En enfermedades despigmentantes como el vitíligo, un sistema antioxidante desequilibrado y una sobrecarga incontrolable de ROS dañarán los melanocitos y disminuirán la viabilidad celular.11,46 En este estudio, utilizamos diferentes concentraciones de H2O2 para simular la sobrecarga de ROS en las células, y los HEM mostraron una peor tolerancia a H2O2 que las células B16F10. Cuando los melanocitos se sometieron al tratamiento con H2O2, su tasa de viabilidad y apoptosis empeoró, pero el pretratamiento con CDP pudo revertir parcialmente la tendencia. Al mismo tiempo, ROS fue eliminado. Como se informó, la activación de la ruta de antioxidación de NRF2/ARE es un método importante de eliminación de ROS en las células de la piel.14 En nuestros experimentos, los niveles de proteína de NRF2 y HO-1 en los melanocitos aumentaron después del tratamiento con H2O2 sin CDP; esto significa que H2O2-indujoestrés oxidativopuede activar la vía NRF2/HO-1, pero es insuficiente para mantener un equilibrio redox y proteger a la célula de lesiones. Sin embargo, el tratamiento previo con CDP mejoró la vía de antioxidación de NRF2/HO-1 y restableció el equilibrio. Por lo tanto, sugerimos que la CDP puede proteger a los melanocitos de la lesión por estrés oxidativo mediante la activación de la vía de antioxidación NRF2/HO-1 y la eliminación de ROS.
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Encontramos esoCDPel tratamiento por sí solo no tiene influencia sobre ROS o NRF2/HO-1 en los melanocitos. Este resultado sugiere que la CDP puede afectar el balance redox bajoestrés oxidativo, pero no en condiciones normales. Además, la vía de antioxidación de NRF2/HO-1 está supuestamente regulada por las vías de señalización de PI3K, NF-κB y MAPK.47,48 En nuestro estudio, la CDP pudo activar la vía de señalización de MAPK. Es posible que CDP pueda activar la vía NRF2/HO-1 a través de MAPK de regulación positiva. Como informó Slominski, los melanocitos son sensores de estrés involucrados en una red reguladora, y sus funciones pueden cambiar rápidamente en respuesta al medio ambiente.49 Sugerimos que el papel de la CDP está influenciado por el estado de los melanocitos, puede promovermelanogénesissin afectar el sistema antioxidante en condiciones normales pero restaurando el equilibrio redox en condiciones de estrés oxidativo. Por lo tanto, la CDP puede mantener la función y la supervivencia de los melanocitos de dos maneras diferentes. CDP ayuda a los melanocitos a mantener la homeostasis, que también es una función importante demelanogénesis.50,51
En conclusión,CDPpuede promover la melanogénesis de los melanocitos mediante la activación de la vía de señalización MAPK. CDP puede mejorar la supervivencia de los melanocitos mediante la activación de la vía antioxidante NRF2/HO-1 y la eliminación de ROS intracelulares bajoestrés oxidativocondiciones. Nuestros hallazgos son significativos porque demuestran que CDP puede promovermelanogénesisy proteger a los melanocitos de la lesión por estrés oxidativo, que posiblemente sea responsable de la disfunción y pérdida de melanocitos. Los hallazgos de este estudio indican que la CDP podría ser un fármaco novedoso en el tratamiento de enfermedades despigmentantes.