Los polisacáridos de Cistanche Deserticola alivian el deterioro cognitivo en ratones modelo que envejecen al restaurar el eje microbiota intestinal-cerebro

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

Yuan Gao 1*, Bing Li 1*, Hong Liu 1, Yajuan Tian 2, Chao Gu 1, Xiaoli Du 1, Ren Bu 1, Jie Gao 1, Yang Liu 1, Gang Li 1

RESUMEN

La evidencia reciente sugiere que las alteraciones en el eje microbiota intestinal-cerebro pueden conducir al deterioro cognitivo con el envejecimiento. En el presente estudio, observamos que la administración prolongada de D-galactosa a ratones indujo deterioro cognitivo, disbiosis microbiana intestinal, inflamación periférica y estrés oxidativo. En este modelo de deterioro cognitivo relacionado con la edad,Cistanche deserticola polisacáridos(CDPS) mejoró la función cognitiva en ratones tratados con D-galactosa al restaurar la homeostasis microbiana intestinal, reduciendo así el estrés oxidativo y la inflamación periférica. Los efectos beneficiosos de CDPS en estos modelos de ratones envejecidos se eliminaron mediante la ablación de la microbiota intestinal con antibióticos o la inmunosupresión con ciclofosfamida. El perfil metabolómico sérico mostró que los niveles de creatinina, valina, L-metionina, o-toluidina, N-etilanilina, ácido úrico y prolina estaban todos alterados en los ratones modelo envejecidos, pero fueron restaurados por CDPS. Estos hallazgos demostraron que CDPS mejora la función cognitiva en un modelo de envejecimiento inducido por D-galactosa en ratones al restaurar la homeostasis del eje microbiota-cerebral intestinal, lo que alivió el desequilibrio de aminoácidos, la inflamación periférica y el estrés oxidativo. Por lo tanto, CDPS muestra potencial terapéutico para pacientes con trastornos de la memoria y el aprendizaje, especialmente aquellos relacionados con la disbiosis microbiana intestinal.

Cistanche deserticapolisacáridos

INTRODUCCIÓN

La administración prolongada de D-galactosa (D-gal) y sales de berilio induce el envejecimiento en modelos animales experimentales y cultivos celulares primarios in vitro y se utiliza para identificar los mecanismos subyacentes al proceso natural de envejecimiento [1–4]. Estudios previos muestran que el deterioro cognitivo en ratones modelo de envejecimiento inducido por D-galactosa está relacionado con niveles reducidos de proteína del factor de crecimiento nervioso (NGF) y aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el cerebro, los cuales causan la degeneración de las neuronas del hipocampo y reducen neurogénesis [3, 4]. Estudios recientes también han demostrado que la composición y el número de la microbiota intestinal humana cambian significativamente durante el proceso de envejecimiento [5].

Cistanche deserticaes una hierba que crece principalmente en la región desértica del noroeste de China y se usa en la medicina tradicional china. Es comúnmente conocido como "ginseng del desierto". Los extractos de Cistanche deserticola contienen varios compuestos farmacológicamente activos, incluidos glucósidos feniletanoides, iridoides, lignosa, oligosacáridos, polisacáridos y aminoácidos; estos compuestos están asociados con propiedades antiinflamatorias, antioxidantes, antisenescentes, neuroprotectoras e inmunomoduladoras [6, 7]. Por ejemplo, los polisacáridos extraídos de Cistanche deserticola se han utilizado en la medicina tradicional china para tratar el cáncer colorrectal [8]. Se ha aislado una amplia gama de polisacáridos débilmente tóxicos con bioactividades útiles de varios organismos, como el polisacárido de Chuanqiong, el polisacárido de Ganoderma lucidum y el polisacárido de Lycium barbarum [9-11]. CDA-

0.05 es un galactoglucano aislado de Cistanche deserticola que promueve el crecimiento de varias bacterias intestinales beneficiosas, incluidas varias especies de Bacteroides y Lactobacillus [12].

Los mecanismos subyacentes del proceso de envejecimiento normal también están implicados en varias enfermedades humanas, como los trastornos neurodegenerativos, la aterosclerosis coronaria, la diabetes tipo 2 (T2DM) y la hipertensión [13, 14]. Estudios recientes han demostrado que los cambios en la flora intestinal juegan un papel importante en el envejecimiento humano [15]. Varios estudios han demostrado que la administración prolongada de D-galactosa en ratones y ratas experimentales imita el proceso normal de envejecimiento y es un modelo útil para estudiar los fenotipos relacionados con el envejecimiento, como la disminución de la cognición [16]. Además, los ratones modelo de envejecimiento inducido por D-galactosa muestran cambios en la composición de la microbiota intestinal [17]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que los cambios en la composición de la microbiota intestinal pueden causar un deterioro cognitivo en los ratones modelo de envejecimiento inducido por D-galactosa, e investigamos si los polisacáridos de Cistanche deserticola (CDPS) pueden aliviar el deterioro cognitivo al restaurar la disbiosis de la microbiota intestinal.

Cistanche desertica

RESULTADOS

Los ratones modelo de envejecimiento inducido por D-galactosa demuestran deterioro cognitivo y disbiosis microbiana intestinal

Analizamos el rendimiento del comportamiento de los ratones de tipo salvaje (WT) y los tratados con 150 mg D-gal por kg de peso corporal durante 2 meses (modelo o Mod) utilizando pruebas de reconocimiento de objetos novedosos y laberinto de agua de Morris (MWM). Los valores del índice preferencial en la nueva prueba de reconocimiento de objetos se redujeron significativamente en los ratones del grupo Mod en comparación con los ratones del grupo WT (Figura 1A, 1B). Los resultados de la prueba MWM mostraron que el tiempo de latencia de escape después del sexto día aumentó significativamente en el grupo Mod en comparación con el grupo WT (Figura 1C, 1D). Además, los cruces de la plataforma objetivo y los tiempos de nado dentro del cuadrante objetivo se redujeron significativamente en el grupo Mod en comparación con el grupo WT (Figura 1E, 1F). Estos resultados demostraron una disminución significativa en las capacidades de aprendizaje y memoria de los ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal.

Luego analizamos las diferencias en la abundancia y composición de los filos, géneros y especies microbianos intestinales en las muestras fecales de los grupos de ratones Mod y WT utilizando datos de secuenciación de ARN ribosómico (ARNr) 16S de muestras fecales. La flora intestinal predominante en los ratones del grupo WT y Mod fue Firmicutes y Bacteroides. Sin embargo, la abundancia de Bacteroides se redujo significativamente y la abundancia de Firmicutes aumentó significativamente en el grupo Mod en comparación con el grupo WT (Figura 2A). A continuación, realizamos un análisis discriminante lineal (LDA) para determinar las puntuaciones del tamaño del efecto LDA (LEfSe), seguido de las pruebas de Kruskal-Wallis y Wilcoxon para evaluar la abundancia relativa de diferentes taxones en los ratones del grupo WT y Mod. Los resultados de LDA se muestran en la Figura 2B. Además, construimos cladogramas que muestran el enriquecimiento diferencial de varios géneros y especies pertenecientes a los filos Bacteriodes y Firmicutes en los grupos WT y modelo (Figura 2C). En general, nuestros resultados demostraron una capacidad cognitiva deteriorada y disbiosis microbiana intestinal en los ratones modelo de envejecimiento inducido por D-galactosa.

El tratamiento con CDPS mejora la capacidad cognitiva en ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal

Analizamos si el tratamiento con CDPS alivia el deterioro cognitivo en ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal. Durante el

A los 2 meses de la administración, se midió el peso corporal en días alternos. Los pesos corporales de los grupos modelo y CDPS de ratones fueron similares (Figura 3A). Realizar experimentos de comportamiento después de la última dosis. Los resultados de la prueba de reconocimiento de objetos novedosos y del laberinto acuático de Morris mostraron que la memoria a corto plazo era significativamente mayor en los grupos de ratones CDPS en comparación con el grupo modelo de ratones; la memoria a largo plazo en el grupo de ratones CDPS fue mayor pero estadísticamente insignificante en comparación con el grupo modelo de ratones (Figura 3B, 3C). Esto sugirió que el tratamiento con CDPS anuló la pérdida de memoria de reconocimiento de objetos a corto plazo en ratones tratados con D-gal.

El aprendizaje espacial y la memoria de estos ratones se evaluaron mediante la prueba del laberinto acuático de Morris, y los resultados mostraron que los tiempos de latencia de escape del grupo de ratones CDPS fueron comparables a los del grupo de ratones WT y significativamente más cortos que los de los ratones del grupo Mod (Figura 3D ). Además, los tiempos de latencia de escape fueron significativamente más bajos en el sexto día posterior a la administración de CDPS en comparación con el grupo modelo (Figura 3E). El tiempo de natación dentro del cuadrante objetivo fue significativamente mayor en los grupos CH y CM en comparación con el grupo modelo. El grupo CL es más alto que el grupo modelo, pero no tiene significación estadística (Figura 3F). Además, el número de cruces de plataforma fue significativamente mayor en los grupos CM y CL en comparación con el grupo modelo. Sin embargo, el grupo CH es más alto que el grupo modelo y no tiene significancia estadística (Figura 3G). Estos resultados demostraron que el tratamiento con CDPS mejoró el aprendizaje espacial y la memoria en los ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal.

El tratamiento con CDPS restaura la homeostasis de la composición de la microbiota intestinal en ratones modelo de envejecimiento con D-galactosa

Los monosacáridos y polisacáridos son los nutrientes esenciales necesarios para el crecimiento de bacterias [18-21]. También se informa que CDPS regula la composición de la microbiota intestinal [22]. Por lo tanto, analizamos si los tratamientos con CDPS aliviaron la disbiosis microbiana intestinal en los ratones del grupo modelo evaluando los datos de secuenciación de 16S rRNA de muestras de heces de los grupos de ratones WT, modelo y CDPS.

Primero, calculamos los índices de diversidad alfa para evaluar la riqueza general de la microbiota fecal y la diferencia estructural entre estos grupos. Analizamos los índices de diversidad alfa (-diversidad) como las especies observadas, Shannon, Chao 1, ACE y los valores del índice de Simpson para determinar los cambios en la composición de varias especies bacterianas en las muestras de heces de diferentes grupos murinos. Los índices de diversidad (especies observadas, índices de Shannon, Chao 1, ACE y Simpson) fueron más altos en los grupos de ratones WT y CDPS en comparación con el grupo modelo, pero solo se observó significación estadística para los valores del índice Chao 1 entre los ratones CM grupo y grupo Mod. Indicó que la administración con CDPS aumenta la riqueza del microbioma (Figura 4A–4E). A continuación, analizamos los índices de diversidad para identificar las diferencias en las especies microbianas intestinales entre los grupos de ratones WT, modelo y CDPS mediante el escalado multidimensional no métrico (NMDS), el análisis de coordenadas principales (PCoA) y el análisis de componentes principales ( ACP). PCA mostró variaciones en la composición microbiana intestinal de los ratones del grupo modelo durante el proceso de envejecimiento, incluida la reducción de dimensiones y el mantenimiento de patrones y tendencias (Figura 4F). Las diferencias en la microbiota fecal entre los grupos WT, modelo y CDPS se identificaron en función de PCoA de las distancias UniFrac no ponderadas para los genes 16S rRNA (Figura 4G). El análisis de agrupamiento mostró diferencias significativas en NMDS entre el grupo modelo y los grupos WT y CDPS (Figura 4H).

Evaluamos los 10 filos principales de la microbiota intestinal y descubrimos que la abundancia de los filos Bacteroides fue significativamente mayor en el grupo CH, CM y CL en comparación con el grupo modelo (Figura 4I). Esto sugirió que CDPS restauró la homeostasis de la microbiota intestinal en ratones tratados con D-gal. Los cladogramas mostraron un enriquecimiento diferencial de varios géneros y especies pertenecientes a los filos Bacteriodes y Firmicutes en los grupos WT, modelo y CDPS (Figura 4J). Como se muestra en los mapas de calor, los tratamientos con CDPS redujeron las abundancias relativas de Thermoplasmata, Bacilli, Actinobacteria, Fusobacteriia y Elusimicrobia no identificados y aumentaron las abundancias relativas de Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, _Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae no identificados. , Erysipelotrichia y _cianobacterias no identificadas en comparación con el grupo modelo (Figura 4K). Estos resultados demostraron que el tratamiento con CDPS restauró significativamente la homeostasis de la microbiota intestinal en los ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal.

El tratamiento con CDPS alivia la neurodegeneración en ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal al reducir el estrés oxidativo

A continuación, analizamos los efectos de CDPS en la inflamación analizando los niveles séricos de citoquinas proinflamatorias (IL-2 y TNF- ) y citoquinas antiinflamatorias (IL-4 e IL-10 ) en diferentes grupos de ratones. Los niveles séricos de IL-2 y TNF- fueron significativamente más bajos y los niveles séricos de IL-4 e IL-10 fueron significativamente más altos en el grupo CH, CM y CL en comparación con el modelo grupo. Se muestra que CDPS tiene efectos antiinflamatorios (Figura 5A-5D).

El estrés oxidativo es causado por el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y es uno de los principales factores que promueven el envejecimiento [23]. Por lo tanto, analizamos los efectos de CDPS sobre el estrés oxidativo en el modelo de ratón de envejecimiento inducido por D-gal mediante la evaluación de los niveles séricos de la enzima antioxidante, SOD, y el producto de peroxidación lipídica, malondialdehído (MDA). Los niveles séricos de MDA fueron significativamente más altos y los niveles séricos de SOD se redujeron significativamente en el grupo Mod en comparación con el grupo WT, pero el tratamiento con CDPS revirtió estos efectos (Figura 5E, 5F). Estos resultados demostraron que el estrés oxidativo se elevó en los ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal, pero se redujo con el tratamiento con CDPS.

Además, evaluamos los niveles de estrés oxidativo en los tejidos cerebrales analizando los niveles del producto de proteína oxidada avanzada (AOPP), la peroxidación lipídica directa (LPO) y MDA, así como las actividades de enzimas antioxidantes como la glutatión peroxidasa (GSH-Px ) y superóxido dismutasa (SOD) en los homogeneizados de tejido cerebral. Los cerebros de los ratones del grupo Mod mostraron actividades significativamente reducidas de SOD y GSH-PX y niveles significativamente mayores de AOPP, LPO y MDA en comparación con el grupo WT, pero estos efectos se revirtieron en el grupo CH, CM y CL (Figura 6A– 6E).

Además, realizamos la tinción histológica de la sección del cerebro con tinciones de H&E y Nissl para evaluar los efectos protectores de CDPS en los cerebros de ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal. Los ratones del grupo Mod mostraron una reducción significativa en el número y el volumen de las neuronas, una mayor brecha entre las neuronas, disposición irregular de las neuronas y picnosis nuclear en la región CA1 del hipocampo en comparación con el grupo WT, pero estos cambios patológicos se redujeron significativamente con los tratamientos con CDPS ( Figura 6F). Estos resultados demostraron que los tratamientos con CDPS redujeron significativamente el estrés oxidativo y la patología cerebral en los ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal.

El tratamiento con CDPS reduce la inflamación periférica y el estrés oxidativo al mantener la homeostasis microbiana intestinal en ratones modelo inducidos por D-gal

A continuación, analizamos si los cambios en la composición de la microbiota intestinal estaban asociados con un aumento de la inflamación periférica y el estrés oxidativo durante el envejecimiento. Para ello, utilizamos un cóctel de triple antibiótico (grupo ABX) o ciclofosfamida (grupo Cy; consulte también Materiales y métodos) para eliminar la microbiota intestinal o inducir la inmunosupresión en los ratones modelo de envejecimiento tratados con CDPS. El tratamiento con antibióticos anuló los efectos beneficiosos del tratamiento con CDPS en los ratones modelo envejecidos. Observamos problemas de aprendizaje y memoria (Figura 7A) y alteraciones en la composición de la microbiota intestinal (Figura 7B, 7C) en los ratones del grupo ABX en comparación con el grupo tratado con CDPS. Los resultados anteriores indican que incluso la administración de CDPS no puede aumentar la capacidad de aprendizaje y memoria de los ratones después de cambiar la flora intestinal. Además, observamos mayores niveles de citocinas proinflamatorias en el cerebro y el suero de los ratones del grupo ABX en comparación con el grupo CDPS (Figura 7D-7N). Los resultados del grupo ABX y el grupo CY mostraron que después de que se destruyeron la flora intestinal y la función inmune, incluso la administración de CDPS no pudo mejorar la capacidad de aprendizaje y memoria de los ratones. Estos resultados sugirieron que el tratamiento con CDPS disminuyó la inflamación periférica, el estrés oxidativo y el deterioro cognitivo en los ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal al prevenir la disbiosis intestinal.

Luego usamos el fármaco inmunosupresor ciclofosfamida [24] para determinar el papel de la inflamación en los efectos beneficiosos del CDPS. Los ratones CDPS tratados con ciclofosfamida (grupo Cy) mostraron deterioro de la capacidad de aprendizaje y memoria, alteraciones en la composición de la microbiota intestinal y niveles aberrantes de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias en el cerebro y el suero en comparación con los ratones de tipo salvaje y del grupo CDPS. Sin embargo, no hay significación en comparación con el modelo y el grupo ABX. (Figura 7A–7N). Estos datos demuestran que las alteraciones en la composición de la microbiota intestinal aumentan la inflamación periférica en los ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal.

CDPS previene el envejecimiento inducido por D-gal al regular el metabolismo de los aminoácidos

El sistema inmunitario del huésped está influenciado por metabolitos generados por la microbiota intestinal [25]. Los metabolitos fecales representan una lectura funcional del metabolismo microbiano intestinal y la composición microbiana intestinal [26]. Además, los metabolitos de la microbiota intestinal entran en la circulación sanguínea y afectan el metabolismo y la salud del huésped [26, 27]. Se identificaron un total de 1058 metabolitos en muestras de suero de ratones fWT, Mod y CDPS. Luego, analizamos estos metabolitos utilizando BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) y Human Metabolome Database (HMDB) y encontramos que 65 metabolitos se expresaron diferencialmente en el grupo Mod en comparación con el grupo WT. Además, encontramos que los niveles de 8 metabolitos (creatinina, valina, L-(-)-metionina, o-toluidina, N-etilanilina, ácido úrico, prolina y fenilalanina) diferían significativamente entre los grupos WT, Mod y CDPS . El análisis de enriquecimiento de la ruta de estos 8 metabolitos usando MetaboAnalyst [28, 29] mostró que estos metabolitos estaban relacionados con el metabolismo de la arginina, histidina, arginina, prolina y purina (Figura 8A, 8B). 7 metabolitos diferentes del grupo MOD y del grupo CDPS en el grupo WT.

Luego analizamos si los cambios en el metabolismo de los aminoácidos estaban relacionados con alteraciones en la composición de la microbiota intestinal. Observamos que 7 metabolitos diferentes de los grupos WT, Mod y CDPS (creatinina, valina, L-(-)-metionina, o-toluidina, N-etilanilina, ácido úrico y prolina) se redujeron significativamente en el ABX, Cy, y grupos Mod en comparación con los grupos WT y CDPS. Además, no hay importancia entre los grupos ABX y Cy (Figura 8C). Finalmente, para explorar existe una correlación entre el metabolismo diferencial y otras enfermedades relacionadas con el envejecimiento. Analizamos la correlación entre estos siete metabolitos expresados ​​diferencialmente y las enfermedades humanas utilizando la base de datos MetaboAnalyst y encontramos que estos metabolitos estaban asociados con la enfermedad de Alzheimer (p=0.00173; Figura 8D, 8E). En general, estos datos sugirieron que CDPS protege contra el envejecimiento inducido por D-gal al regular el metabolismo de los aminoácidos.

DISCUSIÓN

Una disminución progresiva de la función cognitiva es un rasgo característico del envejecimiento. Estudios previos mostraron que el tratamiento con CDPS mejoró significativamente el aprendizaje y la memoria en los modelos de ratones envejecidos [30–33]. En este estudio, demostramos que el tratamiento con CDPS mejoró la función cognitiva al inhibir la inflamación periférica y el estrés oxidativo a través de la restauración de la homeostasis microbiana intestinal en ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal (Figura 9). Las ratas Sprague-Dawley alimentadas con polisacáridos Cistanche mostraron un mayor crecimiento de bacterias intestinales beneficiosas y una mayor diversidad microbiana intestinal [34]. CDA-0.05, un polisacárido neutro de Cistanche, mejoró el crecimiento de los probióticos Lactobacilli [22]. Estos datos sugirieron que los polisacáridos de Cistanche mejoraron la homeostasis de las bacterias intestinales.

En este estudio, demostramos que CDPS tiene efectos antiinflamatorios y mejora la capacidad cognitiva de los ratones modelo que envejecen al modular la abundancia de géneros bacterianos intestinales como Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria. Por lo tanto, las CDP pueden ser terapéuticamente beneficiosas para las enfermedades relacionadas con el envejecimiento al remodelar la composición de la microbiota intestinal [35, 36]. Además, estudios previos han demostrado que los niveles de citocinas inflamatorias en el suero y el colon están asociados con la abundancia relativa de géneros bacterianos como Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria [37, 38]. Además, la composición microbiana intestinal regula la función cerebral mediante la modulación de los niveles circulantes de varias citocinas [39–43]. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con CDPS disminuyó la abundancia relativa de Thermoplasmata, Bacilli, Actinobacteria, Fusobacteriia y Elusimicrobia no identificados, y aumentó la abundancia relativa de Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, _Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae, Erysipelotrichia y _cianobacterias no identificadas.

Los metabolitos microbianos intestinales se liberan en el torrente sanguíneo y regulan la salud y el metabolismo del huésped [26, 27]. Los metabolitos microbianos intestinales se pueden estimar mediante la evaluación de la composición de metabolitos fecales, que cambia con las alteraciones en la composición de los microbios intestinales [44]. Estudios recientes han demostrado que los niveles plasmáticos de citrulina, prolina, arginina, asparagina, fenilalanina y treonina están asociados con trastornos neurodegenerativos, incluida la enfermedad de Alzheimer [45, 46]. Nuestro estudio mostró que los niveles séricos de creatinina, valina, L-metionina, o-toluidina, N-etilanilina, ácido úrico y prolina se asociaron con el envejecimiento inducido por D-gal en ratones.

Los brazos innato y adaptativo del sistema inmunitario desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis microbiana del huésped en la superficie luminal intestinal [47]. La microbiota intestinal también juega un papel importante en la regulación del sistema nervioso central (SNC) y la inmunidad mediante la liberación de citocinas y metabolitos en el torrente sanguíneo [48, 49]. Las citoquinas proinflamatorias juegan un papel clave en varias enfermedades neurodegenerativas [50-52]. Por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y el glaucoma están asociados con la acumulación extracelular de amiloide (A) y el depósito intracelular de tau hiperfosforilada (p-tau) y hierro en las células ganglionares de la retina (RGC) [44]. Además, la inflamación juega un papel importante en la patogenia asociada con el glaucoma [53]. La discapacidad visual es un síntoma temprano de la enfermedad de Alzheimer (EA) y se manifiesta antes del inicio del deterioro cognitivo [54]. Nuestro estudio demostró que CDPS protege contra el deterioro cognitivo y la inflamación periférica al mantener la homeostasis de la microbiota intestinal.

Existen varias limitaciones en este estudio. En primer lugar, no se conoce bien la relación entre el metabolismo de los aminoácidos y la composición de la microbiota intestinal. En segundo lugar, se desconoce la composición y estructura molecular de CDPS. Por lo tanto, se requieren estudios futuros para explorar más a fondo el papel regulador de CDPS en el alivio de la EA a través del eje de señalización microbiota intestinal-cerebro.

En conclusión, nuestro estudio demostró que CDPS mejoró la capacidad cognitiva en ratones modelo de envejecimiento inducido por D-gal al restaurar la homeostasis de la microbiota intestinal, restaurando así el desequilibrio de aminoácidos, la inflamación periférica y el estrés oxidativo. Estos hallazgos sugieren que CDPS es un potencial terapéutico para pacientes con trastornos del aprendizaje y la memoria, especialmente aquellos asociados con disbiosis intestinal.

MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación de CDPS

Aproximadamente 1.0 kg de Cistanche deserticola limpiada se secó al aire en el horno a 40 grados C y se pulverizó en polvo crudo. El polvo se extrajo en etanol caliente durante 3 h. El residuo se filtró a través de una gasa para eliminar el filtrado y luego se diluyó con agua (8X) y se calentó a reflujo secuencialmente durante 2 h, 1,5 h y 1 h a 90 °C. En cada momento, la solución se centrifugó para separar el sobrenadante. y se combinó con el filtrado marrón rojizo. Luego, el filtrado se concentró a presión reducida, se enfrió a temperatura ambiente, se añadió lentamente a etanol al 95 por ciento (3X) y se dejó reposar a 4 grados C durante 24 h. Luego, la solución se centrifugó a 6000 r/min durante 20 min a 4 grados C. El precipitado se recogió después de repetir la extracción con agua y la precipitación con alcohol tres veces. El precipitado se reconstituyó en agua, se desproteinizó, se dializó y se secó por congelación para obtener el polisacárido de Cistanche deserticola (CDP) crudo. El contenido de polisacáridos fue superior al 90 por ciento según lo evaluado por espectrofotometría ultravioleta.

Agrupamiento de animales y tratamientos

Se compraron ratones Kunming machos de ocho semanas de edad (SCXK License No.2019-0010) de SPF Biotechnology Co. Ltd (Beijing, China), se alojaron en una habitación con luz y temperatura controlada y se alimentaron con comida y agua. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Mongolia Interior. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

Después de 1 semana de adaptación al nuevo entorno, 120 ratones se dividieron en los siguientes 7 grupos: (1) control de tipo salvaje (WT); grupo modelo (150 mg/Kg/día D-gal; Mod); (3) CH: D-gal más 100 mg/kg de CDPS; (4) CM: D-gal más 50 mg/kg de CDPS; (5) CL: D-gal más 25 mg/kg de CDPS; (6) grupo ABX: antibióticos más D-gal más 50 mg/Kg de CDPS; (7) Grupo Cy: ciclofosfamida más D-gal más 50 mg/kg de CDPS.

Los ratones de los grupos modelo, ABX, Cy y CDPS recibieron inyecciones subcutáneas de solución salina disuelta

150 mg/kg D-gal todos los días durante 2 meses. Al grupo WT se le inyectó por vía subcutánea un volumen igual de solución salina durante 2 meses. Los ratones del grupo CDPS también recibieron inyecciones intragástricas diarias que contenían 1{{10}}0 mg/kg, 50 mg/Kg o 25 mg/Kg de CDPS durante 2 meses. . Los ratones del grupo ABX recibieron agua potable con 0,1 mg/mL de ampicilina y 0,5 mg/mL de estreptomicina durante 2 meses, además de las inyecciones de D-gal y CDPS. Antes de administrar D-gal, los ratones recibieron inyecciones que contenían 0,1 mg/mL de ampicilina, 0,5 mg/mL de estreptomicina y 0,1 mg/mL de colistina durante 7 días en el grupo ABX. Los ratones del grupo Cy recibieron inyecciones intraperitoneales de 20 mg/kg de ciclofosfamida en días alternos (qod) durante 2 meses además de las inyecciones diarias de D-gal y CDPS.

Prueba de reconocimiento de objetos novedosos

Realizar experimentos de comportamiento después de la última dosis. La prueba de reconocimiento de objetos involucró etapas de familiarización, entrenamiento y prueba. Durante la etapa de familiarización, los ratones se habituaron en una cámara de prueba vacía durante 10 minutos durante dos días. Luego, el tercer día (día de entrenamiento), se colocaron dos objetos del mismo tamaño, forma y color (A1 y A2) en extremos opuestos de la cámara. Luego, a cada ratón se le dio 10 minutos para explorar los dos objetos similares. Después de 1-horas (el tercer día) y 24-horas (el cuarto día) intervalos de entrenamiento a prueba, uno de los objetos similares (A1 o A2) se reemplazó con un B o C objeto que es diferente en tamaño, color y forma el día de la prueba. Durante la etapa de prueba, cada ratón se probó durante 5 minutos y se calculó el índice preferencial para determinar la memoria del reconocimiento de objetos nuevos (B o C) utilizando la siguiente fórmula: Índice preferencial=Tiempo en el objeto B o C/( Tiempo en el objeto B o C más Tiempo en el objeto A) × 100 por ciento.

Prueba del laberinto de agua de Morris

La prueba del laberinto de agua de Morris se realizó en una piscina redonda de 45 cm de profundidad y 90 cm de diámetro. El protocolo descrito por Ruediger S, et al. (2011) [55] y Wood RA, et al. (2018) [56] fue empleado aquí. La profundidad del agua en la piscina era de 30 cm y la temperatura del agua era de 20 ± 1 grado C. La plataforma tenía 6 cm de diámetro y 1 cm bajo el agua. El tiempo de entrenamiento y prueba fue de 60 s cada uno. Para el entrenamiento, realizamos cuatro ensayos de 60 s cada uno con una plataforma oculta todos los días durante cinco días continuos. Si los ratones no descubrían la plataforma en 60 s, se los guiaba a la plataforma y se los colocaba en la plataforma durante 5 s. Durante la etapa de prueba, se registraron y analizaron la latencia para llegar a la plataforma oculta en las sesiones de prueba y entrenamiento, la cantidad de cruces sobre la ubicación de la plataforma eliminada y el tiempo pasado en el cuadrante objetivo (plataforma).

Ensayos ELISA

Los niveles séricos de citocinas proinflamatorias como IL-2(), IL-4, IL-10 y TNF- se analizaron para cada grupo de ratones utilizando kits ELISA adquiridos en Shanghai Yi. Li Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) según las instrucciones del fabricante. La actividad de una enzima antioxidante, superóxido dismutasa (SOD), y los niveles de producto de peroxidación lipídica, malondialdehído (MDA), en el suero de cada grupo de ratones se analizó mediante kits de ensayo adquiridos en el Instituto de Bioingeniería Jiancheng de Nanjing (Nanjing, China) . Los niveles de productos de proteína de oxidación avanzada (AOPP) en las muestras de hipocampo murino se estimaron utilizando el kit ELISA de Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Shanghai, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Estimación del estrés oxidativo en cerebros murinos

Homogeneizamos 100 mg de tejido de hipocampo con 0,9 ml de solución salina enfriada con hielo y el homogeneizado se centrifugó a 12000 rpm durante 30 min a 4 grados C. El contenido de proteína en el sobrenadante se analizó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA ( Beyotime Biotechnology, Shanghái, China). Los niveles de peroxidación lipídica (LPO) y malondialdehído (MDA), y las actividades de GSH-Px y SOD en las muestras de hipocampo se analizaron mediante colorimetría utilizando kits del Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) según las instrucciones del fabricante.

Composición de la microbiota intestinal

Se recolectaron muestras fecales de todos los ratones y se almacenaron inmediatamente a -80 grados C. La región V3 más V4 del gen 16S rRNA se secuenció usando Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Beijing, China) y se analizó usando el Plataforma abierta QIIME para determinar los perfiles de microbiota intestinal.

Análisis LC/MS de metabolitos séricos

Las muestras de suero se incubaron durante 10 minutos con metanol preenfriado en una proporción de 1:3 para precipitar las proteínas. Las muestras se centrifugaron a 12000r/min durante 15 minutos a 4 grados C. Los sobrenadantes se analizaron mediante cromatografía líquida de resolución rápida Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 y espectro de masas QExactive. Las condiciones cromatográficas se muestran en la Tabla 1. Los analitos se separaron en una columna cromatográfica XBridge BEH Amide (2,1 × 100 mm; Waters Co., Milford, MA, EE. UU.) utilizando ácido fórmico al 0,1 por ciento y acetonitrilo como fases móviles A y B. respectivamente. El caudal se fijó en 0,4 ml/min, el volumen de inyección fue de 5 µl y la temperatura de la columna se fijó en 25 grados C (Tabla 1). Las señales del espectro de masas se obtuvieron utilizando los modos de exploración de iones positivos y negativos. El voltaje de pulverización de iones y otros parámetros específicos de MS se muestran en la Tabla 2.

análisis estadístico

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 yp< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">

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