Cistanche Glycoside aumenta Bmi1 y promueve la proliferación de células madre espermatogoniales de ratón a través de la vía de señalización Akt
May 23, 2023
Objetivo: Investigar el efecto promotor y los mecanismos relacionados de los glucósidos de Cistanche sobre la proliferación de células madre espermatogoniales de ratón. Método: Se utilizaron el ensayo MTT y el ensayo de proliferación celular EdU para detectar el efecto del glucósido de Cistanche en la capacidad de proliferación de las células madre espermatogoniales de ratón; se usó el método Western blot para detectar la expresión de las proteínas Bmi1, p-Akt y Akt por el glucósido de cistanche; El experimento de RT-PCR detectó los resultados de la expresión de genes relacionados y, finalmente, demostró la relación reguladora ascendente y descendente entre las proteínas p-Akt y Bmi1 a través de inhibidores y siRNA. Resultado: En comparación con el grupo de control, 0.5-1 µ M Cistanche glucósido promovió la proliferación de células madre espermatogoniales de ratón (P<0.05); Compared with the control group, the expression levels of p-Akt and Bmi1 proteins in the 0.5-1 µ M Cistanche glycoside treated group increased (P<0.05); Akt inhibitors downregulated the levels of p-Akt and Bmi proteins (P<0.05); SiBmi1 had no significant effect on Akt mRNA levels (P>0.05). Conclusión: el glucósido de Cistanche activa la vía de señalización de Akt y aumenta la expresión de Bmi1, promoviendo la proliferación de células madre espermatogoniales de ratón.
Palabras clave: glucósido de Cistanche; Células madre de espermatogonias de ratón; Bmi1; proliferación celular
La infertilidad se ha convertido en un problema global que obstaculiza el desarrollo de la sociedad humana [1-2]. De acuerdo con las estadísticas epidemiológicas, aproximadamente el 15 por ciento -20 por ciento de las parejas en todo el mundo sufren enfermedades de infertilidad, y la disfunción masculina causa más del 50 por ciento de los síntomas de infertilidad [3]. Por lo tanto, encontrar métodos de tratamiento efectivos para la infertilidad masculina se ha convertido en un tema candente de investigación en el campo de la salud reproductiva tanto a nivel nacional como internacional.
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El complejo inhibidor de la proteína Polycomb 1 (PRC1) compuesto por el sitio de integración 1 del virus de la leucemia de ratón Moroni específico de las células B (Bmi1) puede prevenir el envejecimiento prematuro y mantener la capacidad de autorrenovación de las células madre [4]. La proteína quinasa B (Akt) está involucrada en la proliferación y diferenciación celular [5], y la Akt activada está involucrada en varias actividades biológicas importantes [6-7].
Cistanche glucósido I (C27H30O11, peso molecular: 530,52) es un hidrolizado de Cistanche glucósido aislado de la medicina tradicional china Cistanche glucósido, que tiene diversas actividades farmacológicas y biológicas [8-9]. Según los informes, el glucósido de Cistanche puede tener cierto efecto terapéutico sobre la osteoporosis [10]. Sin embargo, el impacto del glucósido I de Cistanche en la función reproductiva masculina aún no está claro. Las células madre espermatogénicas (SSC) son el grupo de espermatozoides más primitivo con la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse, desempeñando un papel insustituible en el mantenimiento de la función reproductiva masculina. Por lo tanto, este estudio utilizó SSC de ratón como modelo in vitro para explorar el efecto del glucósido de Cistanche en la capacidad de proliferación de las SSC de ratón y su mecanismo de acción.
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1 Material y Métodos
1.1 Cultivo celular
En este estudio, se utilizaron células madre de espermatogonias de ratón (C18-4). Las células procedían del grupo de investigación del profesor He Zuping y se separaron, purificaron e identificaron de acuerdo con las especificaciones. A las células madre de espermatogonias de ratón se les añadió suero bovino fetal al 10 por ciento (Gibco) y penicilina/estreptomicina al 1 por ciento en DMEM/F12 (Gibco), y se cultivaron en medio (37 grados, 5 por ciento de CO2)
Experimento 1.2 MTT
Inocule C18-4 con una cantidad de 5000 células por pocillo en una placa de 96-pocillos para garantizar una inoculación uniforme de las células. Después de la adhesión celular, seleccione los fármacos necesarios y las concentraciones de fármacos para el tratamiento. Después de 72 horas de adicción a las drogas, se agregaron 50 µL de azul de tiazol (MTT) preparado al pocillo donde se inocularon las células, y las placas de 96 pocillos se colocaron en una incubadora de células durante 4-5 horas. Después de la incubación, deseche la solución de cultivo de las placas de 96 pocillos, agregue 150 μl de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a cada pocillo y, finalmente, mida la absorbancia utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (Biotek) a una longitud de onda de 490 nm.
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1.3 Proliferación de células EdU
Inocule uniformemente las células en una {{0}}placa de pocillos (6,0 × 103/pocillo), después de que las células se adhieran a la pared, agregue medicamentos durante 24 horas según las necesidades experimentales y luego use 100 μ LDMEM/ F12 contiene 20 µl de EdU como sustituto del medio de cultivo original y luego se prueba el potencial de proliferación de las células de acuerdo con las instrucciones del kit de prueba de EdU.
1.4 Transferencia de Western
La muestra de proteína celular prealmacenada se dividió mediante gel SDS PAGE y luego se transfirió a la membrana de PVDF después de la electroforesis. Se selló con leche desnatada al 5 por ciento durante 1 hora. Se combinó con anticuerpo primario específico a 4 grados durante la noche: anticuerpo p-Akt anti-ratón de conejo (1 ∶ 2000) (CST), anticuerpo Akt (1 ∶ 1000) (CST), GAPDH (1 ∶ 5000) (Abcam), Bmi1 (1 ∶ 5000) (Abcam). En el segundo día, únase con el anticuerpo secundario de conejo a temperatura ambiente durante 1 hora. Las proteínas correspondientes se detectaron con el kit Chemiluminescence Liquid (ECL) (Bio-Rad) y, finalmente, se observó la reacción antígeno-anticuerpo con el sistema ChemiDoc (Bio-Rad).
1.5 RT-PCR
El reactivo utilizado en el proceso de extracción de ARN total es el reactivo TRIzol (Invitrogen), y el ADNc se obtiene de acuerdo con las instrucciones del kit de transcripción inversa de ADNc de primera cadena (Vazyme). La RT PCR se realizó utilizando la mezcla maestra de expresión génica TaqMan (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones, utilizando ΔΔ. El método Ct calcula el cambio en múltiplos relativos de expresión de ARNm, con un valor de 2 − ΔΔ Ct. Tabla de secuencias de cebadores en (Tabla 1)
1.6 transfección de ARNsi
El siRNA de Bmi 1 mRNA se adquirió de Ribobio y la lista de secuencias se encuentra en la Tabla 2. Se utilizó el reactivo de transfección Lipofectamine 6000 (Invitrogen). Las células (2,0 × 105/pocillo) se cultivaron durante la noche en DMEM/F 12 complementado con suero fetal bovino al 10 % en una placa de 6-pocillos. De acuerdo con las pautas del fabricante, Lipofectamine 6000 se mezcló a fondo con siRNA de control y siRNA de Bmi1, respectivamente, y se transfectó durante 5 horas en un medio de cultivo sin suero bovino fetal. Después de lavar con PBS, el medio de cultivo original se reemplazó con suero bovino fetal al 10 por ciento DMEM/F12. Después de 24 horas, se recolectaron células para detectar los cambios de expresión de varias proteínas y genes correspondientes.
Tabla 1 Secuencias de cebadores amplificados por RT PCR
Tabla 2 Secuencia de siRNA Bmi1
1.7 Análisis estadístico
Todos los datos se analizaron con SPSS 16.0 y el software GraphPad Prism 8. En base a las diferencias en los valores medios entre dos o más grupos, se seleccionaron la prueba t de Student y la prueba ANOVA unidireccional para la comparación. Una diferencia de P<0.05 was considered statistically significant.
2 resultados
2.1 Efectos de los glucósidos de Cistanche sobre las células madre espermatogoniales
Con el fin de determinar si el glucósido I de Epimedium tiene un efecto proliferativo en las células madre espermatogoniales de ratón, descubrimos a través de experimentos MTT que el glucósido I de Cistanche puede promover la proliferación de células madre espermatogoniales de ratón en concentraciones de {{0}}.5 y 1 µM (Figura 1A). A continuación, con el fin de verificar aún más el efecto proliferativo del glucósido I de Cistanche en las células madre espermatogoniales de ratón, confirmamos mediante experimentos de proliferación celular de EdU que el glucósido I de Cistanche también puede promover la proliferación de células madre espermatogoniales de ratón en concentraciones de 0,5 y 1 µM (Figura 1B).
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2.2 El glucósido de Cistanche regula positivamente la expresión de Bmi1
Estudios de laboratorio anteriores han demostrado que Bmi1 se expresa mucho en el tejido testicular en comparación con otros tejidos de órganos, y se expresa principalmente en el núcleo de las células madre espermatogoniales de ratón. Estudios recientes han demostrado que Bmi1 es de gran importancia para mantener la proliferación de células madre espermatogoniales [12]. Por lo tanto, especulamos que el glucósido I de Cistanche tiene un efecto regulador sobre Bmi1, promoviendo así la proliferación de células madre espermatogoniales de ratón. Los resultados de la transferencia Western mostraron que el glucósido I de Cistanche aumentó significativamente la expresión de la proteína Bmi1 (Figura 2).
2.3 El glucósido de Cistanche activa la vía de señalización de Akt
Según los informes, la Akt fosforilada está estrechamente relacionada con la proliferación y diferenciación celular [13]. Por lo tanto, investigamos el efecto de la icariina I en la fosforilación de Akt. Encontramos que los glucósidos de Cistanche aumentaron significativamente la expresión de fosforilación de Akt en concentraciones de 0.5 y 1 µM (Figura 3).
2.4 Inhibición de la regulación negativa de Akt de Bmi1
Según informes de investigaciones anteriores [14], seleccionamos un inhibidor de Akt (MK-2206) en una concentración de 10 (µ M) y descubrimos que inhibir p-Akt inhibía significativamente Bmi1. Este resultado indica que la expresión de Bmi1 está regulada por Akt (Figura 4)
Figura 1: Efecto del glucósido I de Cistanche en células madre espermatogoniales de ratón
A. Se usó el ensayo MTT para detectar el efecto del tratamiento con glucósido I de Cistanche durante 3 días sobre la viabilidad de las células madre espermatogoniales de ratón; B. El experimento de proliferación celular de EdU se utilizó para detectar la proliferación de células madre de espermatogonias de ratón después de 3 días de tratamiento con glucósidos de Cistanche, así como el gráfico de análisis estadístico; *PAG<0.05, * * P<0.01 compared to the control group, n=3.
Figura 2: Efecto del glucósido I de Cistanche en la proteína Bmi1
Se usó el ensayo de transferencia Western para detectar el efecto del tratamiento con glucósido I de Cistanche deserticola en la expresión de Bmi1 en células madre espermatogoniales de ratón después de 24 horas, y también se presentó el mapa estadístico* P<0.05, compared to the control group, n=3.
Figura 3: Efecto del glucósido I de Cistanche en la vía de señalización de Akt
Se usó el ensayo Western blot para detectar la expresión de Akt y la fosforilación de Akt en células madre espermatogoniales de ratón después de 24 horas de tratamiento con Cistanche Cistanche glucósido I, y también se presentó el mapa estadístico** P<0.01, compared to the control group, n=3.
Figura 4: El efecto del inhibidor de Akt en Bmi1. Se usó un experimento de transferencia Western para detectar la expresión de Akt fosforilada y Bmi1 en células madre espermatogoniales de ratón después de 24 horas de tratamiento con inhibidor de Akt, y se presentó el diagrama estadístico* P<0.05 * * P<0.01, compared to the control group, n=3.
2.5 El silencio de Bmi1 no afecta la expresión de Akt
Para validar aún más la relación aguas arriba-aguas abajo entre Bmi1 y Akt, silenciamos Bmi1 y observamos cambios en la expresión celular de Akt. En primer lugar, se transfectaron ARNsi de diferentes secuencias de Bmi1 en células de ratón para explorar su eficiencia de transfección. Los resultados del experimento de RT PCR mostraron que siBmi1-1, siBmi1-2 y siBmi1-3 redujeron significativamente la expresión de Bmi1, con siBmi1-2 y siBmi1-3 teniendo mejores efectos (Figura 5A). Western blot confirmó además que tanto siBmi1-2 como siBmi1-3 pueden reducir significativamente los niveles de proteína Bmi1 (Figura 5B), por lo que seleccionamos siBmi1-2 y siBmi1-3 para investigaciones posteriores. Curiosamente, RT-PCR demostró que silenciar Bmi1 no afectó la expresión de Akt (Figura 5C). Los resultados anteriores indican que Akt se encuentra aguas arriba de Bmi1.
Figura 5: El impacto de silenciar Bmi1 en Akt
A. Análisis por RT-PCR de los efectos de tres secuencias de silenciamiento sobre la expresión del gen Bmi1; B. Se usó un experimento de transferencia Western para detectar el efecto de tres secuencias de siRNA diferentes sobre el silenciamiento de la proteína Bmi1 en comparación con siCtrl, y se realizó un análisis estadístico; C. Análisis RT-PCR del efecto del silenciamiento de Bmi1 en el gen Akt** P<0.01, * * * P<0.001 compared to the control group, n=3.
3 Discusión
La infertilidad obstaculiza seriamente el desarrollo sostenible de la sociedad humana, y la infertilidad masculina representa el 50 por ciento de los pacientes con infertilidad. Con el desarrollo continuo de la tecnología médica, el nivel de tratamiento clínico de la infertilidad masculina ha mejorado significativamente. Sin embargo, los métodos de tratamiento quirúrgico existentes, como la tecnología de reproducción asistida, tienen inconvenientes como el alto costo y la baja tasa de éxito y tienen una pequeña variedad de beneficiarios. Son adecuados para pacientes que tienen azoospermia completa durante la recuperación de microespermatozoides testiculares, tienen enfermedades genéticas claras y no están dispuestos a recibir tratamiento por varias razones [16]. Por lo tanto, se han realizado esfuerzos tanto a nivel nacional como internacional para desarrollar métodos de tratamiento más seguros y confiables para la infertilidad masculina, y la terapia con medicamentos se ha convertido en un foco de investigación en el campo de la infertilidad masculina [17]. La práctica clínica existente ha demostrado que la medicina tradicional china en China tiene buena eficacia y seguridad en el tratamiento de la infertilidad masculina [18].
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El glucósido de Cistanche es un tema candente en el tratamiento de la infertilidad masculina en la medicina tradicional china en los últimos años. Su componente principal, el glucósido de Cistanche, tiene varias actividades farmacológicas, que incluyen mejorar la función inmunológica [19], mejorar la función reproductiva masculina [20], antioxidantes [21] y anti-osteoporosis [22]. Para aclarar aún más el mecanismo de acción del glucósido de Cistanche después de que ingresa al cuerpo humano, este estudio seleccionó el glucósido de Cistanche, un hidrolizado de glucósido de Cistanche, como objeto de investigación para explorar el mecanismo específico por el cual el hidrolizado ejerce su efecto farmacológico. En primer lugar, descubrimos que el glucósido I de Cistanche puede promover la proliferación de células madre espermatogoniales de ratón. Cabe señalar que el glucósido I de Cistanche no promovió la proliferación de células madre espermatogoniales de ratón de forma dependiente de la concentración, lo que indica que el glucósido I de Cistanche tiene un rango seguro de dosis. A continuación, descubrimos que el glucósido I de Cistanche aumenta significativamente el nivel de expresión de la proteína Bmi1 estrechamente relacionada con la función reproductiva masculina. Recientemente, los investigadores han descubierto que la ausencia de Bmi1 puede afectar seriamente la función reproductiva de los ratones macho, manifestándose principalmente en oligospermia y agrandamiento testicular [23]. Mientras tanto, otro estudio de nuestro grupo de investigación también confirmó que la inhibición de Bmi1 puede afectar seriamente la capacidad de proliferación de las células madre espermatogoniales. Por lo tanto, especulamos que el glucósido I de Cistanche que promueve la proliferación de células madre espermatogoniales de ratón puede estar relacionado con la regulación de la expresión de Bmi1. Según los informes, p-Akt está estrechamente relacionado con la proliferación y diferenciación celular [14]. Por lo tanto, probamos los cambios en la proteína p-Akt causados por el glucósido I de Cistanche y descubrimos que el glucósido I de Cistanche también regulaba al alza p-Akt. Finalmente, exploramos la relación aguas arriba y aguas abajo entre Akt y Bmi1. Vale la pena señalar que existen diferencias en los resultados de investigación de la relación aguas arriba y aguas abajo entre Bmi1 y Akt obtenidos por diferentes laboratorios [24-25]. Los resultados de este estudio indican que los inhibidores específicos de Akt regulan a la baja Bmi1 mientras que silenciar Bmi1 no afecta los niveles de ARNm de Akt, lo que indica que Akt puede estar aguas arriba de Bmi1, que está regulado por Akt. En el estudio del efecto de silenciar Bmi1 en Akt, solo lo exploramos a nivel de ARNm. Como Bmi1 es un inhibidor de la transcripción, especulamos que puede haber una interacción entre la proteína Bmi1 y la proteína Akt. Sin embargo, actualmente no hay evidencia completa para confirmar la relación aguas arriba y aguas abajo entre Akt y Bmi1. Por lo tanto, complementaremos y mejoraremos esto en el futuro.
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En resumen, este estudio encontró por primera vez que Cistanche glucósido I tiene el efecto de promover la proliferación de células madre espermatogoniales, revelando un nuevo mecanismo de Cistanche glucósido I que promueve la proliferación de células madre espermatogoniales a nivel celular, enriqueciendo la base teórica. para la aplicación del glucósido de Cistanche en el tratamiento clínico de la infertilidad masculina.
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