Cistanche Rb1 atenúa el deterioro vascular asociado a la edad mediante la modulación de la vía Gas6

Resultados Rb1 alivió la senescencia en las aortas de ratones envejecidos

Para identificar el efecto antisenescencia de Rb1, primero investigamos la senescencia celular, que se caracteriza por la expresión de proteínas involucradas en la inhibición del ciclo celular y la detención irreversible del crecimiento (Yang et al. 2019). Como los resultados de inmunohistoquímica se muestran en la Figura 1 (A, B), en comparación con los del grupo Young, los ratones del grupo Old þ Vehicle mostraron que el envejecimiento aceleró la regulación positiva de p21Cip1 y p16INK4a en las células de la aorta torácica. Sin embargo, el tratamiento con Rb1 alivió la senescencia celular en los vasos sanguíneos, especialmente en el grupo Old þ Rb1-20. Además, los resultados de Western blot estaban de acuerdo con laresultados inmunohistoquimicos. Como se muestra en la Figura 1(C), la expresión proteica de p21Cip1 y p16INK4a aumentó significativamente aproximadamente 2-veces en las aortas torácicas de ratones viejos en comparación con ratones jóvenes. Después del tratamiento con 20 mg/kg de Rb1, los niveles de proteína de p21Cip1 y p16INK4a aumentaron un 41,92 % y un 37,52 % en comparación con los del grupo Young, que fueron significativamente más bajos que los del grupo Old plus Vehicle. Además, no hubo diferencia significativa en la expresión de p21Cip1 o p16INK4a entre ratones jóvenes con y sin tratamiento con Rb1.

Figura 1. Efecto de Rb1 sobre la senescencia de la aorta torácica. Imágenes de la tinción inmunohistoquímica (400 ) de p21Cip1 (A) y p16INK4a (B) en secciones transversales de aorta torácica de ratón. (C) Análisis de transferencia Western de la expresión de p21Cip1 y p16INK4a de la aorta torácica de ratón. Los datos se expresan como la media ± SD. p < 0,01 frente al grupo de Young; # p < 0,05 frente al grupo de vehículos antiguos.

Rb1 mejoró la reactividad vascular en ratones de edad avanzada

Se utilizó un experimento de anillo vascular para evaluar la vasodilatación dependiente del endotelio. Como se muestra en la Figura 2, en todos los anillos aórticos torácicos de ratón, la administración de Ach resultó en vasorrelajación. En concentraciones máximas (10–5 mol/L), la Ach indujo aproximadamente un 88,84 % ± 1,20 % y un 58,35 % ± 2,50 % de vasorrelajación en el grupo Young y el grupo Old þ Vehicle, respectivamente, lo que demuestra que el envejecimiento está asociado con el deterioro de la reactividad vascular. Sin embargo, el tratamiento con 10 y 20 mg/kg de Rb1 dio como resultado aproximadamente un 70,48 % ± 2,20 % y un 80,90 % ± 3,24 % de relajación, respectivamente, en anillos aórticos torácicos de ratones envejecidos en respuesta a 10 5 mol/L de Ach.

Haga clic aquí para obtener Cistanche para combatir el envejecimiento

Rb1 redujo la expresión de moléculas de adhesión celular en las aortas torácicas de ratones envejecidos

Examinamos la expresión proteica de ciertas moléculas de adhesión celular para determinar lainflamatorioyefectos antiinflamatoriosde Rb1 en ratones envejecidos. Los resultados mostraron que la expresión proteica de ICAM-1, VCAM-1 y PAI-1 aumentó significativamente en aproximadamente 2-4 veces en las aortas torácicas de ratones de edad avanzada en comparación con los en el grupo de Jóvenes (Figura 3). Por el contrario, el tratamiento con Rb1 inhibió significativamente estos cambios en las aortas torácicas de ratones envejecidos, pero no tuvo ningún efecto en los grupos de ratones jóvenes. El análisis cuantitativo indicó que el tratamiento con 20 mg/kg de Rb1 resultó en aproximadamente un 36,58 %, 46,66 % y 49,34 % de regulación negativa de la expresión de proteínas ICAM-1, VCAM-1 y PAI-1, respectivamente. en el envejecimiento del tejido aórtico torácico, en comparación con los de los ratones del grupo Old plus Vehicle.

Rb1 inhibió la calcificación vascular y la fibrosis relacionadas con la edad

Realizamos la tinción con HE y la tinción con alizarina roja S para evaluar la estructura del tejido aórtico y la calcificación medial vascular en ratones envejecidos, respectivamente. La tinción con HE mostró que el engrosamiento de las paredes de la aorta torácica inducido por el envejecimiento y la desorganización de la matriz extracelular aórtica podrían aliviarse mediante el tratamiento con Rb1 (Figura 4(A)). Como se muestra en la Figura 4(B), los ratones envejecidos desarrollaron una calcificación medial más grave (área teñida de rojo) que los ratones jóvenes, mientras que la intervención con Rb1 redujo este cambio patológico. Luego, examinamos las secciones transversales de la aorta torácica mediante la tinción tricrómica de Masson para evaluar la fibrosis medial vascular en ratones envejecidos. Los resultados mostraron que hubo un aumento notable en la deposición de colágeno (área teñida de azul) en el grupo Old þ Vehicle en comparación con el grupo Young (Figura 4(C)), y este efecto fue significativamente inhibido por la intervención Rb1. Además, la transferencia de Western mostró que la expresión de colágeno I y colágeno III aumentó significativamente en 4.34- y 2.62-veces en los ratones del grupo Old þ Vehicle en comparación con los ratones jóvenes; sin embargo, el tratamiento con Rb1 reguló a la baja la expresión de colágeno I y colágeno III en ratones de edad avanzada (Figura 4 (D)). Además, el tratamiento con Rb1 no influyó en los grados de calcificación y fibrosis de la aorta torácica en ratones jóvenes (Figura 4(A-D)).

Rb1 regula la vía de señalización de Gas6

Investigamos más a fondo si Rb1 funcionaba a través de la vía de señalización Gas6/Axl para mejorar el deterioro de la aorta torácica asociado con la edad en ratones. La regulación a la baja de la expresión de la proteína Gas6 en un 41,72 por ciento y la expresión de ARNm en un 52,73 por ciento en ratones viejos en comparación con ratones jóvenes fue anulada por el tratamiento con Rb1 (Figura 5 (A, B)). También determinamos la expresión proteica de Axl mediante transferencia Western. Curiosamente, no hubo diferencias significativas en la expresión de la proteína Axl entre los cinco grupos experimentales (Figura 5(A)). Tampoco detectamos una diferencia significativa en los niveles de ARNm de Axl entre los grupos (Figura 5 (B)).

Figura 2. El tratamiento con Rb1 atenuó el deterioro de la vasorrelajación dependiente del endotelio asociado a la edad en los anillos vasculares de la aorta torácica. Figuras que muestran los resultados del análisis. Los datos se expresan como la media ± SD. p < 0.05, p < 0.01 frente al grupo de jóvenes; # p < 0,05, ##p < 0,01 frente al grupo de vehículos antiguos þ.

Figura 3. Rb1 redujo la expresión de moléculas de adhesión celular en aortas torácicas de ratones envejecidos. Análisis de transferencia Western de la expresión de ICAM-1, VCAM-1 y PAI-1 en tejidos de la aorta torácica. Los datos se expresan como la media ± SD. p < 0.01 frente al grupo de jóvenes; # p < 0.05, ##p < 0.01 frente al grupo de vehículos antiguos.

Discusión

En el presente estudio, demostramos que Rb1 mejoródeterioro vascular relacionado con la edadal suprimir la calcificación y la fibrosis a través de la regulación de la expresión de Gas6 pero no de la expresión de Axl, lo que proporciona una posible estrategia terapéutica para prevenir la enfermedad vascular relacionada con la edad. Está bien aceptado que la senescencia de las células vasculares, que se caracteriza por la disfunción endotelial y la transición fenotípica de las células del músculo liso, puede provocar un aumento de la rigidez vascular y un aumento del grosor de las paredes vasculares (Liu et al. 2019). La senescencia de las células vasculares es una característica común de varias enfermedades complejas relacionadas con la edad, en particular las enfermedades cardiovasculares (O'Rourke et al. 2010). Con el desarrollo de la senescencia de las células vasculares, la función vascular se deteriora (Gong et al. 2014). La disfunción vascular relacionada con la edad se ejemplifica mediante alteraciones fisiopatológicas, incluida una disminución progresiva de la vasodilatación dependiente del endotelio (Herrera et al. 2010; Gong et al. 2014). En nuestro estudio, confirmamos la senescencia celular en las aortas torácicas de ratones de edad avanzada, lo que se indicó por una mayor expresión de las proteínas relacionadas con la edad p21Cip1 y p16INK4a, así como una disminución de la vasodilatación dependiente del endotelio. La consistencia de nuestros resultados con los estudios mencionados anteriormente sugiere que hubo algunos mecanismos moleculares importantes asociados con los cambios en la fisiopatología de las células vasculares durante el envejecimiento. Los agentes que actúan sobre estos mecanismos probablemente reducirían y retrasarían en gran medida la senescencia de las células vasculares.

Figura 4. El tratamiento con Rb1 mejoró la calcificación vascular y la fibrosis inducidas por el envejecimiento. (A) Tinción con hematoxilina y eosina (HE) (400 ), (B) Tinción con rojo de alizarina S (400 ) y (C) Tinción con tricrómico de Masson (400 ) de secciones representativas de la aorta torácica en cada grupo. (D) Análisis de transferencia Western de las expresiones de colágeno I y colágeno III en tejidos de la aorta torácica. Los datos se expresan como la media ± SD. p < 0,01 frente al grupo de Young; # p < 0,05, ##p < 0,01 frente al grupo de vehículos antiguos

Figura 5. La influencia de Rb1 en la vía de señalización Gas6/Axl. (A) Se realizó transferencia Western para examinar la expresión proteica de Gas6 y Axl. (B) qPCR se realizó para examinar la expresión de ARNm de Gas6 y Axl. Los datos se expresan como la media ± SD. p < 0.05, p < 0.01 frente al grupo de jóvenes; # p < 0,05 frente al grupo de vehículos antiguos þ.

La evidencia acumulada ha revelado que Rb1 se considera un fármaco prometedor para prevenir el daño vascular (Zhou et al. 2017, 2019a, 2019b; Zheng et al. 2020). Estudios anteriores han revelado que Rb1 previene la senescencia de las células vasculares e inhibe la calcificación vascular (Nanao-Hamai et al. 2019; Zhou et al. 2019b; Zheng et al. 2020). Sin embargo, aún no está claro si Rb1 puede proteger las funciones arteriales contra el envejecimiento y el mecanismo molecular relevante. Aquí, encontramos que Rb1 redujo y retrasó la senescencia arterial en ratones de edad avanzada, como lo demuestra la disminución de la expresión de proteínas relacionadas y la vasodilatación vascular mejorada, lo que indica que Rb1 puede bloquear de manera eficiente la senescencia excesiva en las aortas torácicas de ratones envejecidos y podría usarse como un agente eficaz para tratar o prevenir el deterioro arterial relacionado con la edad.

La evidencia anterior ha demostrado la acumulación de inflamación arterial crónica de bajo grado con el avance de la edad, lo que contribuye a las alteraciones estructurales y funcionales vasculares asociadas con la edad (Wang et al. 2014). Estudios adicionales han indicado que un microambiente enriquecido en perfiles inflamatorios induce un cambio fenotípico en las VSMC del tipo contráctil al sintético. Este cambio fenotípico se caracteriza por la expresión atenuada de proteínas contráctiles específicas de SMC y la secreción de citocinas proinflamatorias adicionales, quimiocinas, proteínas ECM y moléculas de adhesión celular, como colágeno, ICAM-1, VCAM-1 , y PAI-1 (Wang et al. 2011; Lacolley et al. 2018). Además, las moléculas de adhesión contribuyen a la remodelación de las arterias inducida por la inflamación, particularmente al reorganizar las interacciones ECM-VSMC e influir en la modulación fenotípica de las VSMC (Intengan et al. 1999). Además, los estudios han demostrado que Rb1 tiene efectos antiinflamatorios in vivo e in vitro (Miao et al. 2017; Zhou et al. 2017). En el presente estudio, encontramos que el tratamiento con Rb1 podría disminuir significativamente los niveles de expresión de moléculas de adhesión celular relacionadas con procesos inflamatorios en ratones de edad avanzada, lo que sugiere que Rb1 podría actuar como un fármaco antiinflamatorio y proteger la vasculatura durante el envejecimiento.

Además del daño inflamatorio, la remodelación de la pared arterial caracterizada por calcificación y fibrosis es el otro cambio fisiopatológico principal en las modificaciones avasculares relacionadas con la edad y causa rigidez vascular que contribuye a una disminución de la vasodilatación (McEniery et al. 2005; Iyemere et al. 2006; Kovacic et al. . 2011). Estudios a gran escala han demostrado que la calcificación aterosclerótica coronaria aumenta con la edad (Tesauro et al. 2017). Otra investigación también demostró la presencia de una mayor calcificación con el envejecimiento en la región de la arteria carótida (Wendorff et al. 2015). De manera similar, nuestros resultados indicaron que los ratones envejecidos desarrollaron una calcificación medial vascular más severa que los ratones jóvenes. La intervención de Rb1 inhibió sustancialmente estos cambios. Este resultado sugirió que la administración de Rb1 alivió el grado de calcificación vascular relacionada con la edad in vivo. Evidencia suficiente ha demostrado que la calcificación vascular involucra una variedad de procesos patobiológicos en lugar de la simple deposición de calcio, entre los cuales el cambio de VSMC a células similares a osteoblastos juega un papel fundamental (Zhou et al. 2019b). Una limitación de nuestro estudio es que, a pesar de revelar que la intervención de Rb1 inhibió significativamente la calcificación vascular en aortas torácicas de ratones envejecidos, los marcadores de VSMC contráctiles (como la actina del músculo liso A y la calponina) y los marcadores de VSMC osteogénicos (como el factor de transcripción 2 relacionado con runt ) requieren mayor exploración.

Además, en el presente estudio, también observamos una disminución de los niveles de colágeno intersticial y una disminución de la expresión de proteínas relacionadas en ratones envejecidos tratados con Rb1- en comparación con ratones envejecidos tratados con vehículo, lo que sugiere que Rb1 podría tener un efecto beneficioso sobre la función vascular. en el envejecimiento de las aortas torácicas al mejorar la fibrosis vascular inducida por la edad. Harvey et al. (2016) informaron que la rigidez arterial causada por una fibrosis excesiva y una mayor deposición de colágeno podría provocar un aumento del tono vasomotor y una perfusión tisular alterada. Se considera que los agentes que atenúan la fibrosis protegen contra las enfermedades vasculares relacionadas con la edad (Kim et al. 2018).

Se puede inferir quedeterioro vascular relacionado con la edades un proceso complejo que involucra varios cambios anormales, incluyendo inflamación, calcificación y fibrosis. Más importante aún, descubrimos que Rb1 pudo inhibir estos cambios anormales conocidos en las aortas torácicas de ratones de edad avanzada. Sin embargo, el mecanismo subyacente aún se desconoce. Gas6 se identificó como el lig y para la familia de receptores TAM, especialmente los receptores de tirosina quinasa Axl (Rothlin et al. 2015). Un estudio anterior demostró las funciones de Gas6/Axl en la regulación de múltiples funciones celulares (Chen et al. 2019). Un estudio reciente sugirió que Gas6/Axl jugó un papel crucial en la calcificación vascular (Son et al. 2010; Kaesler et al. 2016; Nanao-Hamai et al. 2019) y también puede estar involucrado en la regulación negativa inducida por el tratamiento de la síntesis de colágeno en VSMC y tejido cardíaco envejecido (Chen et al. 2016; 2019). Además, estudios previos revelaron que Rb1 activó la transcripción de Gas6 en el sitio ARE específico en la región promotora (Son et al. 2010; Nanao-Hamai et al. 2019). Aquí, demostramos que la expresión de la proteína Gas6 se reguló a la baja en ratones envejecidos, pero se revirtió con el tratamiento con Rb1, lo que indica que Gas6 puede participar en la regulación mediada por Rb1-del deterioro arterial en ratones envejecidos. Sin embargo, nuestros resultados muestran que no hubo cambios en la expresión de la proteína Axl y el ARNm, lo que no concuerda con un estudio anterior (Chen et al. 2019). La familia de receptores TAM incluye Tyro3, ​​Axl y MerTK. Aunque Gas6 muestra la mayor afinidad por Axl entre los tres miembros (Rothlin et al. 2015), Sun et al. (2019) encontraron que la activación de Gas6 atenuó la lesión inflamatoria y la apoptosis en ratones, pero no se produjeron cambios en la activación de Axl entre los grupos experimentales. Otra investigación sugirió que la expresión de Axl, que inhibe la apoptosis y, por lo tanto, la calcificación vascular, tampoco se vio alterada en ratones Gas6–/– (Kaesler et al. 2016). Nuestros resultados indicaron claramente que Rb1 atenuó específicamente la regulación a la baja de Gas6 relacionada con la edad, pero no influyó en la expresión de Axl, que se informó que era el principal evento responsable de la calcificación vascular y la fibrosis, para mejorar la inflamación vascular relacionada con la edad y la vasodilatación dependiente del endotelio. . La expresión estable de Axl puede resultar de una cantidad suficiente antes de la activación de Gas6 o indicar que Gas6 funciona a través de otros receptores. Se necesita más investigación que explore los efectos de Rb1 en otros TAM que también podrían ser activados por Gas6, como Tyro3 y MerTK.

Conclusiones

En el presente estudio, confirmamos que Rb1 inhibió la calcificación vascular y la fibrosis y disminuyó la expresión de moléculas de adhesión celular, todo lo cual mejoró posteriormente la vasodilatación dependiente del endotelio vascular relacionada con la edad al menos en parte al regular la expresión de Gas6 pero no la expresión de Axl. Con el envejecimiento incontrolable, es de gran importancia encontrar agentes que puedan prevenir o tratar el deterioro de las células vasculares relacionado con la edad. Nuestro estudio proporciona evidencia que valida los efectos de Rb1 en la mejora de la lesión vascular en ratones de edad avanzada.

Declaración de divulgación

Los autores no informaron posibles conflictos de intereses.

Financiamiento Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [81370447], el Proyecto de Planificación de Ciencia y Tecnología de la provincia de Guangdong de China [2016A050502014], el Fondo de Construcción de Disciplinas Médicas Clave de Shenzhen [SZXK002] y el Fondo de Investigación Científica Médica Fundación de la provincia china de Guangdong [A2019079].

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos y materiales están disponibles previa solicitud al autor correspondiente.

Contribuciones de autor

SYK, DHL y XXQ contribuyeron a la concepción y diseño de este trabajo. LW, GYS y MW contribuyeron al análisis de datos. SYK, LW y JMZ escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final.

Referencias

Acosta JC, O'Loghlen A, Banito A, Guijarro MV, Augert A, Raguz S, Fumagalli M, Da Costa M, Brown C, Popov N, et al. 2008. La señalización de quimiocinas a través del receptor CXCR2 refuerza la senescencia. Celúla. 133(6): 1006–1018.

Brandes RP, Fleming I, Busse R. 2005. Envejecimiento endotelial. Cardiovascular Res. 66(2):286–294.

Chen FF, Song FQ, Chen YQ, Wang ZH, Li YH, Liu MH, Li Y, Song M, Zhang W, Zhao J, et al. 2019. La testosterona exógena alivia la fibrosis cardíaca y la apoptosis a través de la vía Gas6/Axl en ratones senescentes. Exp. Gerontol. 119:128–137.

Chen YQ, Zhao J, Jin CW, Li YH, Tang MX, Wang ZH, Zhang W, Zhang Y, Li L, Zhong M. 2016. La testosterona retrasa la senescencia de las células del músculo liso vascular e inhibe la síntesis de colágeno a través de la vía de señalización Gas6/Axl . Edad. 38(3):60.

Fridell YW, Villa J, Attar EC, Liu ET. 1998. GAS6 induce la quimiotaxis mediada por Axl de las células del músculo liso vascular. J Biol Chem. 273(12): 7123–7126.

Gong X, Ma Y, Ruan Y, Fu G, Wu S. 2014. La atorvastatina a largo plazo mejora la disfunción endotelial relacionada con la edad al mejorar el estrés oxidativo y normalizar el desequilibrio eNOS/iNOS en la aorta de rata. Exp. Gerontol. 52:9–17.

Harvey A, Montezano AC, Lopes RA, Ríos F, Touyz RM. 2016. Fibrosis vascular en el envejecimiento y la hipertensión: mecanismos moleculares e implicaciones clínicas. Can J Cardiol. 32(5):659–668.

Herrera MD, Mingorance C, Rodriguez-Rodriguez R, Alvarez de Sotomayor M. 2010. Disfunción endotelial y envejecimiento: una actualización. Envejecimiento Res Rev. 9(2):142–152.

Hsu JJ, Lu J, Umar S, Lee JT, Kulkarni RP, Ding Y, Chang CC, Hsiai TK, Hokugo A, Gkouveris I, Tetradis S, et al. 2018. Efectos de la teriparatida en la morfología de la calcificación aórtica en ratones hiperlipidémicos de edad avanzada. Soy J Physiol Corazón Circ Physiol. 314(6):H1203–H1213.

Hurtado B, Abasolo N, Muñoz X, García N, Benavente Y, Rubio F, García de Frutos P, Krupinski J, Sala N. 2010. Estudio de asociación entre polimorfismos en genes GAS6-TAM y aterosclerosis carotídea. Thromb Haemost. 104(3):592–598.

Intengan HD, Thibault G, Li JS, Schiffrin EL. 1999. Mecánica de la arteria de resistencia, estructura y componentes extracelulares en ratas espontáneamente hipertensas: efectos del antagonismo del receptor de angiotensina y la inhibición de la enzima convertidora. Circulación. 100(22):2267–2275.

Iyemere VP, Proudfoot D, Weissberg PL, Shanahan CM. 2006. Plasticidad fenotípica de las células del músculo liso vascular y la regulación de la calcificación vascular. J Intern Med. 260(3):192–210.

Kaesler N, Immendorf S, Ouyang C, Herfs M, Drummen N, Carmeliet P, Vermeer C, Floege J, Kruger T, Schlieper G. 2016. Proteína Gas6: su papel en la calcificación cardiovascular. BMC Nephrol. 17(1):52. Kim EN, Kim MY, Lim JH, Kim Y, Shin SJ, Park CW, Kim YS, Chang YS, Yoon HE, Choi BS. 2018. El efecto protector del resveratrol sobre el envejecimiento vascular por modulación del sistema renina-angiotensina. Aterosclerosis. 270: 123–131. Korshunov VA, Mohan AM, Georger MA, Berk BC. 2006. Axl, un receptor de tirosina quinasa, media en la remodelación vascular inducida por el flujo. Circo Res. 98(11):1446–1452.