Cistanche Deserticola polisacáridos atenúa la nefropatía diabética en ratones afectando la flora intestinal e inhibiendo la vía de señalización del receptor 4/factor nuclear-κB de factor nuclear κB

Resumen: El objetivo de este estudio fue investigar el efecto de mejora yMecanismo potencial de cistanche deserticola polisacáridos (CDP)enNefropatía diabética (DN)en ratones. El modelo de ratón DN se estableció mediante alimentación con dieta alta en grasas (HFD) combinada con una inyección intraperitoneal de estreptozotocina (STZ). Treinta y seis ratones machos C57BL/6N se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n=6 cada uno). Todos los grupos se administraron por vía oral con agua destilada (control y modelo), dapagliflozina o CDP durante 4 semanas. Cambios en los índices fisiológicos, función renal,factores inflamatoriosy se evaluaron la microbiota intestinal. Los resultados mostraron que los CDP mejoraron significativamente la condición general y atenuaron elcambios histopatológicos renales, yredujo los niveles de glucosa en sangre, proteína urinariayfactores inflamatoriosEn ratones DN. Además, los CDP afectaron el equilibrio de la microbiota intestinal, aumentó la abundancia de bacterias beneficiosas y disminuyeron las bacterias patógenas potenciales, que a su vez mejoraron la función de la barrera intestinal. Los CDP también inhibieron la activación de la vía de señalización del receptor 4/factor nuclear κB (TLR4/NF-κB) tipo Toll y redujo la liberación de lipopolisacárido (LPS). En conclusión, los CDP exhiben un efecto de mejora sobre DN en ratones al afectar la microbiota intestinal e inhibir las vías de señalización inflamatoria. Este hallazgo ofrece nuevas ideas sobre el tratamiento de DN.

 

Palabras clave: cistanche deserticola polisacáridos;nefropatía diabética; barrera intestinal; flora intestinal; Receptor de tipo toll; factor nuclear-κB

 

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Nefropatía por diabetes (DN)es la principal causa de enfermedad renal en etapa terminal y amenaza seriamente la vida y la salud de los pacientes [1]. Los estudios han confirmado que el desequilibrio de la flora intestinal juega un papel patogénico importante en el proceso de diabetes que se convierte en DN [2-3]. La teoría del "eje de Kidney" cree que los cambios en el microambiente intestinal pueden afectar la progresión de la enfermedad renal crónica regulando directamente los metabolitos de la flora intestinal [2-3]. La flora intestinal juega un papel importante en la regulación de la función renal en los modelos de ratón DN [4-5]. La investigación en profundidad sobre el "eje intestino-kidney" ayudará a aclarar la patogénesis de DN y descubrir nuevos objetivos para la prevención y el tratamiento.
Cistanche Deserticola es una planta tradicional medicinal y comestible, también conocida como Deserticola de Cistanche, Dijing, Jinsun, etc., comúnmente conocida como Dayun, y tiene la reputación de "Ginseng del desierto" [6]. Según la farmacopea de la República Popular de China, Cistanche Deserticola es el tallo carnoso seco con hojas escamosas de Cistanche Deserticola yc ma o C. tubulosa (Schenk) Wight, una planta del género Cistanche en la familia OBANCHACEAE.
Entre ellos, Cistanche Deserticola tiene una larga historia de ser utilizada como medicina y comida. Cistanche Deserticola es de naturaleza dulce, salada y cálida y entra en los meridianos del riñón y el intestino grande. Tiene los efectos de tonificar el yang del riñón, beneficiar la esencia y la sangre, y humedecer los intestinos y aliviar el estreñimiento [7-8]. Los polisacáridos son uno de los principales ingredientes activos de Cistanche Deserticola. El contenido de polisacáridos en el extracto de agua de Deserticola de Cistanche es relativamente alto. Se compone principalmente de monosacáridos como glucosa, galactosa, ramnosa, arabinosa y fructosa. Tiene muchos efectos farmacológicos, como regular la actividad inmune, antienvejecimiento, mejorar el aprendizaje y la memoria, proteger los nervios, resistir el daño hepático, antivirus y antitumoral [9-12]. Estudios previos del grupo de investigación han demostrado que el extracto de agua del deserticola de Cistanche tiene un efecto terapéutico potencial sobre DN [13]. En base a esto, este experimento tomó la flora intestinal y la respuesta inflamatoria como el punto de partida para estudiar el efecto de los polisacáridos de deserticola (CDP) de Cistanche para mejorar la DN en ratones y restaurar la función renal, para proporcionar una base científica para el papel de los CDP en el tratamiento de DN.

1 Materiales y métodos

1.1 animales, materiales y reactivos

36 6- Los ratones machos C57BL/6J de antigüedad se compraron en el Centro de Experimentos Animales de la Universidad de Medicina Xinjiang, Licencia de producción de animales No.: SCXK (Xin) 2023-0006; Resolución de ética no.: IACUC -20210331-04.
CDPS del desierto (fracción de masa de polisacárido ＞ 80%, número de lotes: 2306019) Shaanxi xintianyu Company; Dapagliflozin (DAPA; Número de lotes: 2108119) Astrazeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.; proteína total de orina (proteína total de orina, utp; número de lotes: c 035-2-1), urea nitrógeno (sangre urea urea nitrógeno, bun; número de lotes: c 013-2-1), creatinine (creatInine, número de lote: c 011-2-1), ic ic ic (úrica, ua; batch: c {6 {6}}}) Instituto de Bioingeniería Nanjing Jiancheng; lipopolysaccharide (LPS; batch number: YX-121619M), interleukin-6 (IL-6; batch number: YX-E20012), IL-1 (batch number: YX-E20533), transforming growth factor- (TGF- ; batch number: Yx-e20217), factor de necrosis tumoral- (TNF-; número de lote: yx-e20220) kit shanghai yoxuan biological Co., Ltd.; Kit de quimioluminisceno mejorado (ECL) Beijing Pulilai Gene Technology Co., Ltd.; Estreptozotocina (STZ; Número de lotes: 20230503), dieta alta en grasas (60% de grasa Tipo de dieta alta en grasa Tipo, número de material: Boaigang12492m) Beijing Boaigang Biotechnology Co., Ltd.
La alimentación básica (que contiene 22% de harina de maíz, 12% de salvado, 18% de residuos de aceite, 8% de harina de pescado, 12% de comida de soja, 0. 17% sal, 0. 25% vitaminas, 0. 25% Elementos de trazas, {{11}. 33% de petróleo de bacalao, y 2% de piedra en polvo) fue por el centro de los animales de los animales). Universidad de Medicina.

 

1.2 instrumentos y equipos

AE240 Balance analítico, Mettler-Toledo Instrument Co., Ltd., Suiza; DHG -9053 Un horno de secado de calefacción eléctrica, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.; Baño de agua de temperatura constante DK-S22, Shanghai Jinghong Experimental Instrument Co., Ltd.; 3-18 KS Centrífuga de alta temperatura de alta velocidad, Sigmaaldrich, EE. UU.; BS -380 Analizador bioquímico totalmente automático, Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.; EM KMR3 SLICER, HI1220 SLICER, Leitz Optilux Digital Microscope, Leica, Alemania; Sistema de imágenes de quimioluminiscencia Fluorchem E, Proteinsimple, EE. UU.

1.3 Métodos

1.3.1 Experimento de animales

36 ratones machos C57BL/6J fueron alimentados en el Laboratorio SPF de la Universidad de Medicina de Xinjiang y se alimentaron libremente. El experimento se llevó a cabo después de 7 días de alimentación adaptativa. Seis ratones fueron seleccionados al azar como el grupo normal (control) y se le dio una dieta básica. El resto de los grupos experimentales fueron alimentados con una dieta alta en grasas y se mantuvieron en jaulas separadas. El peso corporal se probó una vez por semana. Los ratones eran libres de comer y beber agua. Después de 6 semanas de alimentación de dieta alta en grasas, los ratones grupales experimentales se inyectaron con STZ 4 0 mg/kg intraperitonealmente durante 5 días consecutivos, además de una dieta gratuita de alta grasa todos los días. La glucosa en sangre en ayunas después del modelado fue de 11.1 mmol/L, que se consideró un modelo exitoso de diabetes. Treinta ratones con modelado exitoso se dividieron aleatoriamente en cinco grupos, con seis ratones en cada grupo, a saber, el modelo (Dieta destilada + dieta alta en grasas, modelo), DAPA (DAPA 4 mg/kg + dieta alta, grupo DAPA), CDPS bajo (50 mg/kg + dieta de dieta alta y dieta de cdps), CDPS-MEDE (100 mg/kg/kg + kg + dieta de cdps + cdps, grupo de dieta CDPS, CDPS, CDPS), CDPS-LED, CDPS (100 mg/kg/kg + kg + kg + dieta CDPS, dieta CDPS, CDPS, CDPS), CDPS-L) Group, CDPS-Medium (100 mg/kg/kg + kg + kg + dieta CDPS, dieta CDPS, CDPS, CDPS), CDPS-L). y CDPS Dosis altas (200 mg/kg + grupo de dieta alta en grasas, CDPS-H). El grupo de control (agua destilada + dieta normal) recibió una cantidad igual de agua destilada. Cada mouse se vistió a 0.1 ml/10 g, una vez al día al mismo tiempo, durante un total de 4 semanas. El peso corporal y los cambios en la glucosa en sangre de los ratones se registraron semanalmente.

1.3.2 Determinación del índice

Después de 4 semanas de administración de gavegas, las muestras de orina (24 h) y las heces frescas se recolectaron a través de jaulas metabólicas al final de la cuarta semana y se almacenaron en -20 grado y -80 grado, respectivamente. Los ratones fueron ayunados pero no regados durante 12 h. Al día siguiente, se midió el peso corporal en ayunas de los ratones. Los ratones fueron anestesiados por inyección intraperitoneal de 3 ml/kg de solución de hidrato cloral al 10%. La sangre se recogió de las órbitas y se centrifugó en una centrífuga (4 grados, 3 500 r/min) durante 15 min. El sobrenadante fue aspirado, empaquetado y almacenado en un refrigerador de grado -80 para su uso posterior. El suero se midió para BUN, Cre, UA, IL -6, IL -1, TGF-, TNF- y LPS según el kit. La orina se midió durante 24 h UTP según el kit.

 

1.3.3 Observación morfológica y patológica del riñón y el intestino

1.3.3.1 Determinación del coeficiente renal

Después de la recolección de sangre, los ratones fueron anestesiados hasta la muerte por una sobredosis, y los riñones y los colons se eliminaron por completo e inmediatamente se enjuagaron con solución salina precoledada, se drenaron en papel de filtro y se pesaron. El coeficiente renal se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: coeficiente renal/%= × 100 m1m, donde M1 es el peso húmedo del riñón/g; M es el peso corporal del ratón/g.

 

1.3.3.2 Observación patológica del riñón

Los riñones de ratón se fijaron en fijación de paraformaldehído al 4%, deshidratados por el gradiente de la solución de etanol, transparenciados por xileno, incrustado en parafina, en rodajas (espesor 2 μm), degrada por xileno e hidratado por el gradiente de solución de etanol, y luego se torcí con hematoxilina y eosina (H & E), mason, y periódico (pásico (pás), y se tumbó a ácido de etanol, y se tumbó con hematoxilina y eosina (H & E), mason, y se está hidratado por el ácido de etanol ((pásmica (), y se toca hematoxilina y eosina (H & E), mason, y se trituran (masas), y se tritura. Sellado, y las imágenes se recogieron y observaron bajo un microscopio.

 

1.3.3.3 Observación patológica intestinal

El intestino del ratón se fijó con fijador de paraformaldehído al 4%, deshidratado con gradiente de solución de etanol, transparentizado con xileno, incrustado en parafina, en rodajas (espesor 2 μm), se deja con xileno e hidratados con el gradiente de etanol, luego se colectaron con H & E y Alcian Azul (AB) para el sellado, y se sellaron las imágenes.

 

 

1.3.4 Análisis de la composición de la flora intestinal

El contenido del colon de los ratones en el grupo de control, el grupo modelo y el grupo CDPS-H se detectaron mediante secuenciación de alto rendimiento del gen 16S rRNA. La extracción de ADN y la construcción de la biblioteca y la secuenciación de microorganismos en el contenido del colon fueron completadas por Lianchuan Biotechnology Co., Ltd., y los datos obtenidos se analizaron en la plataforma en la nube de Lianchuan.

 

1.3.5 Detección de la expresión de proteínas renales y relacionadas con el colon

Se extrajeron las proteínas de riñón y tejido de colon de ratón, y la proteína se cuantificó por el método de cuantificación de proteína de ácido bicinconínico. Después de la desnaturalización de la proteína, la proteína se almacenó en un refrigerador -20 de grado. Alectroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio al 10%, transferencia de membrana de difluoruro de polivinilideno, la membrana se colocó en una solución salina tamponada con tris con un tanque de incubación Tween -20 (TBST), y se bloqueó a temperatura ambiente. Detección
Los anticuerpos primarios a los receptores tipo Toll (TLR) 4, el factor de transcripción nuclear (NF) -κB p65, P-NF-κBP65 y -actina en el tejido renal (anticuerpo diluido 1: 2 000 (v/v) con solución TBST) y occludina y Zonula occludens {-1 (}} (11}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}} (11} (11} (11} (11} (11} (11} (11} (11} (11}) (11} (11} (11} (11} (11. En el tejido de colon (anticuerpo diluido 1: 1 000 (v/v) con solución TBST) se incubaron a 4 grados durante la noche. Dilución TBST, anticuerpo secundario (anticuerpo
Diluido con la solución TBST 1∶ 2 000 (v/v)), incubada a temperatura ambiente durante 1 h, lavada con TBST 3 veces y luego se detectó agregando reactivo de luminiscencia ECL, y se usó imágenes de gel para detectar la expresión de proteínas. -Actina se utilizó como referencia interna, y el valor de Protein Gray fue analizado por el software ImageJ. La expresión de proteínas de cada grupo se expresó como el valor relativo del valor gris del grupo de control.

 

1.4 Estadísticas de datos

Todos los resultados de los datos se expresaron como ± S, y SPSS 21. 0 se utilizó para el análisis estadístico. Para los datos continuos, si siguieron una distribución normal, se utilizó un análisis de varianza unidireccional para la comparación entre grupos. Si la diferencia entre los grupos fue estadísticamente significativa, el método de Turquía se usó aún más para la comparación por pares; Si los datos siguieron una distribución normal, la prueba de Kruskal-Wallis H se usó para la comparación entre grupos. Cuando hubo una diferencia estadística entre los grupos, el método de diferencia menos significativo de Durbin se utilizó aún más para comparaciones múltiples. P <0. 05 indicó que la diferencia era estadísticamente significativa.

 

 

2 resultados y análisis

2.1 Efecto de los CDP sobre glucosa en sangre, peso corporal y coeficiente renal de C57BL/6J

Como se puede ver en las Tablas 1 a 3, en comparación con el grupo de control, la glucosa en sangre en ayunas de los ratones en el grupo modelo aumentó significativamente (P<0.01), and the kidney coefficient was significantly increased (P<0.01); compared with the Model group, CDPs- The body weight of mice in group H increased significantly after 4 weeks of administration (P＜0.05), and blood sugar began to decrease after 3 weeks of administration (P＜0.05). The kidney coefficient of mice in each intervention group decreased, and the CDPs-H group was the lowest (P<0.01); the body weight of mice in the Control group was larger than that of each group, indicating that CDPs can slow down the swelling of the kidneys of DN mice, thereby Reduce the kidney coefficient.

 

Tabla 1 Efectos de CDP en la glucosa en sangre de ratones (n=6)

Grupo	Hora/semana
	0	1	2	3	4
Control	7.98±0.55	7.32±0.40	7.58±0.50	7.38±0.87	7.28±0.34
Modelo	10.62±2.79#	20.32±2.69#	24.47±4.18#	24.92±3.98#	20.33±2.96#
CDPS-L	16.03±2.97	21.83±4.81	20.13±6.97	23.30±3.77	21.25±1.65
CDPS-M	13.17±3.59	22.6±5.88	19.35±4.45	22.6±4.87	18.38±1.20
CDPS-H	11.07±1.74	21.53±3.71	21.57±6.19	17.43±2.05**	15.87±0.90**
Dapa	10.28±4.75	21.12±4.96	17.72±2.00**	17.35±2.00**	14.55±1.06**

Unidad: MMOL/L

 

Tabla 2 Efectos de CDP en el índice de riñón de ratones (n=6)

 

Grupo	Control	Modelo	CDPS-L	CDPS-M	CDPS-H	Dapa
Peso renal/corporal	0.98±0.04	1.69±0.17##	1.42±0.12	1.37±0.10*	1.28±0.10**	1.18±0.10**

 

Tabla 3 Efectos de CDP en la masa corporal de ratones (n=6)

 

Grupo	Hora/semana
	0	1	2	3	4
Control	28.57±0.82	28.75±0.97	28.70±0.79	29.10±1.24	29.32±1.35
Modelo	24.53±1.25##	24.92±1.20##	24.35±1.39##	24.82±1.22##	24.73±1.56##
CDPS-L	25.75±0.69	24.77±0.91	24.83±0.99	25.10±0.83	25.42±0.97
CDPS-M	25.10±0.56	25.00±0.54	24.68±0.48	25.13±0.62	25.25±0.58
CDPS-H	25.38±0.28	25.43±0.49	25.52±0.62	25.73±0.50	26.08±0.34*
Dapa	25.13±1.02	25.52±0.98	25.97±1.00*	26.25±0.63*	26.63±0.78*

 

 

2.2 Efecto de CDP en la función renal de ratones C57BL/6J

Como se muestra en la Tabla 4, en comparación con el grupo de control, las concentraciones BUN, CRE y UA en suero y la concentración de masa UTP de 24 h en la orina de ratones en el grupo modelo aumentaron (P (P<0.01); compared with the Model group, CDPs-M and CDPs-H can significantly reduce the concentrations of BUN, Cre, and UA in serum and the 24-hour UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01). CDPs-L can significantly reduce the concentrations of BUN and UA in mouse serum. and 24 h UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01).

 

Tabla 4 Efectos de CDP en BUN, CRE, UA y 24 H UTP en ratones DN (N=6)

Grupo	Concentración de BUN (MMOL/L)	Concentración de Cre (μmol/L)	Concentración de contenido de UTP de 24 h (mg/ml)	Concentración de UA (μmmol/L)
Control	47.51±7.32	12.80±1.36	1.32±0.12	103.9±18.59
Modelo	157.97±30.57##	44.85±4.36##	2.38±0.37##	500.43±81.06##
CDPS-L	112.70±16.76*	40.72±3.62	1.37±0.12**	264.07±14.85**
CDPS-M	82.31±14.68**	35.37±6.21*	1.06±0.17**	247.62±11.22**
CDPS-H	64.58±8.64**	30.00±2.87**	0.65±0.17**	222.71±37.52**
Dapa	76.98±10.47**	28.82±3.72**	0.37±0.10**	129.87±17.69**

 

 

2.3 Efecto de los CDP en factores inflamatorios y concentración de masa LPS en suero de ratones C57BL/6J

 

Como se muestra en la Tabla 5, en comparación con el grupo de control, los niveles séricos de TNF-, IL -1, IL -6, TGF y LPS en los ratones en el grupo modelo aumentaron (P (P (P (P<0.01); compared with the Model group, Each dose of CDPs can reduce the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, TGF-β and LPS in serum, CDPs-M
El efecto del grupo CDPS-H fue significativo (P ＜ 0. 0 5 o P ＜ 0. 01), y el efecto del grupo CDPS-H fue significativo (P ＜ 0.01).

Tabla 5 Efectos de CDP en factores inflamatorios y LPS en ratones (n=6)

 

Grupo	Concentración de masa (PG/ml)
	Tnf-	Il -1	Il -6	Tgf-	LPS
Control	111.23±5.47	125.85±11.41	112.27±10.28	152.25±7.28	116.17±15.07
Modelo	167.90±16.91##	184.53±21.03##	195.57±31.88##	209.36±16.17##	173.51±15.72##
CDPS-L	144.57±10.15*	160.46±11.84*	169.10±20.32	189.03±8.02*	151.41±9.40*
CDPS-M	133.62±13.24**	154.30±17.39*	150.47±19.28*	171.25±14.35**	135.33±23.92**
CDPS-H	119.30±7.31**	140.54±16.11**	127.12±10.94**	169.47±10.57**	124.98±16.38**
Dapa	114.79±10.48**	135.17±14.37**	120.90±9.32**	159.11±10.92**	113.34±13.14**

 

 

2.4 Efecto de CDP en la patología renal de ratones C57BL/6J

Como se muestra en la Figura 1, después de la tinción de H&E, se encontró que la estructura glomerular y la morfología de los ratones en el grupo de control eran normales y claras, la membrana basal era lisa, la morfología glomerular era regular, el intersticio renal era normal, los túbulos renales estaban ordenados y no había infiltración de células inflamatorias. En comparación con el grupo de control, se amplió el volumen glomerular de los ratones en el grupo modelo, la membrana basal se engrosó, las células inflamatorias se infiltraron a su alrededor y los túbulos renales se desordenaron y se dilataron; En comparación con el grupo modelo, los grupos de administración de CDPS tenían diferentes grados de mejora en los riñones del ratón. El volumen glomerular de los ratones en los grupos CDPS-M y CDPS-H se redujo significativamente, el grosor de la membrana basal se redujo, solo se infiltró una pequeña cantidad de células inflamatorias y los túbulos renales se recuperaron significativamente y se organizaron estrechamente. Después de 4 semanas de intervención CDP, las condiciones patológicas anteriores se restauraron en diversos grados.

La tinción de Masson mostró que los túbulos renales de los ratones en el grupo de control estaban dispuestos normalmente y los glomérulos estaban en forma normal, no se observó proliferación de fibra de colágeno y se visible las membranas del sótano tubular; Se observó una gran cantidad de colágeno teñido en el tejido intersticial renal de los ratones en el grupo modelo, y el tejido fibroso intersticial se agrupó y se proliferó reticularmente; Se redujo el volumen glomerular de los ratones en el grupo CDPS-M, y se aliviaron los síntomas de la proliferación del tejido fibroso; Los túbulos renales de los ratones en el grupo CDPS-H se organizaron más regularmente, y se observó una pequeña cantidad de proliferación de fibra de colágeno.

Los resultados de la tinción de PAS mostraron que los glomérulos de los ratones en el grupo de control eran normales en volumen y en estructura intacta; Los ratones en el grupo modelo tenían daño renal, el volumen glomerular era más grande de lo normal y la forma era irregular y se depositó la matriz mesangial; En comparación con el grupo modelo, se alivió el daño renal de los ratones en cada grupo tratado con drogas, y con el aumento de la dosis, la forma y el tamaño glomerular tendían a ser normales, y el grado de deposición de la matriz mesangial se redujo. Los resultados sugieren que los CDP pueden aliviar el daño del tejido renal en ratones DN.

 

Fig. 1 Efecto de CDP en los cambios histopatológicos renales en ratones DN como se examina por H&E, Masson y tinción con PAS (× 400)