Resultados y discusión: optimización de un solo factor, perfil de aroma volátil y metabolómica de Cistanche Musalais

 

 

 

2 Resultados y análisis

 

2.1 Experimentos unifactoriales para Cistanche Musalais

Los resultados de un solo factor se muestran en la Figura 2. Los sólidos solubles reflejan principalmente los azúcares residuales totales y otras sustancias solubles que quedan después de la fermentación. Cuanto mayor sea el nivel inicial de azúcar, mayores serán los sólidos solubles residuales finales. Al mismo nivel inicial de adición de azúcar y Cistanche, los sólidos solubles a 25 grados fueron ligeramente inferiores que a 22 grados y 28 grados. La actividad de fermentación de la levadura es mayor a 25 grados, consumiendo más azúcares; sin embargo, debido al alto nivel de azúcar de referencia, es posible que este consumo no reduzca significativamente el total, arrojando sólo pequeñas diferencias. Las barras de error se superpusieron entre los grupos de adición de Cistanche al 3%, 5% y 7%, sin diferencias significativas, lo que indica que el nivel de adición de Cistanche tiene un efecto insignificante sobre los sólidos solubles totales, que se ven afectados principalmente por el azúcar inicial.

 

Cistanche-msalais

 

 

Detalles del listado de Cistanche Musalais

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El contenido de alcohol es el indicador más directo de la eficiencia de la fermentación; El etanol es el principal producto de la fermentación del azúcar de la levadura [10]. El grupo de 32 grados Bx mostró un contenido de alcohol significativamente mayor que los grupos de 26 grados Bx y 29 grados Bx, ya que un mayor azúcar inicial proporciona más sustrato fermentable para producir más alcohol. Por debajo de los 25 grados, el contenido de alcohol alcanzó un pico en casi todas las combinaciones iniciales de adición de azúcar y Cistanche, de acuerdo con LI et al. [11]. Una temperatura demasiado baja (22 grados) suprime la levadura, ralentizando o finalizando la fermentación de forma incompleta; demasiado alto (28 grados) puede causar una disminución prematura de la levadura o más subproductos, lo que también reduce el rendimiento final de etanol. A 25 grados, la adición de 7% de Cistanche logró el mayor contenido de alcohol, lo que sugiere que ciertos componentes de Cistanche pueden promover el crecimiento de la levadura y el vigor fermentativo.

La acidez total afecta la sensación en boca y la estabilidad. Los ácidos se originan a partir de materias primas y del metabolismo microbiano durante la fermentación. El exceso de acidez provoca notas picantes y avinagradas y debe controlarse en niveles más bajos [12]. La acidez total a 22 grados fue significativamente mayor que a 25 grados y 28 grados porque 22 grados es subóptimo para las bacterias del ácido láctico (BAL). Las bajas temperaturas inhiben fuertemente el crecimiento y el metabolismo de las BAL, haciendo que la fermentación maloláctica (FML) sea muy lenta, incompleta o incluso no iniciada; en consecuencia, el ácido málico permanece sin convertirse, elevando la acidez total medida. Por el contrario, 25 a 28 grados es un rango favorable para la FML. Las BAL son muy activas aquí y pueden convertir rápida y completamente el ácido málico en ácido láctico [13], lo que resulta en una acidez total más baja. Los efectos de la adición inicial de azúcar y Cistanche sobre la acidez total fueron menos consistentes en general; sin embargo, la condición de 25 grados con una adición del 7% comúnmente produjo una acidez moderada. Una acidez demasiado baja provoca un paladar plano; demasiado alto da nitidez; lo mejor es la moderación.

Los flavonoides totales y los polifenoles totales miden directamente los componentes funcionales y la capacidad antioxidante, procedentes principalmente del Cistanche añadido. El nivel de adición de Cistanche fue el más influyente: en la mayoría de las temperaturas y azúcares iniciales, el grupo del 7% tenía los contenidos más altos de flavonoides y polifenoles, seguido por el 5% y el 3%. Esto demuestra que aumentar Cistanche es la forma más eficaz de mejorar la funcionalidad del producto. El rendimiento a 25 grados fue superior para estos índices. Una temperatura más alta (28 grados) puede causar degradación/oxidación parcial de los activos sensibles al calor; Una temperatura más baja (22 grados) puede dificultar la extracción completa de la matriz. Para maximizar el valor para la salud (flavonoides y polifenoles totales), una adición de Cistanche del 7 % en una fermentación suave a 25 grados es clave para proteger y extraer eficientemente estos componentes.

En resumen, las condiciones óptimas en todos los tratamientos fueron: azúcar inicial 32 grados Bx, fermentación de 25 grados y adición de 7% de Cistanche. Esto equilibra la eficiencia de la fermentación, la calidad del producto y la funcionalidad. Esto difiere de ABUDUREHEMAN et al. [14]. TANG y cols. [15] Los microbios funcionales centrales encontrados en los Musalais tradicionales incluyen Blautia, Leuconostoc, Lactiplantibacillus, Rhodococcus y Thermoascus; Thermoascus impulsa la síntesis de metabolitos clave (glicina, acetamida, monacolina K, etc.). Una fermentación abierta con alto contenido de azúcar introduce múltiples fuentes de carbono, activa el metabolismo secundario y el nivel de azúcar afecta directamente las rutas biosintéticas fenólicas (vía del shikimato enriquecido con KEGG). Wen Xiaoli [16] observó que las vías de los fenilpropanoides (shikimato) promueven la acumulación de precursores fenólicos. Un ambiente con alto contenido de azúcar (32 grados Bx) promueve la aparición de levaduras osmotolerantes (p. ej., Saccharomyces) y suprime los contaminantes. Mientras que el Musalais tradicional depende de Thermoascus para la síntesis fenólica [15], en Cistanche Musalais la levadura puede utilizar directamente precursores fenólicos de Cistanche para producir fenólicos de manera eficiente [17]. Por lo tanto, las condiciones óptimas son 32 grados Bx, 25 grados y 7% Cistanche. Bajo estos, los sólidos solubles fueron (21,9 ± 1,1)%, alcohol (12,6 ± 0,6)% vol, acidez total (3,82 ± 0,19) g/L, flavonoides totales (0,80 ± 0,01) g/L y polifenoles (0,60 ± 0,00) g/L.

2.2 Compuestos de sabor volátiles en Cistanche Musalais

La Tabla complementaria 1 mejorada en línea enumera los componentes aromáticos representativos y los contenidos relativos en Cistanche Musalais frente al control Musalais. En total se identificaron 38 compuestos aromáticos: 24 ésteres, 6 alcoholes, 2 cetonas, 2 aldehídos y otros.

Los ésteres son los principales contribuyentes a los aromas frutales y vinosos, incluidos el acetato de etilo, el acetato de isoamilo y el fenilacetato de isoamilo. El acetato de etilo (afrutado, dulce) fue mucho mayor en el grupo B (7% Cistanche) con un 6,418% frente al grupo A (control) con un 2,417%. Se detectó oxalato de dietilo (aromático) sólo en el grupo B (0,521%). Los ésteres se forman a partir de ácidos orgánicos y alcoholes mediante esterasas [18]. Cistanche puede suministrar sustancias que promueven la actividad esterasa o enzimas que participan en las reacciones; su adición puede promover el crecimiento de levaduras productoras de ésteres y al mismo tiempo suprimir las productoras que no son ésteres. En relación con A, B mostró siete nuevos ésteres: acrilato de 2-etilhexilo, benzoilformiato de etilo, salicilato de etilo, valerato de hexilo, miristato de etilo, palmitoleato de etilo y oleato de etilo. Probablemente surgieron como ácidos grasos o aromáticos específicos de Cistanche que sirvieron como sustratos para la esterificación microbiana. Ciertos componentes activos (p. ej., glucósidos de feniletanoides, PhG) pueden escindirse en azúcares y agliconas; las agliconas son inestables y además se transforman microbianamente o no enzimáticamente en ácidos grasos que reaccionan con alcoholes para formar ésteres [19]. El fenilacetato de isoamilo es una fuente clave de notas melosas y florales con un umbral bajo; El palmitato de etilo más el octanoato de etilo forman aromas compuestos afrutados y grasos [20]. Los ésteres y aldehídos de bajo peso molecular son productos aromáticos secundarios críticos que se forman durante la fermentación [21] y mejoran el carácter frutal de Musalais.

Los alcoholes como el isobutanol y el alcohol isoamílico son los principales contribuyentes al sabor. El etanol, el alcohol isoamílico y el isobutanol fueron todos más bajos en el grupo B que en el A. La reducción del etanol acompañó al aumento de los ésteres, lo que indica que el flujo de carbono pasó de la acumulación de alcohol a la biosíntesis de ésteres, una dirección favorable. Los alcoholes superiores se derivan principalmente del catabolismo de aminoácidos de cadena ramificada (valina, leucina, isoleucina) a través de la vía de Ehrlich [22]. Su reducción puede indicar que Cistanche suprimió el crecimiento excesivo de cepas relacionadas o moduló el flujo de aminoácidos. Si bien los alcoholes moderadamente altos pueden agregar aroma y cuerpo, muchos tienen umbrales bajos y algunos tienen un sabor amargo; El isobutanol tiene un fuerte amargor [23]. Por lo tanto, los niveles bajos de alcohol en Cistanche Musalais pueden mejorar la comodidad al beber.

También se detectaron aldehídos, cetonas y otros compuestos, pero con menor diversidad y abundancia relativa. El grupo B mostró 2,5-dihidroxiacetofenona (dulce, floral), ausente en A, probablemente derivada de la degradación microbiana de Cistanche PhG (p. ej., echinacósido, acteósido).

GC-MS indica que la adición de Cistanche alteró significativamente el perfil volátil. El acetato de etilo (afrutado, dulce) y el palmitato de etilo (afrutado-graso) fueron los principales contribuyentes a la mejora del sabor afrutado, con un 6,42 % y un 3,75 % en Cistanche Musalais frente a un . 2.42 % y un 1,18 % en el tradicional. El isobutanol (amargo) bajó del 3,98% al 2,11%, reduciendo el amargor y mejorando el equilibrio. Los nuevos compuestos aromáticos, como la 2,5-dihidroxiacetofenona, probablemente se derivan de la degradación microbiana de los PhG, lo que diversifica el aroma. En general, la adición de Cistanche dirigió la fermentación hacia la producción de ésteres aromáticos más deseables.

2.3 Metabolómica de Cistanche Musalais

 

2.3.1 Metabolitos no volátiles

UPLC–MS/MS con una biblioteca local más bases de datos públicas identificó 11 clases de compuestos. Como se muestra en la Figura 3-a, los heterocíclicos orgánicos fueron los más abundantes (28,1% del contenido identificado), seguidos de ácidos orgánicos y derivados (18,6%), lípidos y moléculas similares a lípidos (13,8%), bencenoides (12,3%), compuestos orgánicos de oxígeno (9,6%), compuestos de bencilo y policétidos (7,0%), alcaloides y derivados (4,2%), compuestos orgánicos de nitrógeno (3,3%), nucleósidos/nucleótidos y análogos. (1,9%) y otros (0,8%).

Los heterociclos orgánicos son importantes para el sabor del vino; entre los componentes del vino de frutas, los furanos y las pirazinas son olores clave [24]. Las pirazinas tienen umbrales bajos y olores fuertes; Los furanos son lipófilos altamente volátiles y de bajo punto de ebullición, fundamentales para la formación del sabor y potencialmente beneficiosos para la salud [25]. Los ácidos orgánicos y sus derivados son esenciales para el vino; sus niveles y tipos influyen fuertemente en el sabor, el color y la estabilidad [26]. Los ácidos orgánicos surgen del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA): la glucosa forma piruvato enzimáticamente; El piruvato se convierte en acetil-CoA mediante la piruvato deshidrogenasa y luego en intermedios de TCA (citrato, malato, succinato). Además, detectamos trigonelina (hipolipidémica e hipoglucemiante) y crocina (actividad anticancerígena, antiinflamatoria, antioxidante, hepatoprotectora/colerética y antidiabética).

 

2.3.2 PCA y OPLS-DA para metabolitos no volátiles

La Figura 3-b muestra las puntuaciones de PCA para el control (A) y el 7 % de Cistanche (B) en función de todos los metabolitos identificados. Dos componentes principales explicaron ~57,8% de la varianza total (PC1 42.8%, PC2 15.2%), lo que indica que capturan la mayor parte de la información original y representan características clave entre los tratamientos [27]. Muestras agrupadas dentro de grupos; A y B se separaron claramente, lo que indica diferencias metabolómicas significativas debido a la adición de Cistanche y una buena estabilidad del sistema/confiabilidad de los datos.

La Figura 3-e muestra OPLS-DA para discriminar aún más grupos y detectar metabolitos diferenciales. Todos los puntos estuvieron dentro del intervalo de confianza del 95%; A y B estaban claramente separados, lo que indica diferencias sustanciales en la composición y abundancia de metabolitos no volátiles. Las variables y etiquetas de clase se dividieron y proyectaron para su discriminación, lo que respalda la confiabilidad [28]. La Figura 3-c muestra un gráfico de puntuación PLS-DA que trata los no volátiles identificados como variables dependientes y los tratamientos como variables independientes, lo que revela un patrón similar al PCA con una agrupación de grupos más estrecha. En las pruebas de permutación (200 veces), las métricas del modelo fueron R2Y=1 y Q2=0.866; después de 200 permutaciones, R2 y Q2 cruzaron el eje y positivo con valores del lado izquierdo menores que los del lado derecho, lo que indica validez. En PLS-DA, los valores de VIP se utilizaron para distinguir las contribuciones de metabolitos entre tratamientos [30]. Las cargas de las gráficas S identificaron características con grandes diferencias entre grupos; mayor distancia indica mayor importancia. OPLS-DA discriminó eficazmente los dos vinos, proporcionando una base sólida para la selección de metabolitos posteriores.

 

2.3.3 Agrupación jerárquica de metabolitos diferenciales clave

Según OPLS-DA con VIP> 1 y P <0,05, se identificaron 230 compuestos diferenciales: 125 regulados positivamente y 64 regulados negativamente. Debido al gran número, los 50 primeros por abundancia se utilizaron para la agrupación jerárquica. El mapa de calor (Figura 3-g) muestra cada fila como un metabolito y cada columna como una muestra [31]; el rojo indica una expresión más alta, el azul más baja. Las tres réplicas por grupo exhibieron colores similares, lo que indica buena reproducibilidad y tendencias consistentes. La Figura 3-g sugiere que el jugo de uva bajo acción microbiana produce aminoácidos, glucosa, ácidos orgánicos, terpenos, etc. Tang et al. [15] detallaron la sucesión natural de comunidades microbianas (p. ej., Aspergillus, Gluconobacter, levaduras) y los cambios de metabolitos correspondientes durante la fermentación de Musalais. El grupo A se alineó con este equilibrio microbiano inherente. Cistanche, sin embargo, no está inerte; sus bioactivos (p. ej., PhG) pueden tener efectos antimicrobianos [32], alterando el equilibrio existente. Los isómeros de mogrósido (p. ej., isómeros de mogrol), crocina B, andrografólido, etc., fueron mayores en B (7%) y menores en A, probablemente porque la potente capacidad antioxidante de Cistanche (rica en PhG) proporcionó un ambiente antioxidante que redujo la degradación oxidativa de estas moléculas. La L(+)-ornitina, la L(+)-citrulina y la vitamina B7 (biotina) fueron más bajas en B pero más altas en A, lo que sugiere que el factor externo (Cistanche) perturbó el equilibrio microbiano original, suprimió ciertas cepas funcionales y alteró las direcciones metabólicas principales. Esto indica posibles beneficios funcionales de Cistanche Musalais en comparación con el Musalais tradicional.

 

2.3.4 Componentes funcionales

La metabolómica no dirigida no solo aclaró los mecanismos de formación del sabor, sino que también identificó componentes bioactivos enriquecidos, proporcionando una base química directa para el desarrollo de productos. La trigonelina aumentó significativamente en el grupo experimental, con efectos hipoglucemiantes, hipolipidémicos y neuroprotectores documentados [33]. La crocina, un potente antioxidante soluble en agua, también aumentó significativamente, conocido por sus actividades antiinflamatorias, ansiolíticas y potencialmente anticancerígenas. Bajo el proceso óptimo (7% a 25 grados), los flavonoides totales y los fenólicos totales alcanzaron 0,80 g/L y 0,60 g/L, respectivamente, mejorando notablemente la capacidad antioxidante frente al producto tradicional. Estos enriquecimientos derivan de Cistanche (p. ej., PhG, polisacáridos) [4–5] y también pueden reflejar biotransformación microbiana y enriquecimiento durante la fermentación.

 

2.3.5 Gráfico volcánico de metabolitos diferenciales clave

El gráfico del volcán visualiza cambios en la abundancia de metabolitos. Usando VIP mayor o igual a 1 y P <0,05, se identificaron 230 compuestos diferenciales: 125 regulados al alza y 64 regulados a la baja (Figura 3-e). El eje x es el cambio de log2 veces y el eje y es −log10 P. Los metabolitos significativamente aumentados con FC mayor o igual a 1 y P <0,05 están en rojo; significativamente regulados a la baja con FC menor o igual a 1 y P <0,05 son azules; los no significativos son grises. Los 20 principales con los cambios más pronunciados bajo P <0,05 y VIP > 1 se enumeran en la Tabla complementaria 2. La mayor regulación positiva fue un derivado de glucósido (Log2FC=2.60; FC=6.06), un glucósido derivado de glucósido feniletanoide, lo que sugiere fuertemente un origen directo a partir de los constituyentes característicos de Cistanche. Cistanche es rico en PhG como echinacósido y acteósido; Durante la fermentación, estos prototipos pueden sufrir hidrólisis, transferencia de glicosilo o reordenamiento para generar dichos nuevos derivados glicosídicos. Los metabolitos diferenciales incluyeron múltiples aminoácidos y derivados, por ejemplo, (E)-N5-(1-aminoetiliden)-L-ornitina (Log2FC=1.76, arriba), trigonelloxazolidina (Log2FC=1.80, arriba) y éster etílico de metionina (Log2FC=−1.46, abajo), de acuerdo con Tang et al. [15], quienes observaron que la biosíntesis de aminoácidos en ambientes con alto contenido de azúcar sustenta la formación del sabor. La adición de cistanche puede proporcionar nitrógeno o precursores adicionales, no solo aumentando el flujo a través de las rutas de aminoácidos sino también dirigiendo hacia conversiones específicas que producen compuestos de sabor distintivos derivados de aminoácidos.

 

2.3.6 Enriquecimiento de la vía KEGG

El enriquecimiento con KEGG de metabolitos diferenciales clave (Figura 3-i) destacó las 20 vías principales: transportadores ABC, biosíntesis de aminoácidos, biosíntesis de arginina, metabolismo de purinas, biosíntesis de aminoacil-ARNt, metabolismo de D-aminoácidos, metabolismo de triptófano, metabolismo de arginina y prolina, vías metabólicas, biosíntesis de alcaloides tropano/piperidina/piridina, metabolismo de cianoaminoácidos, biosíntesis de flavonoides, Metabolismo del ácido 2-oxocarboxílico, biosíntesis de glucosinolato, biosíntesis de flavonas y flavonol, metabolismo de la cafeína, degradación de la lisina, metabolismo de la alanina/aspartato/glutamato, metabolismo de la pirimidina y metabolismo de la vitamina B6. Colores: azul para el metabolismo; naranja para procesamiento de información ambiental; Verde para el procesamiento de información genética. Entre estos, fueron significativos los transportadores ABC, la biosíntesis de aminoácidos, la biosíntesis de arginina, el metabolismo de purinas, la biosíntesis de aminoacil-ARNt y el metabolismo de D-aminoácidos, con recuentos de compuestos enriquecidos de 138, 128, 23, 101 y 52, respectivamente. Los transportadores ABC median el transporte transmembrana central en las membranas microbianas, impulsado por la hidrólisis del ATP para mover sustratos (azúcares, aminoácidos, antibióticos), afectando directamente la adquisición de nutrientes y la adaptación ambiental [34]. Gluconobacter absorbe eficazmente etanol e impulsa la fermentación acética mediante transportadores ABC [35]. La biosíntesis de aminoacil-ARNt es un paso clave que limita la velocidad de la traducción. El metabolismo de los aminoácidos desempeña un papel crucial en la fermentación del vino de frutas; sus productos pueden transformarse en compuestos aromáticos característicos como el geraniol, lo que lo convierte en una ruta clave para la formación de aromas [36].

 

3 conclusiones

Usando uvas rojas Hotan ycistanche, el proceso óptimo para Cistanche Musalais se definió como 32 grados Bx de azúcar inicial, 25 grados de temperatura de fermentación y 7% de adición de Cistanche, lo que produce alcohol (12,6 ± 0,6) % vol, acidez total (3,82 ± 0,19) g/L, flavonoides totales (0,80 ± 0,01) g/L y polifenoles (0,60 ± 0,00). g/l. GC-MS identificó 38 compuestos aromáticos (24 ésteres, 6 alcoholes, 2 cetonas, 2 aldehídos y otros). En comparación con el Musalais tradicional, los ésteres clave fueron significativamente mayores con Cistanche, por ejemplo, acetato de etilo (6,42% frente a . 2.42%) y palmitato de etilo (3,75% frente a . 1.18%), mientras que los alcoholes superiores como el isobutanol fueron inferiores (2,11% frente a . 3.98%). La metabolómica identificó 230 metabolitos significativamente diferentes (VIP mayor o igual a 1, P <0,05): 125 regulados positivamente (p. ej., isómeros de mogrol, crocina B) y 64 regulados negativamente (p. ej., L(+)-ornitina, L(+)-citrulina). El enriquecimiento con KEGG indicó agrupación primaria en transportadores ABC y vías de biosíntesis de aminoácidos. Los activos funcionales como trigonelina, crocina, flavonoides y polifenoles se enriquecieron significativamente en Cistanche Musalais, lo que sugiere posibles beneficios para la salud; La biosíntesis de aminoácidos juega un papel importante en la configuración del sabor característico. Para una atribución más profunda de olores clave, el trabajo futuro debería incluir cromatografía de gases-olfatometría (GC-O) para determinar la actividad/contribución del olor (p. ej., factores FD) de abundantes volátiles, y MS cuantitativa específica (p. ej., MRM) para la cuantificación absoluta de trigonelina, crocina, etc., para evaluar mejor el valor para la salud.

Procedencia de los recursos espectrales/metabolitos externos utilizados para la identificación de metabolitos (según las bases de datos citadas en los Métodos 1.3.8.3):

Base de datos del metaboloma humano (HMDB 5.0): https://hmdb.ca/: una base de datos completa y de libre acceso con 220 945 entradas de metabolitos que incluyen datos químicos, clínicos y bioquímicos; admite búsquedas de texto, secuencia, estructura, MS y RMN; vinculado a KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniProt y GenBank. Bases de datos asociadas: DrugBank, T3DB, SMPDB, FooDB.

MAPAS DE LÍPIDOS: https://www.lipidmaps.org/: un recurso de lipidómica gratuito y de acceso abierto. LMSD ahora supera las 50.000 estructuras lipídicas seleccionadas con clasificación, enlaces cruzados y procedencia detallados; proporciona análisis de MS, dibujo de estructuras, bases de datos espectrales, rutas y herramientas de nomenclatura/clasificación.

mzCloud – Base de datos avanzada de espectro de masas: https://www.mzcloud.org/: admite búsquedas de espectro, estructura, subestructura, árbol y m/z. Escala actual: 32.330 compuestos, 51.002 árboles y 16.531.567 espectros (+ aumentos en 2024). Optimizado para navegadores de escritorio Firefox/Chrome. Copyright © 2013–2025 HighChem LLC.

 

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