Abstracto

ObjetivoInvestigar el efecto reductor del ácido úrico y la evaluación de seguridad del equinacósido (Ech) extraído decistanche tubulosa. MétodosEn la prueba de toxicidad aguda, a los ratones KM se les administró Ech por vía oral en la concentración máxima dos veces al día para la observación de la toxicidad aguda. Se estableció un modelo de rata con hiperuricemia (HUA) utilizando 1,5 g·kg⁻¹ de oxonato de potasio + 0.1 g·kg⁻¹ de adenina. Las ratas modelo HUA se dividieron aleatoriamente en un grupo modelo, un grupo de alopurinol (30 mg·kg⁻¹) y grupos de Ech en dosis baja, media y alta (50, 75, 100 mg·kg⁻¹), con un grupo de control normal (n=10 por grupo). Los fármacos se administraron por vía intragástrica una vez al día durante 28 días consecutivos. Después de la administración, se sacrificaron las ratas y se recogió suero para detectar indicadores bioquímicos relevantes y niveles de xantina oxidasa (XOD); Se observaron cambios histopatológicos renales. Se pesaron los órganos para calcular los coeficientes de los órganos; Se detectaron los niveles de expresión de genes y proteínas relacionados en el tejido renal.ResultadosEn la prueba de toxicidad aguda no se observaron reacciones tóxicas evidentes. Ech redujo significativamente los niveles séricos de ácido úrico, mejoró notablemente la función renal y las lesiones tubulares/intersticiales renales en ratas modelo HUA, y reguló significativamente los niveles de transcripción y expresión de proteínas de genes relacionados con el transportador de urato en el tejido renal.ConclusiónEl efecto reductor del ácido úrico de Ech en ratas modelo HUA puede estar relacionado con la reducción de la producción de ácido úrico in vivo, la regulación de la función renal y la modulación de la expresión de los transportadores de urato, con una seguridad favorable.Palabras clave: cistanche tubulosa; equinacósido; Hiperuricemia; ácido úrico; Transcripción genética; Expresión de proteínas; Mecanismo de acción; Evaluación de seguridad

 

 

 

cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight es una hierba tonificante de los riñones de uso común en la medicina tradicional china (MTC). Según consta en elFarmacopea china, repone el yang del riñón, repone la esencia y la sangre, y se utiliza clínicamente para la impotencia y la infertilidad, la deficiencia de esencia y sangre y el dolor de cintura y rodillas. Los glucósidos feniletanoides son los componentes más abundantes y biológicamente activos encistanche tubulosa, mostrando un gran potencial de desarrollo y aplicación. Nuestro equipo de investigación descubrió previamente a través de farmacología en red y experimentos preliminares con ratones que el equinacósido (Ech) decistanche tubulosaEl extracto puede ejercer efectos reductores del ácido úrico, mientras que rara vez se informa sobre su mecanismo y seguridad. Este estudio toma la patogénesis de la hiperuricemia como punto de entrada para examinar el efecto farmacológico reductor del ácido úrico de Ech, con el objetivo de aclarar su mecanismo y evaluar su seguridad.

1 Materiales y métodos

1.1 Instrumentos, Reactivos y Animales

Analizador bioquímico automático 7100 (Hitachi, Japón); Lector de microplacas Multiskan GO 1510 (Thermo, EE. UU.); Sistema de electroforesis BG-Power600i (Beijing Baijing Biotechnology Co., Ltd.); Sistema de PCR cuantitativa fluorescente rápido en tiempo real 7500 (Applied Biosystems, EE. UU.).

cistanche tubulosa extract (Ech, self-prepared, chromatographic purity >98%); oxonato de potasio, adenina (Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); kits de ensayo de creatinina (CREA), ácido úrico (UA), urea (UREA), adenosina desaminasa (ADA), alanina transaminasa (ALT), aspartato transaminasa (AST), fosfatasa alcalina (ALP) (Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.); kit de ensayo de actividad XOD (Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.); anticuerpos URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3 (Jiangsu Qinke Biotechnology); conjugado de IgG anti-conejo de cabra/HRP (Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., lote: 245440113); DEPC (Amresco, EE.UU.); marcador de ADN M5 HiClear DL2000 (Beijing Juhemai Biotechnology Co., Ltd.); reactivo TRIzol™ (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.); 5 × MasterMix RT todo en uno, EvaGreen Express 2 × qPCR MasterMix-Low ROX (Aibimeng Biotechnology Co., Ltd.).

El Centro Experimental de Animales de la Universidad Médica de Xinjiang proporcionó cuarenta ratones KM de grado SPF (machos y hembras, 18 a 22 g) y 90 ratas SD macho de grado SPF (150 a 180 g) (licencia de producción n.° SCXK Xin 2023-0001).

1.2 Métodos y resultados

1.2.1 Prueba de toxicidad aguda

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Instituto de Investigación de Medicamentos de Xinjiang (números de aprobación IACUC-(Zhun)-2024-008, IACUC-(Zhun)-2024-009). Cuarenta ratones KM de grado SPF se dividieron aleatoriamente en un grupo de control y un grupo de tratamiento (n=20, machos y hembras) después de la cuarentena y la aclimatación. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche con libre acceso al agua antes de la administración. Según elDirectrices para pruebas de toxicidad de dosis única de medicamentos tradicionales chinos y productos naturales, se preparó la solución de concentración máxima (250 mg·mL⁻¹) que se podía pasar a través de una aguja de sonda de calibre 12. A los ratones KM se les administró por vía oral 40 ml·kg⁻¹ dos veces al día en un intervalo de 4 horas, con una dosis acumulativa de 20 g·kg⁻¹. Se observaron de cerca las condiciones generales, el color del pelaje, la actividad, la forma de andar, el estado mental, las heces y la orina para detectar síntomas tóxicos, tiempo de aparición, duración y recuperación. No se observaron reacciones tóxicas adversas (p. ej., actividad restringida, postración, apatía, muerte) en el grupo de tratamiento. El color del pelaje, la actividad, la forma de andar, el estado mental, las heces y la orina permanecieron normales durante el período de observación. El peso corporal y la ingesta de alimentos no mostraron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y control. La necropsia macroscópica al final de la observación no reveló anomalías en el volumen, color o textura de los órganos.

 

Figura 1 Efectos del peso corporal (AB) y la ingesta de alimentos (C,D) en ratones

 

1.2.2 Establecimiento, agrupación y administración del modelo

Se aclimataron sesenta ratas SD macho (150–180 g) y se dividieron en un grupo de control normal (n=10) y un grupo de modelado (n=50). Al grupo de modelado se le administraron por vía intragástrica 100 mg·kg⁻¹ adenina + 1.5 g·kg⁻¹ oxonato de potasio (suspendido en CMC-Na al 0,5%) a 10 ml·kg⁻¹ una vez al día durante 14 días; el grupo de control recibió CMC-Na al 0,5%. Después del modelado, se recogió sangre orbital para detectar UREA, CREA y ácido úrico sérico (SUA). El modelo se consideró exitoso cuando UREA, CREA y SUA estaban significativamente elevados. Las ratas modelo HUA exitosas se dividieron en un grupo modelo, un grupo de alopurinol (30 mg·kg⁻¹) y grupos de Ech de dosis baja, media y alta (50, 75, 100 mg·kg⁻¹) (n=10 por grupo). Para mantener la hiperuricemia estable, a todos los grupos, excepto al grupo de control, se les administró por vía intragástrica 100 mg·kg⁻¹ adenina + 500 mg·kg⁻¹ oxonato de potasio (suspensión de CMC-Na al 0,5%) cada mañana y los medicamentos correspondientes cada tarde durante 14 días. Luego se suspendieron los agentes de modelado, mientras que la administración del medicamento continuó durante otros 14 días.

1.2.3 Determinación de SUA y ácido úrico en orina (UUA) en ratas

Después de la última administración, las ratas permanecieron en ayunas durante la noche con libre acceso al agua. Se recogió orina, se centrifugó (3 x 10³ r·min⁻¹, 10 min), se diluyó 1:9 con solución salina y se analizó la UUA utilizando un analizador bioquímico. Se recogió sangre bajo anestesia y se separó el suero (3 x 10³ r·min⁻¹, 10 min) para la detección de SUA. En comparación con el grupo de control, el grupo modelo mostró un aumento significativo de SUA (P<0.05) and decreased UUA (P<0.01). The allopurinol group and low-, medium-, and high-dose Ech groups had significantly reduced SUA (P<0.05); the allopurinol group and medium-/high-dose Ech groups had significantly increased UUA (P<0.05 or P<0.01).

 

Figura 2 Efecto de Ech sobre SUA(A) y UUA(B) en ratas modelo de hiperuricemia

 

1.2.4 Determinación de los niveles séricos de ADA y XOD en ratas

La ADA sérica se midió utilizando un analizador bioquímico; La actividad XOD se detectó mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (absorbancia a 290 nm). En comparación con el grupo normal, el grupo modelo tenía ADA y XOD significativamente elevados (P<0.01). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly reduced ADA (P<0.01); the allopurinol group and high-dose Ech group had significantly reduced XOD (P<0.01).

1.2.5 Determinación de los niveles séricos de UREA, CREA, ALT, AST y ALP

En comparación con el grupo normal, el grupo modelo tenía UREA y CREA significativamente elevadas (P<0.05 or P<0.01). Compared with the model group, the allopurinol group had significantly reduced UREA (P<0.01); all Ech dose groups had significantly reduced UREA and CREA (P<0.05 or P<0.01); medium-/high-dose Ech groups had significantly reduced ALT (P<0.01); low-dose Ech group had significantly increased ALP (P<0.01).

1.2.6 Determinación del coeficiente de órganos renales en ratas

Coeficiente de órganos=masa de órganos (mg)/peso corporal (g). En comparación con el grupo normal, el grupo modelo había disminuido significativamente el peso corporal en ayunas (P<0.01) and increased kidney and adrenal gland coefficients (P<0.05 or P<0.01). Compared with the model group, all Ech dose groups had significantly increased body weight (P<0.05); the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly reduced kidney coefficients (P<0.01).

 

Tabla 1 Efectos de Ech sobre los niveles de UREA, CREA, ALT, AST y ALP en ratas modelo de hiperuricemia (xˉ±s, n=10)

 

Grupo	Dosis / mg·kg⁻¹	UREA / mmol·L⁻¹	CREA/μmol·L⁻¹	ALT / U·L⁻¹	AST / U·L⁻¹	ALP / U·L⁻¹
Control	–	8.00 ± 0.71	34.11 ± 3.33	51.22 ± 3.80	109.11 ± 11.62	206.00 ± 42.20
Modelo	–	23.20 ± 6.05**	100.10 ± 43.59*	62.00 ± 9.64	109.10 ± 7.92	173.10 ± 27.30
alopurinol	30	10.70 ± 1.95##	55.20 ± 13.27	52.70 ± 12.79	117.50 ± 21.71	198.40 ± 52.66
	50	11.20 ± 3.33##	44.80 ± 21.01#	55.70 ± 12.59	106.10 ± 13.80	242.11 ± 55.04##
	75	9.90 ± 1.45##	41.20 ± 4.54#	46.50 ± 5.72##	102.10 ± 16.11	183.70 ± 22.31
	100	8.90 ± 1.10##	35.20 ± 2.74#	46.50 ± 5.72##	106.00 ± 15.19	195.20 ± 33.96

Nota:Comparado con el grupo de control: *P<0.05, **P<0.01; compared with model group: #P<0.05, ##P<0.01

 

Tabla 2 Efectos de Ech sobre los coeficientes orgánicos en ratas modelo de hiperuricemia (xˉ±s, n=10)

 

Grupo	Dosis / mg·kg⁻¹	Peso corporal en ayunas / g	Coeficiente hepático	Coeficiente renal	Coeficiente de la glándula suprarrenal	Coeficiente del bazo	Coeficiente del timo
Control	–	403.6 ± 28.0	26.92 ± 3.15	6.57 ± 0.55	0.14 ± 0.04	1.88 ± 0.26	1.07 ± 0.15
Modelo	–	352.5 ± 38.5**	26.60 ± 1.78	11.52 ± 1.67**	0.18 ± 0.03*	2.12 ± 0.23	1.03 ± 0.17
alopurinol	30	367.5 ± 26.3	25.76 ± 1.14	7.93 ± 0.51##	0.16 ± 0.03	1.93 ± 0.35	1.08 ± 0.27
ech	50	392.3 ± 28.3#	27.04 ± 2.14	8.06 ± 0.54##	0.16 ± 0.04	2.09 ± 0.24	1.09 ± 0.19
	75	388.4 ± 34.8#	26.78 ± 2.37	7.80 ± 0.78##	0.16 ± 0.02	2.00 ± 0.20	0.99 ± 0.25
	100	386.3 ± 41.4#	25.91 ± 1.46	7.58 ± 0.33##	0.18 ± 0.03	2.09 ± 0.28	1.17 ± 0.31

Nota:Comparado con el grupo de control: *P<0.05, **P<0.01; compared with model group: #P<0.05, ##P<0.01

 

 

 

1.2.7 Observación histopatológica del riñón de rata (tinción HE)

Los tejidos renales se fijaron, deshidrataron, incluyeron, seccionaron (4 μm), se tiñeron con HE y se sellaron. El grupo modelo mostró desprendimiento de células epiteliales tubulares renales, infiltración de células necróticas e inflamatorias e infiltración inflamatoria focal en el intersticio renal. El grupo de alopurinol mostró lesiones leves; Cada grupo de tratamiento mostró una reducción de la descamación de células epiteliales, necrosis e infiltración inflamatoria.

 

 

Figura 4 Imagen de tinción HE del tejido renal de rata del grupo de control (A), grupo modelo (B), grupo alopurinol (C, D), bajo (E) y alto
(F)grupos de dosis de Ech(×400)

 

1.2.8 Expresión proteica de URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3 en riñón de rata

Se realizó inmunohistoquímica para detectar la expresión de proteínas (densidad óptica integrada, IOD). En comparación con el grupo normal, el grupo modelo tenía URAT1 y GLUT9 significativamente aumentados (P<0.01) and downregulated OAT1 and OAT3 (P<0.05). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly downregulated URAT1 and GLUT9 (P<0.05, P<0.01) and upregulated OAT1 (P<0.05, P<0.01); the allopurinol group and medium-/high-dose Ech groups had significantly upregulated OAT3 (P<0.05, P<0.01).

 

Figura 5 Efectos de los valores EchonURAT1/IOD (A), GLUT9/IOD (B), OAT1/IOD (C) y OAT3/IOD (D) en
tejido renalde hiperuricemia modelo de ratas

 

Figura 6 Efectos de Ech sobre la expresión renal de URAT1 en ratas modelo de hiperuricemia

(Grupo de control (A), grupo modelo (B), grupo de alopurinol (C) y grupos Ech de 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ (D–F); IHC ×400)

 

Figura 7 Efectos de Ech sobre la expresión renal de GLUT9 en ratas modelo de hiperuricemia

(Grupo de control (A), grupo modelo (B), grupo de alopurinol (C) y grupos Ech de 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ (D–F); IHC ×400)

Figura 8 Efectos de Ech sobre la expresión renal de OAT3 en ratas modelo de hiperuricemia

(Grupo de control (A), grupo modelo (B), grupo de alopurinol (C) y grupos Ech de 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ (D–F); IHC ×400)

Figura 9 Efectos de Ech sobre la expresión renal de OAT1 en ratas modelo de hiperuricemia

(Grupo de control (A), grupo modelo (B), grupo de alopurinol (C) y grupos Ech de 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ (D–F); IHC ×400)

 

 

1.2.9 Expresión de ARNm de URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3 en riñón de rata

El ARN total se extrajo y se transcribió de forma inversa; La qPCR se realizó utilizando el método 2⁻ΔΔCt. En comparación con el grupo normal, el grupo modelo tenía un ARNm de URAT1 y GLUT9 significativamente aumentado (P<0.05) and downregulated OAT1 and OAT3 mRNA (P<0.05). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly downregulated URAT1 mRNA (P<0.05); the allopurinol group and low-/medium-dose Ech groups had significantly downregulated GLUT9 mRNA (P<0.05); the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly upregulated OAT1 and OAT3 mRNA (P<0.05).

 

Tabla 3 Secuencias de cebadores

 

Nombre del cebador	Secuencia (5′ a 3′)	Tamaño del producto
URAT1-	F: GTTCCCATGGCCTCCAGATTR: CATATGCATGCCACACAGCC	121 bp
GLUT9	F: TCTGCCTTGGCTGAGTATTGAR: ATGTGTCCCCCACATCATTGT	2147 bp
OAT1	F: TGTGAAGCCCTTCCGTTCTCR: TGTGAAGCCCCTTCCGTTCTC	218 bp
OAT3	F: TACCTGCATGTGACCTTGCTGR: GAGACACTTCTCAGGCTTCCC	171 bp
-Actina	F: CCCATCTATGAGGGGTTACGCR: TTTAATGTCACGCACGATTTC	150 bp

 

1.2.10 Análisis estadístico

Los datos se analizaron utilizando SPSS 20.0, expresados ​​como media ± desviación estándar (x̄±s). Se utilizó ANOVA unidireccional para comparaciones de grupos y LSD o T2 de Tamhane para pruebas post hoc. PAG<0.05 was considered statistically significant.

Figura 5 Efectos de los valores de EchonURAT1/IOD (A), de GLUT9/IOD (B), de OAT1/IOD (C) y de OAT3/IOD (D) en tejido renal de ratas modelo de hiperuricemia

 

2 Discusión

La hiperuricemia persistente causa lesión renal inducida por ácido úrico y altera los biomarcadores de la función renal. Este estudio estableció un modelo de rata HUA utilizando adenina combinada con oxonato de potasio, con UREA, CREA y SUA como indicadores clave. Los resultados mostraron que Ech decistanche tubulosamejoró la función renal y redujo SUA en ratas modelo HUA, ejerciendo efectos terapéuticos. La hiperuricemia surge de una producción excesiva de ácido úrico y de una excreción alterada. La XOD y la ADA hepáticas son enzimas clave en la síntesis de ácido úrico; la sobreproducción es una de las principales causas de HUA. Aproximadamente dos tercios del ácido úrico diario se excretan a través de los riñones, lo que hace que la disfunción de la excreción renal sea el factor principal. URAT1 y GLUT9 median la reabsorción de ácido úrico, mientras que OAT1 y OAT3 facilitan la excreción de ácido úrico; todos ellos son objetivos clave para el desarrollo de fármacos que reducen el ácido úrico. Ech redujo significativamente la ADA y XOD hepáticas, la regulación negativa de URAT1/GLUT9 renal (proteína y ARNm) y la regulación positiva de OAT1/OAT3 (proteína y ARNm), lo que indica que su efecto reductor del ácido úrico actúa reduciendo la síntesis y regulando los transportadores. En las pruebas de toxicidad aguda, no se observó mortalidad ni toxicidad aguda evidente en ratones. Ech mejoró la función renal y redujo la ALT hepática en ratas HUA sin afectar la AST ni los coeficientes de órganos, lo que confirma una seguridad favorable. En conclusión, Ech ejerce importantes efectos reductores del ácido úrico en ratas HUA inducidas por adenina-oxonato de potasio al suprimir la síntesis de ácido úrico mediada por ADA/XOD, proteger la función renal y equilibrar la expresión del transportador de urato, con seguridad confiable para una posible aplicación clínica.

Referencias

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Niu YF, Zhou YF, Lin H, et al. Inhibición de 3,5,2′,4′-tetrahidroxicalcona en la producción de ácido úrico en ratones hiperuricémicos inducidos por hipoxantina [J]. Boletín biológico y farmacéutico, 2018, 41(1): 99–105.

Frédéric L. Gout: una actualización[J]. Revista de cirugía de huesos y articulaciones, 2019, 86(1): 103–115.

Takeo N, Kouhei O, Sho S, et al. Cooperación funcional de URAT1 (SLC22A12) y URATv1 (SLC2A9) en la reabsorción renal de urato [J]. Trasplante de diálisis de nefrología, 2013, 28(3): 603–611.

Lee SY, Cho SS, Han KM, et al. El ginseng rojo coreano mejora los niveles séricos de ácido úrico mediante la regulación negativa de URAT1 y la regulación positiva de OAT1 y OAT3[J]. Boletín biológico y farmacéutico, 2024, 47(11): 1876–1882.

Falah K, Zhang P, Nigam AK, et al. Regulación in vivo de productos naturales, antioxidantes y nutrientes de moléculas pequeñas por OAT1 y OAT3 [J]. Nutrientes, 2024, 16(14): 2242.

 

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