Propiedades Fotoprotectoras Y Anti-Melanogénicas De Diferentes Extractos De Kadsura Coccinea

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La radiación solar ultravioleta (UV), caracterizada por UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm) y UVC (100–280 nm), es el factor ambiental más crítico que causa cáncer de piel y fotoenvejecimiento como resultado de citotoxicidad, genotoxicidad y fototoxicidad. Específicamente, la radiación UVA y UVB comprende más del 95 por ciento y el 3 por ciento de la radiación UV diaria, respectivamente [8]. La radiación UVA y UVB puede inducir especies reactivas de oxígeno (ROS) indirecta o directamente al penetrar las capas epidérmicas y/o dérmicas de la piel, lo que provoca daño oxidativo y muerte celular. En las últimas décadas, la radiación ultravioleta se ha convertido en un grave problema para la salud de la piel y todavía se está extendiendo peligrosamente por todo el mundo [9–11]. La radiación ultravioleta es un estimulante directo y constante de los queratinocitos, que representan aproximadamente el 95 por ciento de la masa de células epidérmicas de la piel. Los queratinocitos actúan como la primera barrera contra los peligros microbianos, químicos y físicos, y ayudan a defenderse contra la radiación UVA y UVB. Cuando los queratinocitos se exponen a los rayos UVA y UVB, se generan ROS intracelulares, lo que desencadena la apoptosis [12-14].

Los melanocitos son responsables de la producción y cantidad de pigmentos de melanina, que son actores importantes en la defensa biológica de la epidermis de la piel; su desregulación puede causar trastornos de hiperpigmentación o hipopigmentación [15,16]. Los melanocitos se distribuyen en el estrato basal de la epidermis de la piel, que también se ve afectado por la exposición a la luz solar, las especies reactivas de oxígeno (ROS) y las hormonas estimulantes de melanocitos (-MSH) [17,18]. La tirosinasa, miembro de la familia de proteínas de cobre tipo-3, es una metaloproteína conservada evolutivamente que juega un papel crucial en la melanogénesis y en las actividades de monofenol monooxigenasa, catecolasa y difenoles. La regulación a la baja de la tirosinasa, la proteína relacionada con la tirosinasa-1 (TRP-1) y la proteína relacionada con la tirosinasa-2 (TRP-2) tienen efectos catalíticos distintos. TRP-1 es una 5,6-dihidroxiindol-2-ácido carboxílico oxidasa, y TRP-2 es una tautomerasa DOPAchrome [19,20]. Además, el factor de transcripción relacionado con la mioftalmosis (MITF) y la proteína de unión a elementos sensibles al AMPc (CREB) son factores de transcripción que regulan principalmente la melanogénesis y codifican información sobre el modo y la intensidad de la estimulación [17,21]. Múltiples estudios han declarado que las vías MITF y CREB regulan la melanogénesis. MITF es un factor clave en la transcripción de enzimas relacionadas con la melanogénesis y el regulador central de la melanogénesis. -MSH conduce a la expresión de MITF a través de un mecanismo de señalización que implica la proteína de unión relacionada con cAMP (CREB). Luego, MITF ingresa al núcleo con la secuencia M-box (AGTCATGTGCT) para promover la transcripción de enzimas y genes melanogénicos específicos. También se sabe que CREB fosforilado es estimulado por -MSH, que se une al elemento de consenso CRE en el promotor de Mitf para regular al alza la transcripción de Mitf [21–24].

En este estudio, los extractos de raíz KC (KCR), tallo (KCS), hoja (KCL) y fruto (KCF) se compararon exhaustivamente y se realizaron múltiples evaluaciones de sus propiedades fotoprotectoras y antimelanogénicas.

2. Materiales y métodos

2.1. Preparación de extractos de KC

Una planta KC 15 de tres años se cultivó en una maceta de plástico de 9 L en el campus de Miryang de la Universidad Nacional de Pusan. KC fue identificado por el profesor Young Whan Choi, el autor de este estudio. Estas muestras se depositaron como especímenes comprobantes (número de acceso KC-PDRL-1) en el herbario del Departamento de Biociencias Hortícolas, Facultad de Recursos Naturales y Ciencias de la Vida, Universidad Nacional de Pusan. Las plantas se regaron lo suficiente usando una solución nutritiva completa con un nivel de conductividad de 1.0 mS·cm−1 y que contenía los siguientes elementos (en me·L−1): NO3-N, 16; NH4-N, 1,34; P, 4; K, 8; Ca, 8; y S, 4. La bata KC en el puerto se cosechó en diciembre de 2020 clasificando raíces, tallos, hojas y frutos (Figura 1A). Las muestras recolectadas se liofilizaron inmediatamente en un liofilizador y se almacenaron en bolsas de vinilo a 20 ◦C hasta su análisis. Las raíces secas, tallos, hojas y frutos de KC (20 g) se molieron hasta obtener un polvo fino y se extrajeron a temperatura ambiente con alcohol etílico. Brevemente, la filtración y evaporación de los extractos de EtOH de KC se realizaron a presión reducida a 45 ◦C seguido de liofilización. Finalmente, el extracto sólido (50 mg/mL) se disolvió en sulfóxido de dimetilo (DMSO) para experimentos adicionales.

cistancheherba epimedium sagittatumextracto

2.2. Contenido total de polifenoles y flavonoides de los extractos de KC

Como se describió anteriormente [25], el contenido total de polifenoles y flavonoides de los extractos de raíces, tallos, hojas y frutos de KC se midió utilizando los métodos colorimétricos de Folin-Ciocalteu (polifenoles totales) y cloruro de aluminio (flavonoides). La absorbancia se midió a 700 nm (polifenoles totales) con Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, Reino Unido) y a 510 nm (flavonoides) con el lector de placas VICTOR Multilabel (Perkin-Elmer, Waltham, MA, EE. UU.) .

Se construyeron curvas estándar usando ácido gálico (polifenoles totales) y quercetina (flavonoide) como estándares, y los resultados se expresaron como equivalentes de ácido gálico por gramo (GAE/g) de extractos de raíz, tallo, hojas y frutos de KC y equivalente de quercetina por gramo (QE/g) de extractos de raíz, tallo, hoja y fruto de KC, respectivamente.

2.3. Ensayo DPPH y ABTS

Las actividades de captación de radicales DPPH y ABTS de los extractos de raíces, tallos, hojas y frutos de KC ({{0}}.5 mg/mL) se midieron de acuerdo con un método descrito previamente [25] con ligeras modificaciones. Se mezclaron extractos de raíz, tallo, hojas y frutos de KC (0,5 mg/mL) con solución de DPPH (60 µM) en microplacas. Después de agitar vigorosamente las muestras, se mantuvieron en la oscuridad a 25 ◦C durante 0,5 h. Se prepararon soluciones madre de ABTS 7 mM y persulfato de potasio 2,6 en agua destilada a temperatura ambiente en la oscuridad durante 18 horas. Los extractos de raíz, tallo, hoja y fruto de KC (0,5 mg/ml) se mezclaron con la solución de trabajo y luego se dejaron reposar durante 0,5 ha temperatura ambiente en la oscuridad. La absorbancia de las mezclas de muestra se controló a 510 nm (DPPH) o 734 nm (ABTS).

2.4. Cultivo de células

Los queratinocitos adheridos (HaCaT) y los melanocitos adheridos (B16F10) se inocularon en una solución de cultivo DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE. UU.) que contenía 10 % de FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE. Corporation, Carlsbad, CA, EE. UU.) y cultivadas a 37 ◦C con 5 por ciento de CO2. Se observó regularmente el crecimiento de células HaCaT y B16F10 adheridas, y el medio se cambió cada dos o tres días. Las células de la fase de crecimiento logarítmico se usaron para experimentos posteriores.

2.5. Irradiación UVA y UVB

Los queratinocitos se expusieron a radiación UVA o UVB (Bio-Link BLX-365, Villber-Lourmat, Eberhardzell, Alemania) con tubos 5 8 W que emiten la mayor parte de su energía en un pico de emisión a 365 nm ( UVA) o 312 nm (UVB). Las dosis de radiación UVA fueron de 20 J/cm2 y las dosis de radiación UVB fueron de 50 mJ/cm2.

2.6. Medición de la viabilidad celular y la citotoxicidad a través del análisis de CCK-8 y LDH

Para el análisis de viabilidad celular, se añadió la solución del kit de recuento celular-8 (CCK-8) del kit de ensayo CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) a los queratinocitos HaCaT. y suspensiones de células de melanoma B16F10 según las instrucciones del fabricante e incubadas a 37 ◦C durante 4 h. Brevemente, se sembraron células 2 104 en cada pocillo de una placa de 24-pocillos y se incubaron con 5 % de CO a 37 ◦C durante 24 h. Brevemente, se sembraron células 2 104 en cada pocillo de una placa de 24-pocillos y se incubaron con 5 % de CO a 37 ◦C durante 24 h. Después de 24 h de incubación, se añadió reactivo CCK-8 a cada pocillo y las células se incubaron más durante 4 h. Se utilizó un kit de detección de citotoxicidad (Roche Applied Science, Suiza) para determinar la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) extracelular en medio de cultivo de queratinocitos HaCaT. La absorbancia se analizó a 450 nm (CCK-8) y 490 nm (LDH) utilizando un lector de placas VICTOR Multilabel.

2.7. Evaluación de la producción de ROS intracelular en queratinocitos

Los niveles intracelulares de ROS se analizaron utilizando {{0}}(y-6)-clorometil-2′,7′-dicloruro- hidrofluoresceína diacetato acetil éster (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, después del tratamiento KC con otros extractos parciales (0.5 mg/ml), los queratinocitos (HaCaT) se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron con CM-H2DCFDA (5 µM) durante 0,5 h en la oscuridad. A partir de entonces, la generación de ROS intracelular se visualizó utilizando un microscopio de fluorescencia Carl Zeiss; la intensidad de la fluorescencia se midió con base en un tinte fluorescente (CM-H2DCFDA) utilizando un citómetro de flujo (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, EE. UU.).

2.8. Análisis de Apoptosis

Después de la exposición y el tratamiento, los queratinocitos HaCaT se tripsinizaron y centrifugaron. Posteriormente, se evaluó la apoptosis de las células obtenidas utilizando el kit de apoptosis de células muertas/anexina V de isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los queratinocitos se enjuagaron dos veces con PBS y los queratinocitos en el tampón de unión a anexina se obtuvieron y se mezclaron con FITC/Anexina V (componente A) y solución de trabajo de yoduro de propidio (PI). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 15 min en la oscuridad, se midió la apoptosis de los queratinocitos y se calculó el porcentaje de células apoptóticas utilizando un citómetro de flujo (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, EE. UU.). Se detectaron señales para los canales FL1 (FITC/Nexin V) y FL3 (PI), y se establecieron gráficos de puntos y tinción de marcador de cuadrante de las células teñidas.

2.9. Análisis del Contenido de Melanina Intracelular y Actividad Tirosinasa

El contenido de melanina intracelular y los ensayos de actividad de tirosinasa se midieron explicando dónde difería el procedimiento ligeramente modificado [24]. Los melanocitos se trataron con una concentración final de 0,5 µM -MSH y los 0,5 mg/mL KC de otros extractos parciales durante 48 h. Los sedimentos de melanocitos se lisaron con NaOH 1 N en DMSO al 10 por ciento a 80 ◦C durante 1 hora. El contenido relativo de melanina se determinó midiendo la absorbancia a 475 nm con un lector de placas VICTORMultilabel. La actividad de tirosinasa intracelular se determinó midiendo la tasa de producción de dopacromo utilizando L-DOPA. Los melanocitos se lavaron con PBS enfriado con hielo y se lisaron en PBS que contenía Triton X-100 al 1 por ciento (p/v). El sustrato de tirosinasa L-DOPA (2 mg/ml) se preparó en el mismo tampón de lisis de fosfato. Cada extracto se colocó en una 96-placa de pocillos y se inició el análisis enzimático añadiendo una solución de L-DOPA. Después de la incubación durante 1 h, se midió la absorbancia a 475 nm utilizando un lector de placas VICTOR Multilabel para analizar la producción de dopacromo. El valor de cada medida se expresó como un porcentaje del control. Se utilizó arbutina (A, 0,5 mg/ml) como control positivo.

Cistancheechinacósidoes un inhibidor de la tirosinasa.

2.10. PCR cuantitativa en tiempo real

El ARN total se aisló de cada grupo de melanocitos usando el RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania). La transcripción inversa se realizó utilizando el kit de transcripción inversa de cDNA de alta capacidad (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para obtener la primera cadena de cDNA. Luego, las hebras se usaron como plantillas para la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) usando un instrumento Bio-Rad Chromo4TM y una mezcla maestra de qPCR SYBR Green (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, EE. UU.). La PCR se realizó bajo desnaturalización previa a 95 ◦C durante 5 min, desnaturalización a 95 ◦C durante 15 s y recocido a 55–58 ◦C durante 30 s. El ARNm de GAPDH se utilizó como referencia interna para el ARNm de tirosinasa, TRP-1 y TRP-2. El valor relativo de la expresión del gen objetivo=2−∆∆CT. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: tirosinasa con sentido (5′-ggccagctttcaggcagaggt-3′), tirosinasa con sentido contrario (5′-tggtgcttcatgggc aaaatc-3′), TRP-1-sentido (5 ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-antisentido (5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-sentido (5′- tccagaagtttgacagccc-3 ′), TRP-2-antisentido (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-3′), GAPDH-sentido (5′-aggtggtctcctctgacttc-3′) y GAPDH-antisentido (5′-taccaggaaatgagcttgac -3′).

2.11. Transferencia occidental

Los melanocitos se recolectaron y lisaron utilizando un reactivo de extracción de proteínas de mamíferos (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las concentraciones de proteínas se determinaron utilizando un kit de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Luego, se añadió tampón de carga al sobrenadante de proteína y se mezcló. La mezcla se hirvió durante 10 min y las proteínas se separaron usando Mini-PROTEAN Precast Gels (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno Hybond (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE. UU.). La inmunodetección se realizó utilizando tirosinasa (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), CREB fosforilado (p-CREB 1: 1000), CREB (1:1000) y -tubulina (1:1000) (Tecnología de señalización celular, Beverly, MA, EE. UU.) con el kit SignalBoost Immunoreaction Enhancer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). La membrana se incubó durante la noche con los anticuerpos primarios a 4 ◦C. El anticuerpo secundario de cabra anti-conejo (IgG) (1:5000, Cell Signaling Technology) se añadió a la membrana y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Las bandas de proteína se observaron utilizando un sustrato de transferencia Western Pierce ECL mejorado (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se cuantificaron como la relación entre la intensidad de la banda de proteína diana y la intensidad de la banda de -tubulina.

2.12. Análisis estadístico

Todos los ensayos se repitieron de forma independiente al menos tres veces. Todos los parámetros estadísticos se presentan como el error estándar medio de la media (SEM). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, seguido de la prueba post-hoc de Dunn. Se consideró significativo un valor de p < 0.01="" o="" p=""><>

prueba de flavonoides

3. Resultados

3.1. Comparación de propiedades antioxidantes de varios extractos parciales de KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25,7 ± 2,1 por ciento) > KCF (8,7 ± 1,1 por ciento) (Figura 1E).

3.2. Comparación de queratinocitos viables y dañados tratados con varios extractos parciales de KC en presencia de UVA, UVB o sin irradiación

Realizamos los siguientes experimentos para explorar los efectos de los onqueratinocitos KCR, KCS, KCL y KCF. Primero, todos los extractos se aplicaron a los queratinocitos HaCaT en presencia de UVA, UVB o sin irradiación. El análisis CCK-8 mostró que los extractos no cambiaron significativamente la viabilidad de los queratinocitos en concentraciones de 0.5 mg/mL. Posteriormente, los queratinocitos se trataron con KCR, KCS, KCL y KCF en presencia de radiación UVA o UVB. La radiación UVA y UVB inhibió significativamente la viabilidad de los queratinocitos, como se muestra en el análisis CCK-8 en la Figura 2A. Sin embargo, encontramos que la viabilidad de los queratinocitos irradiados con UVA y UVB aumentó en el siguiente orden: KCL, KCR, KCS y KCF (Figura 2A). También monitoreamos los queratinocitos dañados midiendo la liberación de LDH extracelular. Los resultados mostraron que la irradiación UVA o UVB facilitó significativamente la liberación de LDH; sin embargo, KCL, KCR, KCS y KCF atenuaron significativamente la liberación de LDH con exposición a UVA o UVB en ese orden (Figura 2B). Los resultados experimentales anteriores mostraron que los efectos antiproliferativos y citotóxicos de la radiación UVA o UVB sobre los queratinocitos se aliviaron en el orden de KCL, KCR, KCS y KCF. En particular, KCL puede restaurar la viabilidad celular a niveles de control.

Figura 2. La viabilidad de los queratinocitos y los efectos de citotoxicidad del extracto de KCR, KCS, KCL y KCF en presencia de UVA, UVB o sin irradiación.

3.3. Comparación de la producción intracelular de ROS en queratinocitos tratados con varios extractos parciales de KC en presencia o ausencia de radiación UVA y UVB

Dado que la producción intracelular de ROS causa daño severo a los queratinocitos, se consideran mediadores potenciales del daño inducido por la radiación UVA o UVB. Varios estudios han sugerido que la radiación UVA o UVB induce la producción endógena de ROS [12,14]. Nuestro objetivo fue determinar si hubo un aumento en los niveles endógenos de ROS en los queratinocitos irradiados con UVA o UVB. En consecuencia, analizamos la intensidad de fluorescencia intracelular de la sonda CM-H2DCFDA mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. Como resultado de la microscopía de fluorescencia, las imágenes de tinción con CM-H2DCFDA mostraron una ligera tinción en los queratinocitos tratados con KCR, KCS, KCL y KCF de control y una tinción significativa en los queratinocitos irradiados con UVA o UVB (Figura 3A). De acuerdo con los resultados cuantificados de la citometría de flujo, la radiación UVA y UVB aumentó los niveles intracelulares de ROS en los queratinocitos en un 27,2 ± 4,5 por ciento y 34,1 ± 4,2 por ciento, respectivamente, en comparación con el control (5,7 ±0.2 por ciento). Además, de manera similar a los resultados de la microscopía de fluorescencia, se confirmó que los extractos de KC suprimieron el nivel de ROS intracelular en el orden de KCL > KCR > KCS > KCF en presencia de radiación UVA o UVB (Figura 3B). Estos resultados indican que varios extractos parciales de KC inhibieron significativamente el daño de los queratinocitos al reducir los niveles endógenos de ROS.

Figura 3. Efecto del extracto de KCR, KCS, KCL y KCF en la producción de ROS intracelular en queratinocitos UVA, UVB o no irradiados

3.4. Comparación de la Apoptosis de Queratinocitos Tratados con Varios Extractos Parciales de KC en Presencia o Ausencia de Irradiación UVA y UVB

Para detectar la apoptosis, que es un indicador fiable del daño de los queratinocitos, los queratinocitos se tiñeron con anexina V en combinación con yoduro de propidio. El isotiocianato de fluoresceína (FITC) Anexina V/Kit de apoptosis de células muertas se utilizó para probar la tasa de apoptosis en los queratinocitos. La irradiación UVA y UVB facilitó la actividad de tinción de Anexina V, mientras que KCR, KCS, KCL y KCF redujeron la tasa de actividad de tinción de Anexina V en presencia de irradiación UVA y UVB. KCR, KCS, KCL y KCF solos (0,5 mg/mL) no indujeron la actividad de tinción de Anexina V. Los datos cuantificados de la citometría de flujo mostraron que la radiación UVA y UVB aumentó los niveles de apoptosis de los queratinocitos en un 46,3± 1,5 por ciento y 48,7 ± 1.0 por ciento, respectivamente, en comparación con el control (5.0 por ciento ± 0.7 por ciento). Es importante destacar que se confirmó que los extractos de KC suprimieron el nivel de apoptosis en el orden de KCL > KCR > KCS > KCF en presencia de radiación UVA o UVB (Figura 4A,B). En general, la irradiación UVA y UVB causó daño a los queratinocitos y varios extractos parciales de KC atenuaron el daño a los queratinocitos inducido por la radiación UV.

Figura 4. Efecto de los extractos de KCR, KCS, KCL y KCF sobre la apoptosis en queratinocitos UVA, UVB o no irradiados.

3.5. Comparación del contenido de melanina intracelular y la actividad de tirosinasa de melanocitos tratados con varios extractos parciales de KC en presencia o ausencia de tratamiento con -MSH

Antes de investigar el potencial biológico de KCR, KCS, KCL y KCF en la melanogénesis inducida por MSH, se evaluó la viabilidad celular después del tratamiento con KCR, KCS, KCL y KCF (0.5 mg/mL) utilizando el ensayo CCK-8 en melanocitos B16F10 con o sin -MSH. KCR, KCS, KCL y KCF (0,5 mg/ml) no alteraron la viabilidad celular en presencia o ausencia de -MSH (Figura 5A). -MSH es un agente melanogénico importante que puede aumentar el contenido de melanina intracelular uniéndose al receptor de melanocortina 1 y activando la adenilato ciclasa. Para investigar el efecto de KCR, KCS, KCL y KCF sobre la melanogénesis en los melanocitos, se determinó el contenido de melanina intracelular mediante observación visual y mediciones bioquímicas. Como se muestra en la Figura 5B, el contenido de melanina intracelular aumentó significativamente con -MSH. Sin embargo, el tratamiento conjunto con KCR, KCS, KCL y KCF mostró una reducción notable en el contenido de melanina intracelular en comparación con el tratamiento con -MSH. La secuencia de medidas bioquímicas que indicaron la inhibición del contenido de melanina intracelular fue la siguiente: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 5B). El ensayo de actividad de tirosinasa intracelular se realizó de acuerdo con el ensayo de contenido de melanina intracelular. La actividad de tirosinasa intracelular de los melanocitos estimulados con -MSH aumentó, mientras que la de los melanocitos estimulados con -MSH tratados con KCR, KCS, KCL y KCF disminuyó. La secuencia de medidas bioquímicas que indican la inhibición de la actividad de tirosinasa intracelular fue la siguiente: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 5C). Estos resultados indican que varios extractos parciales de KC redujeron significativamente el contenido de melanina intracelular e inhibieron la actividad tirosinasa sin alterar la viabilidad celular.

3.6. Comparación de los niveles de transcripción y traducción de tirosinasa, TRP-1 y TRP-2 en melanocitos tratados con varios extractos parciales de KC en presencia o ausencia de-Tratamiento MSH

Para explorar el efecto de KCR, KCS, KCL y KCF en la regulación negativa de los niveles de expresión de proteínas y ARNm de los marcadores de melanogénesis (tirosinasa, TRP-1 y TRP-2), los melanocitos se trataron con KCR , KCS, KCL y KCF en presencia o ausencia de -MSH. Como se muestra en la Figura 6A–C, los niveles de ARNm de tirosinasa, TRP-1 y TRP-2 aumentaron significativamente con el tratamiento con -MSH. Por el contrario, en comparación con el tratamiento -MSH, KCR, KCS, KCL y KCF regularon a la baja la expresión de ARNm de tirosinasa, TRP-1 y TRP-2. Además, KCR, KCS, KCL y KCF solos no tuvieron un efecto significativo en los niveles de ARNm de tirosinasa, TRP-1 y TRP-2. El análisis de transferencia Western se realizó en cooperación con PCR en tiempo real. Los resultados mostraron que el tratamiento con -MSH aumentó los niveles de expresión de proteínas de tirosinasa, TRP-1 y TRP-2 y estos niveles se redujeron con el tratamiento conjunto con KCR, KCS, KCL y KCF (Figura 6D ). La secuencia de PCR cuantitativa en tiempo real y western blot que indica la inhibición de la expresión de proteínas y mRNA de TRP-1 y TRP-2 fue la siguiente: KCL > KCR=KCS > KCF (Figura 6). Estos resultados sugieren que varios extractos parciales de KC tienen el potencial de promover la antimelanogénesis, lo que se demostró mediante la regulación a la baja de los marcadores de melanogénesis.

3.7. Comparación de la expresión de MITF y la fosforilación de CREB de melanocitos tratados con varios extractos parciales de KC en presencia o ausencia de tratamiento con -MSH

La tirosinasa, TRP-1 y TRP-2 son esenciales en la melanogénesis. Su expresión está regulada por la fosforilación de MITFexpression y CREB [17,21]. El análisis de transferencia Western indicó que KCR, KCS, KCL y KCF inhibieron eficazmente el aumento en el nivel de proteína de MITF causado por el tratamiento con -MSH. Además, KCR, KCS, KCL y KCF solos apenas detectaron la expresión de la proteína MITF. La secuencia de los resultados de Western blot cuantificados que indican la inhibición de los niveles de expresión de la proteína MITF fue la siguiente: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 7A). Además, KCR, KCS, KCL y KCF revirtieron los efectos del tratamiento con -MSH en la fosforilación de CREB. KCR, KCS, KCL y KCF solos tuvieron poco efecto sobre la fosforilación de CREB. La secuencia de resultados de Western blot cuantificados que indican la inhibición de los niveles de fosforilación de CREB fue la siguiente: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 7B). Estos resultados indicaron que varios extractos parciales de KC suprimieron la melanogénesis en los melanocitos, al menos en parte, a través de la expresión de MITF y la fosforilación de CREB.

4. Discusión

La popularidad del blanqueamiento de la piel está aumentando en todo el mundo debido al aumento de la radiación UV, y es probable que alcance altas proporciones en las próximas décadas con fines estéticos [8]. Los numerosos tipos de blanqueadores, como el ácido kójico y la arbutina, se han utilizado en los mercados cosmético y farmacéutico. Además, los extractos naturales están recibiendo una atención cada vez mayor debido a su potencial antioxidante, antiinflamatorio, antitumoral, antibacteriano y otras actividades [26,27]. En base a las características antioxidantes y fotoprotectoras y antimelanogénicas, se han desarrollado varios candidatos cosméticos y farmacéuticos. Es bien sabido que estas propiedades de los candidatos blanqueadores son contribuyentes indispensables para la investigación y el desarrollo cosmético y farmacéutico [28]. TDM tiene propiedades de múltiples componentes y múltiples objetivos y mejora en gran medida la eficacia biológica humana y la calidad de vida [29]. La investigación fitoquímica moderna muestra que KC contiene una variedad de ingredientes, siendo los lignanos y los terpenoides los ingredientes principales [30]. Se han identificado más de 202 compuestos, incluidos los lignanos de dibenzociclooctadieno, los lignanos de dibenzociclooctadieno espirobenzofuranoide, los lignanos de arilnaftaleno, los triterpenoides de cadlongilactona y los sesquiterpenoides [31,32]. Las raíces secas, los tallos y las hojas de KC tienen una amplia tradición de uso en TDM para tratar la artritis reumatoide, las úlceras duodenales, los trastornos gastrointestinales y los problemas ginecológicos. Las raíces secas de KC, con acciones de depuración de calor y eliminación de toxinas, induciendo diuresis para eliminar edemas. Las frutas de KC se consumen principalmente en forma de frutas frescas, jugos y vino de frutas, lo que indica que son beneficiosas para la salud humana [7,33,34]. Estudios previos también han demostrado que es rico en ingredientes bioactivos como lignanos, triterpenoides, flavonoides, ácidos fenólicos, esteroides y aminoácidos, que tienen un alto valor nutricional y medicinal [3,35]. En este estudio, se extrajeron diferentes partes de KC. En particular, los contenidos totales de polifenoles y flavonoides de las hojas y raíces de KC fueron mucho más altos que los de los tallos y frutos. Las hojas y las raíces contienen más del doble de polifenoles y flavonoides que los tallos y las frutas. Como resultado, consideramos que los polifenoles totales y los flavonoides contribuyen significativamente a los efectos fotoprotectores y antimelanogénicos de KC.

La fototoxicidad cutánea causada por la radiación UV se debe principalmente a la citotoxicidad celular, la acumulación intracelular de ROS y la apoptosis en los queratinocitos. Por lo tanto, es más razonable centrarse en la inhibición de la citotoxicidad celular, la acumulación intracelular de ROS y la apoptosis en queratinocitos irradiados con UVA y UVB [36,37]. Como se describe en este estudio [10,38], los resultados de la intervención con extractos de KC sobre la fotocitotoxicidad (UVA: 20 J/cm2, UVB: 50 mJ/cm2) mostraron que los extractos de KC redujeron significativamente la citotoxicidad celular, la acumulación de ROS intracelular y apoptosis. De acuerdo con los resultados anteriores, los efectos fotoprotectores de las hojas y raíces de KC fueron mucho mayores que los del tallo y la fruta. Además, nuestros resultados indicaron que los extractos de KC muestran los efectos mencionados anteriormente al promover la actividad antioxidante. La melanogénesis a menudo se observa después de la radiación UV y se asocia principalmente con pigmentación o hiperpigmentación [39]. Según estudios previos, el método de inducción de la melanogénesis usando -MSH ha sido ampliamente reconocido y aplicado. Por lo tanto, este estudio se basó en la construcción de un modelo de melanocitos estimulados con -MSH [24,39]. Encontramos que los extractos de KC suprimieron el contenido de melanina intracelular estimulado por MSH y la actividad de tirosinasa. Además, los extractos de KC regularon a la baja la transcripción y traducción de marcadores de melanogénesis como tirosinasa, TRP-1 y TRP-2 en melanocitos estimulados con -MSH. Además, investigamos la expresión de la proteína MITF y la fosforilación de CREB en melanocitos estimulados por -MSH. De manera similar, en este estudio, encontramos que los extractos de KC suprimieron la expresión de la proteína MITF mediada por MSH y la fosforilación de CREB en los melanocitos. De acuerdo con los resultados fotoprotectores, los efectos antimelanogénicos de las hojas y raíces de KC fueron mucho mayores que los de los tallos y frutos.

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5. Conclusiones

En general, en este estudio se encontraron los posibles efectos fotoprotectores y antimelanogénicos del extracto de KC. El extracto de KC con un alto contenido de polifenoles y flavonoides puede ejercer efectos fotoprotectores y antimelanogénicos en los queratinocitos y melanocitos. Este estudio proporciona una estrategia de investigación y una justificación para las intervenciones cosméticas y farmacéuticas para el blanqueamiento natural y los agentes fotoprotectores.