Cistanche tubulosa induce la apoptosis mediada por especies reactivas de oxígeno de células de cáncer de colon humano primario y metastásico

Afnan Saleh Al-Menhali, Safia Ali Jameela, Aishah A. Latiff, Mohamed A. Elrayess, Mohammed Alsayrafi, Morana Jaganjac

Anti Doping Lab Qatar, Toxicología y Multipropósito, Doha, Qatar.

Laboratorio Antidopaje de Qatar, Investigación en Ciencias de la Vida, Doha, Qatar.

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com

RESUMEN

El cáncer de colon es el tercer cáncer más común en todo el mundo. Las terapias convencionales han demostrado una eficacia moderada con efectos adversos graves, por lo que existe una necesidad urgente de alternativas más seguras. En este estudio,Cistanchetubulosa, un nombre local Thanoon, se consideró como una estrategia fitoterapéutica potencial debido a su alto potencial terapéutico conocido en la medicina tradicional y su amplia abundancia en la región de Medio Oriente. Los compuestos bioactivos se extrajeron de polvoCistanchetubulosay probado por sus propiedades anticancerígenas contra cuatro coloncáncerlíneas celulares que incluyen dos derivadas del tumor primario (CaCo2 y HCT116) y dos derivadas del sitio metastásico (LoVo y SW620). El efecto deCistanchetubulosaTambién se investigó sobre la inducción de la apoptosis y la homeostasis redox celular.Cistanchetubulosaexhibió una inhibición de la proliferación dependiente de la concentración y el tiempo de todas las líneas celulares de cáncer probadas en más del 60 por ciento después de 72 horas de tratamiento con 1 mg/mL de extracto crudo. La inhibición de la proliferación estuvo marcada por la inducción de la apoptosis, la producción de especies reactivas de oxígeno intracelular y superóxidos mitocondriales. Estos datos sugieren que Cistanche tubulosa es un candidato prometedor para la terapia aditiva contra el cáncer de colon. Este es el primer estudio que muestra la bioactividad anticancerígena de Cistanche tubulosa contra las células de cáncer de colon.

El ingrediente activo deCistanchetiene uncontra el cáncerefecto

Abreviaturas:

7-AAD, 7-amino-actinomicina D;

CTE,Cistancheextracto de tubulosa;

EMEM, Medio Esencial Mínimo de Eagle;

FBS, suero bovino fetal; DCF, 2,7-diclorofluoresceína;

DCFH-DA, diacetato de 2,7-diclorodihidrofluoresceína;

DMEM, medio de Eagle modificado por Dulbecco;

DMSO, dimetilsulfóxido; MTT, 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio;

PE, ficoeritrina; RFU, unidades relativas de fluorescencia;

ROS, especies reactivas de oxígeno

INTRODUCCIÓN

El cáncer colorrectal es uno de los cánceres más comunes en todo el mundo (Brenner et al., 2014), y su incidencia aumenta constantemente con un estimado de 2,4 millones de casos en 2035, debido a la dieta y el estilo de vida modernos, junto con la actividad física reducida. Los esfuerzos actuales no son suficientes para combatir la epidemia actual de cáncer colorrectal y, por lo tanto, se necesitan enfoques novedosos para una prevención y un tratamiento efectivos que incluyan cambios en el estilo de vida en combinación con intervenciones alternativas más seguras, como los fitoterapéuticos (Weidner et al., 2015). La fitoterapia, el uso de plantas medicinales para tratar enfermedades, ha sido una parte inevitable de la historia humana antigua. Las plantas medicinales se han utilizado durante mucho tiempo como fuentes alternativas de tratamiento para el cáncer y representan más del sesenta por ciento de los agentes anticancerígenos utilizados en la medicina convencional (Balunas y Kinghorn, 2005; Saibu et al., 2015). Algunos de los ejemplos más conocidos incluyen extractos de Catharanthus roseus G. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) y Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg y Newman, 2005; da Rocha et al., 2001). Se demostró que varios extractos de hierbas y fitoquímicos ejercen efectos antitumorales en el cáncer colorrectal atribuidos a la inducción de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la apoptosis asociada de las células cancerosas, como en el caso de los extractos de Melissa officinalis (Weidner et al., 2015).

Cistanchedeserticola tiene el efecto de inhibircélulaapoptosis

Entre los candidatos fitoterapéuticos,Cistanchetubulosa, una planta del desierto parásita de Orobanchaceae (Jiang et al., 2009) que está ampliamente distribuida en las regiones áridas y semiáridas de África, Asia y la región del Mediterráneo, ha demostrado tener valiosas propiedades medicinales.Cistanchetubulosa se ha utilizado ampliamente en la medicina tradicional y se ha sugerido que tiene efectos curativos en la deficiencia renal, la leucorrea mórbida, la metrorragia, la infertilidad femenina y el estreñimiento senil (Jiang et al., 2009). Además de sus usos medicinales tradicionales, importantes propiedades medicinales de Cistanche tubulosa se ha estudiado intensamente durante la última década, incluidos los efectos vasorrelajantes (Yoshikawa et al., 2006), hepatoprotectores (Morikawa et al, 2010), antihiperglucémicos e hipolipidémicos (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosawas también se sugiere como un potente potenciador del sistema inmunitario, promotor de la formación ósea y agente antienvejecimiento y antifatiga (Xu et al., 2014). Además, se ha demostrado que el extracto de Cistanche tubulosa bloquea el depósito de amiloide en el modelo de la enfermedad de Alzheimer (Wu et al., 2015). A pesar de sus diversos usos terapéuticos, aún no se ha estudiado el efecto de Cistanche Tubulosa como potencial agente anticancerígeno.

En el presente trabajo, hemos investigado el efecto anticancerígeno deCistancheTubulosa en dos líneas celulares de cáncer de colon primario y dos metastásicos y los mecanismos potenciales que subyacen a este efecto.

MATERIALES Y MÉTODOS

Recolección y preparación de extracto de plantas.

las muestras deCistanchetubulosa se recogieron de las zonas desérticas de Qatar durante 2014 y un herpetólogo confirmó la autenticidad de la planta. Las muestras de comprobantes se archivan en el Departamento de Toxicología y Usos Múltiples de la ADLQ. Las muestras de plantas secadas al sol se molieron con Retsch Knife Mill Grindomix GM300 hasta obtener un polvo fino. Se extrajeron veinte gramos de polvo con 200 ml de agua ultrapura durante la noche a 37 grados en un agitador rotatorio a las 200 pm. el crudoCistancheLos extractos de tubulosa (CTE) se centrifugaron durante 30 min a 8000 rpm para sedimentar los compuestos no solubles, se recogió el sobrenadante y se liofilizó usando Labconco Freezone 6 plus Freeze Dryer. El extracto seco se reconstituyó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, SIGMA, Alemania) a una concentración de 20 mg/ml y se filtró de forma estéril a través de un filtro de membrana de 0,2-micras.

Líneas celulares y mantenimiento celular.

Las líneas celulares de carcinoma de colon humano CaCo2, SW620 y LoVo se obtuvieron de Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Alemania), mientras que la línea celular HCT 116 fue un obsequio amable del Departamento de Ciencias Biológicas y Ambientales de la Universidad de Qatar. CaCo2 y HCT11 se derivaron del sitio primario de carcinoma de colon, mientras que SW620 y LoVo se derivaron del sitio metastásico. Las células SW620, HCT116 y LoVo se cultivaron y mantuvieron en medio DME, mientras que las células CaCo2 se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM, SIGMA, Alemania). Las células se cultivaron como monocapa a 37 grados en el medio respectivo suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, SIGMA, Alemania) y penicilina/estreptomicina al 1 % (SIGMA, Alemania) en una atmósfera humidificada que contenía dióxido de carbono al 5 %.

Ensayo de viabilidad celular

El ensayo {{0}}[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) se utilizó para evaluar la actividad citotóxica de CTE de manera similar a como se describió anteriormente (Jaganjac et al., 2010). La densidad de siembra de células CaCo2, HCT116, SW620 y LoVo cultivadas en 96-placas de pocillos fue de 104 células por pocillo. Las células se sembraron en placas en el medio respectivo suplementado con FBS al 10 por ciento 24 horas antes del tratamiento. Después de 24 horas, se retiró el medio y las células se trataron con 0, 0,25, 0,5, 1 y 2 mg/mL de CTE durante 24, 48 y 72 horas a 37 grados en una atmósfera humidificada que contenía 5 por ciento de CO2. Tras el tratamiento con CTE, se retiró el medio y se añadieron 40 µl de solución de MTT (0,5 mg/ml) a cada pocillo.

Después de 3 h de incubación, se eliminó la solución de MTT, el producto de formazán se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO, SIGMA, Alemania) y se midió la absorbancia a 590 nm con un lector de microplacas (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Suiza).

Ensayo de apoptosis

La apoptosis en células CaCo2, HCT116, SW620 y LoVo se detectó utilizando el kit I de detección de apoptosis de anexina V de PE con 7-amino-actinomicina D (7-AAD) como colorante vital (Becton Dickinson International, Bélgica) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron en 24-placas de pocillos a una densidad de 5 × 104 células/pocillo en un medio respectivo suplementado con FBS al 10 % durante 24 h antes de añadir CTE (0, 0,5, o 1 mg/mL). Después de una incubación de 24 CTE, las células se recolectaron, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato fría y se tiñeron con ficoeritrina (PE) anexina V y 7-AAD durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Las células teñidas se analizaron en 1 hora mediante citometría de flujo usando FACS. Citómetro de flujo Aria III y software FACSDiva (Becton Dickinson) a un caudal bajo con un mínimo de 104 células. Se usó el tratamiento de las células durante 4 horas con camptotecina 6 µM (SIGMA) como control positivo para el ensayo.

Producción intracelular de ROS

La producción intracelular de ROS se examinó utilizando diacetato de 2,7-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA, SIGMA, Alemania). DCFH-DA es una sonda no fluorescente, que se oxida con ROS intracelular al compuesto fluorescente 2,7-diclorofluoresceína (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). El ensayo DCFH DA se realizó de manera similar a como lo describimos anteriormente (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Brevemente, la densidad de siembra de células CaCo2, HCT116, SW620 y LoVo cultivadas en 96-placas negras de pocillos fue de 104 células por pocillo. Las células se sembraron en el medio respectivo complementado con FBS al 10 por ciento durante 24 horas. Antes del tratamiento, las células se incubaron con DCFH-DA 10 µM a 37 grados durante 30 min en 5 por ciento de CO2/95 por ciento de aire. A continuación, las células se lavaron y trataron con 0, 0,5 y 1 mg/ml de CTE en el medio sin rojo de fenol. La formación intracelular de ROS se monitoreó continuamente durante 25 horas a 37 grados y 5 por ciento de CO2 utilizando un lector de microplacas con módulo de control de gas y fluorescencia superior (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Suiza). La intensidad de fluorescencia se midió con una longitud de onda de excitación de 500 nm y detección de emisión a 529 nm. Las unidades arbitrarias, unidades relativas de fluorescencia (RFU), se basaron directamente en la intensidad de la fluorescencia.

Generación de superóxido mitocondrial

La capacidad de CTE para inducir la generación de superóxido por parte de las mitocondrias se estimó utilizando una sonda roja MitoSOX dirigida a mitocondrias permeable a las células (Life Technologies) y Hoechst 33342 para tinción nuclear (Life Technologies). Se sembraron células CaCo2, HCT116, SW620 y LoVo en 96-placas de pocillos a una densidad de 104 células por pocillo en un medio respectivo suplementado con FBS al 10 % durante 24 horas. A continuación, las células se cargaron con 4 µM de MitoSOX y 2 µM de Hoechst 33342 durante 20 min, se lavó el exceso de colorante y se trataron los pocillos con 0, 0,5 y 1 mg/ml de CTE durante 24 horas a 37 grados y 5 % de CO2. La intensidad de fluorescencia se midió con una longitud de onda de excitación de 510 nm y detección de emisión a 580 nm para MitoSOX y una longitud de onda de excitación de 350 nm y detección de emisión a 461 nm para Hoechst 33342 utilizando un lector de microplacas con fluorescencia superior (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Suiza).

análisis estadístico

Las estadísticas descriptivas se mostraron como la media más /- SD. La importancia de las diferencias entre los grupos se evaluó mediante la prueba t de Student y la prueba de Chi-cuadrado. Cuando se compararon más de dos grupos, usamos ANOVA unilateral con pruebas post hoc apropiadas. Se utilizó el SPSS 11.01 para Mircosoft Windows. Las diferencias con P inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativas.

Cistancheposeecontra el cáncerpropiedades y mejorainmunidad

RESULTADOS

El efecto de CTE en la proliferación de líneas celulares de cáncer de colon humano se muestra en la Figura 1. Todas las concentraciones de CTE analizadas mostraron un fuerte efecto inhibidor en la línea celular CaCo2 en una forma dependiente de la concentración y el tiempo (Figura 1A). Setenta y dos horas de tratamiento con CTE inhibieron el crecimiento de células CaCo2 en más del 60 por ciento en comparación con el control (p < 0.05="" para="" todas="" las="" concentraciones).="" el="" impacto="" significativo="" del="" tratamiento="" con="" cte="" en="" el="" crecimiento="" celular="" hct116="" también="" se="" detectó="" en="" puntos="" históricos="" en="" las="" dos="" concentraciones="" más="" altas="" (1="" mg/ml="" y="" 2="" mg/ml),="" alcanzando="" una="" reducción="" superior="" al="" 70="" por="" ciento="" en="" la="" última.="" concentración="" (figura="" 1b,="" p="">< 0,05).="" aunque="" las="" dos="" concentraciones="" más="" bajas="" de="" cte="" (0,25="" y="" 0,5="" mg/ml)="" redujeron="" significativamente="" el="" crecimiento="" de="" células="" hct116="" después="" de="" 24="" horas=""><0.05), they="" had="" no="" significant="" effect="" following="" 72="" hours="" treatment="" compared="" to="" control="" (p="">{{0}}.{{10}}5). La inhibición de la proliferación dependiente del tiempo y la concentración con CTE se confirmó aún más en células LoVo en más del 60 por ciento a la concentración más alta (p < 0.05)="" (figura="" 1c)="" ,="" y="" las="" cuatro="" concentraciones="" de="" cte="" probadas="" redujeron="" el="" crecimiento="" de="" las="" células="" sw620="" después="" de="" 48="" horas="" (figura="" 1d,="" p="">< 0.05="" para="" todas).="" después="" de="" 72="" horas="" de="" tratamiento,="" se="" observó="" el="" mismo="" efecto="" solo="" para="" las="" dos="" concentraciones="" más="" altas="" (p="">< 0,05),="" mientras="" que="" las="" concentraciones="" de="" 0,25="" y="" 0,5="" mg/ml="" no="" mostraron="" un="" efecto="" significativo="" en="" comparación="" con="" el="" control="" (p=""> 0,05). El impacto del tratamiento con 0,5 y 1 mg/ml de CTE en la inducción de la apoptosis se probó más en las cuatro líneas celulares (Figura 2). Se detectó un mayor número de células en apoptosis temprana en HCT116 y LoVo después de 24 horas de tratamiento con 0,5 mg/mL (p<0.05, figure="" 2b="" and="" 2c)="" and="" in="" all="" cell="" lines="" at="" 1="" mg/ml=""><0.05). a="" significant="" increase="" in="" necrotic="" or="" late="" apoptotic="" cell="" number="" was="" further="" observed="" in="" caco2="" and="" sw620="" cell="" lines=""><0.05, figure="" 2a="" and="" 2d).="" the="" ability="" of="" cte="" to="" induce="" intracellular="" ros="" production="" is="" demonstrated="" in="" figure="" 3.="" three="" hours="" following="" cte="" treatment="" there="" was="" a="" strong="" increase="" in="" intracellular="" ros="" production="" in="" all="" cell="" lines=""><0.05). the="" intracellular="" ros="" production="" increased="" progressively="" throughout="" the="" 25="" hours="" of="" treatment="" in="" a="" time="" and="" concentration-dependent="" manner.="" furthermore,="" staining="" of="" cells="" with="" mitochondria-targeted="" probe="" revealed="" a="" strong="" impact="" of="" cte="" on="" mitochondrial="" superoxide="" production="" in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 4).="" the="" highest="" increase="" in="" superoxide="" production="" by="" mitochondria="" was="" observed="" in="" hct116="" (69%,="" figure="" 4b)="" and="" lovo="" cells="" (82%,="" figure="" 4c)="" following="" 24="" hours="" of="" treatment="" with="" 1="" mg/ml="" of="">

DISCUSIÓN

Aunque estudios anteriores han informado numerosas propiedades medicinales deCistanchetubulosa, este es el primer reporte de su efecto antiproliferativo en células malignas. Los compuestos bioactivos de Cistanchetubulosa extraídos con agua, un solvente altamente polar, mostraron una fuerte bioactividad anticancerígena. Anteriormente hemos comparado la eficiencia deCistanchetubulosa se solubilizó en agua frente a otros solventes como metanol y acetato de etilo, pero los extractos de agua exhibieron las actividades anticancerígenas más prometedoras (datos no mostrados).

Hemos demostrado la capacidad de CTE a 1 mg/mL y 2 mg/mL para inhibir el 60 por ciento del crecimiento de las líneas celulares de cáncer de colon primario y metastásico, lo que revela un papel potencialmente importante de Cistanche tubulosa como tratamiento del cáncer de colon. En comparación con las células normales, las células cancerosas generalmente se caracterizan por una alteración en la homeostasis redox y una estrategia común de las terapias contra el cáncer actuales es aumentar el estrés oxidativo celular (Yang et al, 2013). Aunque los niveles fisiológicamente bajos de ROS tienen un papel importante como moléculas de señalización, la producción excesiva de ROS puede contribuir a la inestabilidad y la malignidad del cáncer (Liou y Storz, 2010). Paradójicamente, este desequilibrio en la homeostasis redox celular hace que las células cancerosas sean más vulnerables a la muerte celular inducida por ROS (Jaganjac et al., 2008; Nogueira y Hay, 2013). El efecto antiproliferativo de CTE informado en este estudio puede estar mediado por varios mecanismos extracelulares e intracelulares de compuestos conocidos y desconocidos dentro del extracto, dirigidos a múltiples vías que juegan un papel esencial en la apoptosis. Para diferenciar entre diferentes modos de muerte celular, investigamos el mecanismo potencial responsable de la citotoxicidad inducida por CTE observada.

Nuestros datos indican que CTE aumenta la producción de ROS intracelular y, en consecuencia, la muerte celular inducida por ROS. El estado redox de la célula también juega un papel crucial en la regulación de la apoptosis y la cadena de transporte de electrones mitocondrial es uno de los principales sitios de generación de ROS celular (Trachootham et al., 2008). Además, las ROS intracelulares podrían causar apoptosis celular a través de vías dependientes e independientes de las mitocondrias (Sinha et al., 2013). De hecho, nuestros datos también indican que la externalización de fosfatidilserina inducida por CTE, un efecto común en la apoptosis, tanto en líneas celulares de cáncer primario como metastásico, sugiere que el mecanismo de muerte inducida por CTE está mediado por apoptosis en lugar de necrosis. La activación de la apoptosis en las células cancerosas es una estrategia correctiva y muchos medicamentos contra el cáncer pueden ejercer efectos apoptóticos en las células cancerosas.

Por lo tanto, los compuestos o extractos con actividades proapoptóticas en las células cancerosas son potencialmente útiles en la investigación de fármacos contra el cáncer (Wong, 2011). Para determinar si el efecto proapoptótico inducido por CTE está mediado por el mecanismo ROS inducido por mitocondrias, medimos la producción de superóxido utilizando la sonda fluorescente dirigida a mitocondrias en células tratadas con CTE. Nuestros datos muestran claramente que CTE estimula la producción de superóxido mitocondrial, lo que sugiere que la actividad anticancerígena de Cistanche tubulosa está mediada, al menos en parte, por el mecanismo ROS inducido por mitocondrias.

Cistancheposeecontra el cánceryhígadoproteccionefectos

CONCLUSIONES

En conclusión, nuestros datos sugieren que el extracto acuoso de la planta del desierto Cistanche tubulosa puede representar un candidato prometedor para un enfoque anticancerígeno en combinación con otras terapias convencionales para la prevención y el tratamiento del cáncer de colon. También demostramos que la toxicidad del extracto de la planta contra las células cancerosas está mediada por una mayor producción intracelular de ROS y, al menos en parte, por la apoptosis dependiente de mitocondrias. Se están realizando más estudios para aislar y caracterizar los constituyentes biológicamente activos individuales responsables de la actividad anticancerígena.

Se necesita más investigación para evaluar el uso potencial de este extracto como un agente quimiopreventivo eficaz y para comprender los mecanismos de acción sobre las células de cáncer de colon a nivel molecular. También se necesitan más estudios preclínicos y clínicos para confirmar los efectos beneficiosos para la salud observados de Cistanche tubulosa para la prevención del cáncer.

AGRADECIMIENTOS

Apoyo financiero y patrocinio

Este estudio fue apoyado por el Laboratorio Antidopaje de Qatar.

Conflicto de intereses:

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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