Aceites esenciales que contienen citral como posibles inhibidores de la tirosinasa: un enfoque de fraccionamiento bioguiado

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Resumen:

La producción excesiva de melanina provoca graves afecciones dermatológicas, así como problemas estéticos menores (es decir, pecas y lentigo solar). La regulación a la baja de la tirosinasa es un enfoque generalizado para el tratamiento de tales trastornos, y los extractos de plantas a menudo han demostrado ser fuentes valiosas detirosinasainhibidores Citral (una mezcla de neral y geranial) es un importante ingrediente de fragancia que ha mostrado potencial anti-tirosinasa. Está altamente concentrado en los aceites esenciales (AE) de Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. y Verbenaofficinalis L. Sin embargo, solo se ha investigado el AE de L. cubeba para uso como agente potencial para blanquear la piel. Este trabajo evalúa in vitrotirosinasaactividad inhibitoria de estos EO y estudios, utilizando fraccionamiento orientado a bioensayo, si sus diferentes composiciones químicas influyen en las actividades inhibidoras generales de EO a través de posibles interacciones sinérgicas, aditivas y / o competitivas entre los componentes de EO. La actividad inhibitoria del AE de C. schoenanthus y la de los AE de M. officinalis, con cantidades insignificantes (más) de citronelal, estaban en línea con su contenido de citral. Por otro lado, los AE de L. cubeba y V. officinalis inhibierontirosinasaen grados considerablemente mayores ya que contenían -mirceno, que contribuyó a las actividades generales de EO. Se hicieron observaciones similares para M. officinalis EO, que tiene un alto contenido de citronelal (más) que aumentó la actividad citral.

Palabras clave:tirosinasainhibición; aceites esenciales; citral

la cistanche tiene una función blanqueadora

Introducción

tirosinasaes la enzima clave en la biosíntesis de pigmentos de melanina en varias bacterias, hongos, plantas, animales y humanos. En humanos, la tirosinasa cataliza los pasos limitantes de la velocidad en la vía biosintética de la melanina. Esta biosíntesis se caracteriza por varias reacciones enzimáticas y químicas que conducen a la formación de melanina a partir del aminoácido L-tirosina, con la tirosinasa catalizando su hidroxilación a o-dopaquinona a través de sus actividades de micofenolato y difenoles. Aunque hay otras enzimas involucradas en la melanogénesis, solo las reacciones catalizadas por tirosinasa no pueden ocurrir espontáneamente, mientras que los pasos restantes pueden ocurrir sin actividad enzimática a pH fisiológico [1]. Por esta razón, la regulación a la baja de tirosinasa es un enfoque muy extendido para la reducción del exceso de melanina. producción, y el uso de inhibidores de la tirosinasa como agentes blanqueadores de la piel ha demostrado una prominencia clínica y cosmética significativa [2].

En el mercado de la UE, latirosinasaLos inhibidores que se emplean como agentes para blanquear la piel se pueden agrupar en dos categorías principales: los que están prohibidos por el reglamento de cosméticos de la UE 1223/2009 (es decir, la hidroquinona y el monobencil éter hidroquinona) debido a sus graves efectos secundarios, pero que todavía se usan para tratar la hiperpigmentación bajo condiciones médicas. supervisión; e inhibidores de la tirosinasa cuyo uso está permitido en productos cosméticos (es decir, arbutina, aloesina, ácido kójico) [2,3]. Este segundo grupo, sin embargo, todavía se caracteriza por efectos secundarios potencialmente significativos; los estudios clínicos sobre el ácido kójico han puesto de manifiesto casos de eritema, sensación de escozor y eczema de contacto después de la aplicación. Del mismo modo, el Comité Científico Europeo sobre Seguridad del Consumidor ha expresado su preocupación por el uso de arbutinas como ingrediente cosmético [2], debido a la posible hidrólisis de su enlace glucosídico que libera hidroquinona. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos moldes de moléculas y/o mezclas de compuestos bioactivos para tratar la hiperpigmentación.

Las plantas han sido fuentes valiosas de agentes blanqueadores de la piel, y tres de cada cinco de los agentes más empleados, tanto médica como cosméticamente, son metabolitos especializados de plantas (es decir, hidroquinona, -arbutina, aloesina). Hasta la fecha, los compuestos fenólicos se han investigado principalmente como posiblestirosinasainhibidores, y estos incluyen flavonoides (p. ej., quercetina [4]), estilbenos (p. ej., resveratrol [1]), fenilpropanoides (p. ej., cinamaldehído [5] y eugenol [6]) y ácidos fenólicos (p. ej., ácido anísico y ácido benzoico [7]). El interés por los terpenoides ha sido considerablemente menor y han sido relativamente poco investigados como agentes anti-tirosinasa.

Citral se encuentra entre el número limitado de derivados terpenoides con propiedades anti-tirosinasa que se han estudiado. Es una mezcla de dos isómeros, cis y trans-3,7-dimetil-2,6-octadienal (es decir, neral y geranial), que se ha demostrado que bloquea la actividad enzimática in vitro del hongotirosinasa[8]. Además de su importancia como ingrediente oloroso en bebidas, alimentos y cosméticos, el citral ha mostrado actividades biológicas in vitro prometedoras, incluidos efectos antifúngicos, antibacterianos, antioxidantes y antiinflamatorios [9–11]. Además, estudios recientes han destacó que el citral tiene un significado terapéutico potencial como relajante del músculo liso y anestésico local, ya que promueve la relajación en los músculos lisos traqueales, uterinos y aórticos e inhibe la excitabilidad nerviosa en modelos animales [12-15].

El citral se obtiene de los aceites esenciales (AE) de varias especies botánicas, entre ellas Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. y Verbena officinalis L. Al mejor de los autores. conocimiento, solo L. cubeba EO ha sido investigada por sutirosinasaactividad inhibitoria [16]. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo evaluar las actividades inhibidoras de la tirosinasa de los AE de C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis y V.officinalis, utilizando un ensayo colorimétrico in vitro, para evaluar si las diferentes composiciones químicas influyen en las actividades inhibidoras generales de EO a través de cualquier posibles interacciones sinérgicas, aditivas y/o competitivas entre sus componentes. Este estudio utiliza un enfoque de fraccionamiento guiado por bioensayo para evaluar exhaustivamente los constituyentes de los EO y sus enantiómeros, cuando son quirales, que contribuyen a la actividad inhibidora de los EO contra una fuente de tirosinasa de hongo, que es un buen sistema modelo para la detección preliminar detirosinasainhibidores [17].

2. Resultados y Discusión

2.1. Composición Química y Contenido de Citral del Aceite Esencial Investigado

En nuestro intento de caracterizar exhaustivamente todos los componentes potenciales de EO que contribuyen a la actividad biológica considerada, los EO investigados fueron analizados por GC, con detección tanto por FID como por MS. Las abundancias porcentuales relativas normalizadas (calculadas a partir de las áreas absolutas normalizadas al estándar interno C13 mediante el uso de factores de respuesta [18,19]) de todos los compuestos detectados se determinaron y utilizaron para comparar las composiciones de EO. La Figura 1 informa el perfil de GC-MS de los OE investigados analizados con una columna convencional. La Tabla 1 enumera, para cada EO investigado, los compuestos que mostraron un porcentaje de abundancia normalizado por encima de 0.1, mientras que las composiciones químicas completas de EO se informan en los Materiales complementarios (Tablas S1–S5).

Todos los EO investigados son ricos en neral (cis{{0}},7-dimetil-2,6-octadienal) y geranial (trans-3,{ {5}}dimetil-2,6-octadienal), que son los compuestos más abundantes. La relación térmica/geranial fue muy similar en todos los OE investigados y correspondió a 0.74 ± 0.05. Los AE de C. schoenanthus y L. cubeba muestran el contenido neral y geranial más alto, lo que representa, en promedio, el 60 por ciento de la composición total de AE, y que es 1,5-veces mayor que en el AE de V. officinalis y en los tres AE de M. officinalis (es decir, Muestra 1, 2 y 3). Los compuestos oxigenados adicionales que son comunes a todos los aceites esenciales son la6-metil-5-hepten-1-ona, el linalool y el citronelal. Este último es significativamente más abundante en M. officinalis EO 1 que en los otros EO investigados, incluidos M. officinalis EO2 y 3.

La abundancia de la fracción hidrocarbonada varía significativamente en las diferentes EOs.M. officinalis EO 1 contiene solo trans- -cariofileno y -humuleno como hidrocarburos sesquiterpénicos, que representan el 2,7 por ciento y el 0,13 por ciento del total de EO, respectivamente. El EO de C. schoenanthus presenta una fracción de hidrocarburos ligeramente más rica que el EO 1 de M. officinalis (es decir, 7.0 por ciento), que contiene ambos monoterpenos (es decir, canfeno, cis{{1{{20 }}}}ocimeno, limoneno, -pineno, trans- -ocimeno, -thujene) y sesquiterpenos (es decir, trans- -cariofileno, -cadineno, δ-cadineno, germacreno D, -elemeno) en cantidades moderadas montos En los AE de L. cubeba y V. officinalis, la fracción de hidrocarburos representa el 20 por ciento del AE total y el limoneno es el compuesto más abundante (es decir, 15,0 y 10,9 por ciento, respectivamente), seguido por -pineno, pineno , sabineno, trans- -cariofileno, -mirceno, canfeno y -copaeno. Finalmente, M.officinalis EO 2 y 3 se caracterizan por el mayor contenido de fracción hidrocarbonada (38,8 por ciento y 31,8 por ciento del total de EO, respectivamente). En ambas muestras, la fracción de hidrocarburos contiene principalmente sesquiterpenos, a saber, trans- -cariofileno (27,8 por ciento y 20,0 por ciento, respectivamente) y -humuleno (3,0 por ciento y 2,6 por ciento), y una fracción reducida de monoterpenos que se caracteriza principalmente por limoneno ( 4,2 por ciento y 3,2 por ciento, respectivamente).

Se investigaron tres muestras de L. cubeba, V. officinalis y C. schoenanthus Eos producidas en diferentes años, así como tres muestras de M. officinalis AE de distintos fabricantes. Los análisis GC-MS de C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis y V. officinalis no revelaron diferencias cualitativas y cuantitativas significativas en la composición química de las tres muestras de diferentes años de producción. Esto puede atribuirse a las condiciones óptimas de almacenamiento, es decir, en un recipiente de vidrio ámbar a 4 ◦C en la oscuridad con un espacio de cabeza insignificante. Por otro lado, los análisis de GC-MS mostraron diferencias significativas en las abundancias de citronelal y trans{{4 }}cariofileno en los tres aceites esenciales de M. officinalis investigados. La citronela ascendió a 19.6 por ciento, 0.26 por ciento y 0.31 por ciento en M. officinalis EO 1, 2 y 3, respectivamente. Por el contrario, como se describió anteriormente, el trans- -cariofileno es considerablemente más abundante en los EO 2 y 3 de M. officinalis que en el EO 1 de M. officinalis. Estos resultados están de acuerdo con los hallazgos informados por Seidler-Lozykawska et al. quienes destacaron diferencias significativas en las abundancias de citral, citronelal y trans- -cariofileno en los aceites esenciales obtenidos de 22 genotipos seleccionados de M. officinalis originarios de jardines botánicos europeos [20].

Se realizó una cuantificación real mediante la calibración estándar externa para evaluar con precisión la abundancia de posibles compuestos bioactivos especializados (es decir, neral, geranial, limoneno, -mirceno y citronelal. Las tablas 2 y 3 informan los iones de diagnóstico (m/z) utilizados para SIM- Cuantificación de MS de los compuestos marcadores bajo investigación junto con el rango de calibración, la ecuación de la curva de calibración, los valores de correlación y el error estándar de regresión de cada analito y los resultados de la cuantificación, respectivamente.

2.2. Actividad inhibidora in vitro de los aceites esenciales investigados contra la tirosinasa de hongos

Como se describió anteriormente, los AE de C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba y V. officinalis presentan altos niveles de citral, que se caracteriza por una actividad inhibitoria no competitiva frente a una fuente fúngica de tirosinasa [8,16,21]. . Este estudio tuvo como objetivo examinar la in vitrotirosinasaactividades inhibidoras de estos AE para explorar si su actividad inhibidora puede atribuirse únicamente a su contenido de citral, o si hay otros compuestos bioactivos que influyen en los efectos inhibidores de los AE.

Hongotirosinasase adoptó aquí debido a su alta homología con la humantirosinasa, su costo relativamente bajo y su fácil disponibilidad, lo que lo convierte en un buen sistema modelo para la detección preliminar de inhibidores de la tirosinasa [17]. La precisión del in vitrotirosinasaLa prueba de inhibición se evaluó en términos de repetibilidad (realizando el ensayo de inhibición enzimática cinco veces en el mismo día) y precisión intermedia (repitiendo el ensayo de inhibición enzimática cinco veces cada cuatro semanas durante un período de seis meses). En la tabla 4 se reporta el coeficiente de variación (CV) para las pruebas de inhibición realizadas con ácido kójico, que se utilizó como control positivo, y con AE de L. cubeba. Los resultados fueron satisfactorios ya que el CV nunca excedió el 7 por ciento para repetibilidad y el 10 por ciento para precisión intermedia. La Tabla 4 reporta el coeficiente de variación para las pruebas de inhibición realizadas con ácido kójico, usado como control positivo, y con AE de L. cubeba. Se obtuvieron valores de precisión similares para todos los OE probados.

La curva de concentración-respuesta de citral se estudió representando la actividad inhibitoria observada en función de su concentración en la mezcla de reacción. Todos los AE se probaron a una concentración de 166,7 µg/ml, lo que proporcionó, independientemente del AE, una concentración de citral resultante dentro de su rango de linealidad de la curva de concentración-respuesta (y=0,3956x más 1,8094,R{{7} }.9951, error de regresión: 2.08448, rango de linealidad: 6.7–166.7 µg/mL) y no generó problemas de solubilidad en la mezcla de reacción.

El diagrama de caja informado en la Figura 2 presenta el porcentaje detirosinasainhibición para cada OE. Para los EO de L. cubeba, V. officinalis y C. schoenanthus, los resultados informados en la Figura 2 corresponden a la actividad inhibidora de la tirosinasa de hongos de los EO de 2020 debido a que el análisis de varianza no reveló diferencias estadísticamente significativas entre los EO de diferentes años de producción (p > 0,05). Con respecto a los aceites esenciales de L. cubeba y C. schoenanthus, estos resultados concuerdan con los resultados obtenidos de los análisis cuantitativos de GCMS que revelaron una cantidad de citral casi idéntica en los aceites esenciales de diferentes años de producción. El lote 2020 de AE ​​de V. officinalis contiene una cantidad de citral ligeramente superior a los lotes 2019 y 2018. Sin embargo, según la curva de concentración-respuesta de citral, el exceso de citral en el lote 2020 no es suficiente para determinar un porcentaje mayor estadísticamente significativo de inhibición enzimática considerando el azar. error asociado con las mediciones. Para obtener detalles adicionales, consulte la Figura S1 en el Material complementario. Por otro lado, el análisis de varianza (ANOVA) seguido de Tukey-Kramer post-hoctest reveló que los tres AE de M. officinalis probados, proporcionados por distintos fabricantes, inhibían hongostirosinasaen diferentes grados, que se describirán con más detalle en los siguientes párrafos. Las mayores actividades inhibitorias se observaron para los AE de L.cubeba, M. officinalis 1 y V. officinalis, que inhibieron el 59 ± 6 por ciento, el 55 ± 7 por ciento y el 52 ± 6 por ciento detirosinasaactividad, respectivamente, cuando se probó a una concentración de 166.7 µg/mL. Se observaron actividades más bajas estadísticamente significativas (p < 0.05)="" para="" los="" ae="" de="" c.="" schoenanthus="" y="" m.="" officinalis="" 2="" y="" 3="" cuya="" actividad="" inhibidora="" de="" la="" enzima="" fue="" 42="" ±="" 5="" por="" ciento,="" 40="" ±="" 5="" por="" ciento="" y="" 38="" ±="" 6="" por="" ciento.="" por="" ciento,="" respectivamente.="" la="" tabla="" 5="" proporciona="" la="" concentración="" de="" inhibidor="" que="" redujo="" a="" la="" mitad="" la="" actividad="" enzimática="" en="" las="" condiciones="" experimentales="" dadas="" (ic50)="" para="" cada="" inhibidor="" investigado="" (es="" decir,="" eo,="" compuestos="" únicos="" y="" ácido="" kójico).="" todos="" los="" aceites="" esenciales="" inhibieron="" eficazmente="" la="" tirosinasa="" de="" hongo="" y="" mostraron="" una="" actividad="" inhibidora="" que="" fue,="" en="" promedio,="" 100-veces="" más="" baja="" que="" la="" del="" ácido="" kojica,="" que="" se="" usó="" como="" control="">

2.3. Identificación de componentes bioactivos adicionales, además de citral, mediante fraccionamiento guiado por bioensayo solo compuestos activos en los aceites esenciales investigados. Estos valores se midieron por interpolación de la curva de concentración-respuesta de citral. Como se puede observar, C. schoenanthus, M. officinalis 2 y M. officinalis 3 mostraron actividades inhibitorias que estaban en línea con su contenido de citral, mientras que L. cubeba, M. officinalis 1 y V. officinalis inhibieron los AE de hongos. tirosinasa en mayor medida de lo esperado. Se adoptó un enfoque bioguiado para identificar los compuestos adicionales que contribuyen a la actividad citral. Las fracciones oxigenadas y de hidrocarburos de los aceites esenciales de L. cubeba, M. officinalis 1 y V. officinalis se aislaron mediante cromatografía ultrarrápida y se analizaron individualmente para determinar su hongo.tirosinasaactividades inhibidoras. Las fracciones fitohemical probaron sus actividades inhibidoras de la tirosinasa de hongo. Las fracciones fitohémicas se probaron a la misma concentración que su concentración resultante al probar 166,7 µg/mL del OE respectivo (consulte la sección Materiales y métodos en la Sección 3.2). La Tabla 6 informa la concentración de neral, geranial, citronelal, limoneno, y -mirceno en las fracciones oxigenada e hidrocarbonada de los OE fraccionados.

En cuanto a los AE de L. cubeba y V. officinalis, tanto la fracción oxigenada como la hidrocarbonada inhibieron la tirosinasa del hongo, aunque en distinta medida. Las actividades de las fracciones oxigenadas (53 ± 3 por ciento y 44 ± 5, respectivamente) representan la mayor parte del EO anti-tirosinasapotencial y estaban en línea con el respectivo contenido de citral, lo que sugiere que los compuestos que contribuyen a la actividad citral pertenecen a las fracciones de hidrocarburos. Las fracciones de hidrocarburos de los AE de L. cubeba y V. officinalis presentan composiciones químicas bastante similares. limoneno (68,4 y 50,3 por ciento, respectivamente), trans- -cariofileno (12,0 y 7,8 por ciento, respectivamente), -pineno (1,7 y 7,5 por ciento, respectivamente), -pineno (2,5 y 12,9 por ciento, respectivamente), sabineno (2,7 y 3,8, respectivamente) y -mirceno (2,0 y 2,4 por ciento, respectivamente) son los compuestos más abundantes en ambas fracciones y están presentes en cantidades bastante similares, excepto por -pineno y -pineno, que predominan en la fracción hidrocarbonada del EO de V. officinalis.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 por ciento en ambos AE), limoneno (97 y 94 por ciento en AE de L. cubeba y V. officinalis, respectivamente) y sabineno (87 por ciento en ambos AE), mientras que se observaron diferentes excesos enantioméricos para -pineno ((-)- enantiómero: 38 por ciento en L. cubeba EO y 73 por ciento en V. officinalis EO) y -pineno ((-)-enantiómero: 67 por ciento en L. cubeba EO y 88 por ciento en V. officinalis EO). En ambos EO, el (-)-limoneno representa más del 50 por ciento de la fracción total. Sin embargo, aunque estudios previos informaron una actividad inhibidora contra la tirosinasa de hongos debido a su alta abundancia [22,23], el (-)-limoneno aquí no mostró una actividad inhibidora de la tirosinasa. Se obtuvieron resultados similares para ( plus )-limoneno, la mezcla racémica y los compuestos (-)-trans- -cariofileno, (±)- -pineno y (±)- -pineno . Sabinene no se probó porque ya se había demostrado que tenía un hongo insignificante.tirosinasaefectos inhibitorios [8]. De acuerdo con hallazgos previos [8], el mirceno redujo la actividad de la tirosinasa de hongos. Cuando se probó a la concentración observada en 166,7 µg/mL de L. cubeba y V. officinalis EO, la actividad de -mirceno cerró la brecha entre los efectos inhibitorios esperados de los EO si el citral era el único compuesto activo y los resultados experimentales. Contrariamente a las observaciones de Matsuura et al. [8], -myrcene demostró ser un inhibidor de la tirosinasa de hongo más potente que el citral, ya que su IC50 fue casi diez veces menor (13,3 µg/ml frente a 121,8 µg/ml). Esta diferencia puede atribuirse a los diferentes sustratos utilizados; Matsuura et al. investigaron únicamente la actividad de la difenolasa de tirosinasa de hongo, ya que utilizaron L-DOPA como sustrato, mientras que, en este estudio, se utilizó L-tirosina. Los hallazgos actuales sugieren que el -mirceno puede ser más efectivo para inhibir la actividad de la monofenolasa de tirosinasa de hongos que la difenolasa.

El M. officinalis EO 1 muestra una pequeña fracción de hidrocarburo que representa menos del 3 por ciento del total y no tiene actividad inhibidora de la tirosinasa. Sin embargo, la fracción oxigenada de M. officinalisEO 1 inhibía la tirosinasa de hongo en mayor medida de lo que cabría esperar a partir de su contenido de citral (Figura 3). Esta fracción contiene cantidades significativas de citronelal además de neral y geranial y el análisis quiral reveló una alta pureza enantiomérica de citronelal a favor del enantiómero (más) (98,3 por ciento). Cuando se probó de forma independiente, a una concentración de 166,7 µg/mL, ( plus )-citronelal inhibió la tirosinasa de hongo en un grado insignificante, aunque su actividad mejoró significativamente cuando se probó en combinación con citral. Estos resultados pueden explicar las diferencias observadas en los porcentajes de hongostirosinasainhibición en los diversos AE de M. officinalis. M.officinalis EO 2 y 3 presentan contenidos de citronela muy bajos, por lo que su actividad inhibitoria es significativamente menor que la de M. officinalis EO 1.

3. Materiales y Métodos

3.1. reactivos

Dimetilsulfóxido (DMSO), tirosinasa de hongos de Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-tirosina, ácido kójico, citral, citronelal, -mirceno, ( más )-limoneno, (-)-limoneno,(±)-limoneno, ( ±)- y pineno se adquirieron de Merck Life Science Srl (Milán, Italia). Los aceites esenciales Litsea cubeba, Verbena officinalis y Cymbopogon schoenanthus fueron suministrados por Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Italia). Se probaron tres lotes de diferentes años (es decir, 2020, 2019, 2018) para cada uno. Se investigaron tres muestras de AE ​​de Melissa officinalis; una fue proporcionada por Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), una por Erboristeria Magentina Srl, mientras que la última se compró en una tienda local y era de Specchiasol S.rl (Bussolengo, Italia). En el texto, los autores se refieren a los diferentes AE de Melissa officinalis como AE de M. officinalis 1, 2 y 3, respectivamente. Los AE proporcionados se obtuvieron siguiendo los procedimientos descritos en la Farmacopea Europea [24]. Los AE de Melissa officinalis y Verbena officinalis fueron producidos por hidrodestilación de las hojas y partes aéreas de las plantas, respectivamente; de manera similar, los AE de Litsea cubeba y Cymbopogon schoenanthus se obtuvieron por destilación al vapor de los frutos frescos y partes aéreas frescas, respectivamente. Cada EO fue analizado individualmente por GC-MS tan pronto como fue comprado/suministrado por el fabricante correspondiente, cada año de almacenamiento, y justo antes del estudio de su actividad inhibidora de la tirosinasa de hongo.

3.2. Ensayo inhibidor de tirosinasa in vitro

lostirosinasaLas actividades inhibidoras de los aceites esenciales y los compuestos aislados se investigaron in vitro utilizando un ensayo enzimático basado en lectura colorimétrica optimizado por Zengh et al. [25], con ligeras modificaciones. Las actividades inhibidoras de la tirosinasa de los aceites esenciales, así como sus respectivas fracciones hidrocarbonadas y oxigenadas y los compuestos puros, se investigaron in vitro utilizando un ensayo enzimático basado en lectura colorimétrica que fue optimizado por Zengh et al. [25], con ligeras modificaciones: el ensayo se realizó a temperatura ambiente ytirosinasala inhibición se midió considerando el control y la absorbancia de la muestra después de 6 min de incubación, en lugar de después de 20 min, para operar bajo la porción lineal de la reacción enzimática, lo que proporciona resultados de inhibición más precisos [26,27]. Para este estudio se seleccionó tirosinasa de hongo de Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach. Se usó L-tirosina como sustrato, lo que significa que se investigó la actividad inhibidora de la tirosinasa general sin distinguir entre la actividad de monofenolasa de tirosinasa y difenolasa. Se realizaron mediciones fotométricas a 475 nm en un Thermo spectronic Genesys6 y se usó ácido kójico como inhibidor de control positivo. Las soluciones de los inhibidores potenciales investigados (EO, fracciones aisladas de EO, compuestos individuales de EO y ácido kojica) se prepararon en DMSO. La Tabla 7 informa las concentraciones probadas para cada inhibidor potencial investigado. El hongotirosinasaSe preparó una solución de 200 U/mL (27,9 µg/mL) en tampón de fosfato de sodio (pH 6,8) y se almacenaron alícuotas de 9 mL a -18 ◦C y se descongelaron justo antes de los experimentos. Se preparó solución de tirosina 0,1 mg/mL en tampón de fosfato de sodio (pH 6,8) y se renovó diariamente. Los componentes de la mezcla de reacción se colocaron en el vial en el siguiente orden: 1 mL de solución de tirosinasa de hongo 200 U/mL; 1 mL de solución tampón de fosfato de sodio; 10 µL de EO/compuesto único/solución de ácido kójico; y, por último, 1 mL de solución de tirosina 0,1 mg/mL. El porcentaje final de DMSO en la mezcla de reacción fue del 0,3 por ciento. El ensayo se realizó en un vial sellado de 4 ml para evitar la pérdida de cualquier componente de EO en el entorno circundante y para minimizar su liberación en el espacio de cabeza por encima de la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se incubó en un baño de agua termostático a 25 ◦C durante 6 min. Posteriormente se registró la absorbancia a 475 nm, ya que esta longitud de onda permite la identificación del dopacromo. La absorbancia correspondiente al 100 por ciento de la actividad de tirosinasa se midió reemplazando la solución de EO/compuesto individual/ácido kójico con 10 µL de DMSO puro. /solución de ácido kójico/DMSO, y 1 mL de solución de tirosina 0,1 mg/mL. El porcentaje de inhibición de la tirosinasa se midió de acuerdo con la siguiente ecuación: porcentaje de inhibición=∆A (Control) − ∆A (Muestra) / ∆A (Control) × 100, ∆A (Control) o (Muestra) {{ 33}} A475 (Control) o (Muestra) − A475 (Blanco de control) o (Blanco de muestra).

3.3. Cromatografía en columna flash

El fraccionamiento de OE se llevó a cabo en un sistema de cromatografía en columna ultrarrápida PuriFlash450 de Sepachrom (Rho, Milán, Italia), equipado con detectores UV y ELSD. La cantidad de EO fraccionado: 900,0 mg. Fase estacionaria: partículas esféricas de gel de sílice, 50 µm, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartucho Estacionario) era de Sepachrom; fase móvil: éter de petróleo (A) y acetato de etilo (B); caudal 25 ml/min. Se adoptó la elución en gradiente lineal desde el 100 por ciento de A hasta el 80 por ciento de A y el 20 por ciento de B durante 20 min.

3.4. Condiciones de análisis

Las soluciones de AE ​​y las de sus respectivas fracciones se prepararon en ciclohexano a una concentración de 5.0 mg/mL y se analizaron por GC-MS. En cada AE se cuantificaron citral, citronelal, -mirceno y limoneno y las fracciones aisladas correspondientes mediante el método de calibración con patrón externo. Se prepararon niveles de calibración adecuados en ciclohexano y se analizaron por GC-MS. Se usó tridecano (C13) 1.0 mg/mL como estándar interno para normalizar las señales del analito. La Tabla 2 resume el rango de concentración considerado para cada compuesto cuantificado.

Los análisis de GC-MS se llevaron a cabo utilizando un muestreador multipropósito Gerstel MPS-2 (Mülheim an der Ruhr, Alemania) instalado en un GC Agilent 6890 N acoplado a un MSD 5975 y equipado con una ChemStation versión E. 02.0Sistema de procesamiento de datos 2.1431 (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Condiciones del GC: temperatura del inyector: 250 ◦C; modo de inyección: división; proporción: 1/20; gas portador: helio; caudal constante: 1 ml/min; columnas: Mega5 (95 por ciento polidimetilsiloxano, 5 por ciento fenilo) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, longitud 25 m, de MEGA (Legnano, Italia). Programa de temperatura: 50 ◦C//3 ◦C/min//180 ◦C//10 ◦C/min//250 ◦C(5 min). Condiciones MSD: MS operado en modo EI (70 eV); rango de escaneo: 35 a 350 amu; tiempo de permanencia 40 ms; temperatura de la fuente de iones: 230 ◦C; temperatura del cuadrupolo: 150 ◦C; temperatura de la línea de transferencia: 280 ◦C. Los marcadores de EO se identificaron comparando sus índices de retención lineal (IT), calculados frente a una mezcla de hidrocarburos C9-C25, y sus espectros de masas con los de muestras auténticas o de bibliotecas de espectros de masas disponibles comercialmente (Adams, 2007). Los análisis quirales de EO se realizaron adoptando las mismas condiciones de análisis en un 2,3-di-O-metil-6-Ot-butildimetilsilil- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, longitud 25 m de MEGA. Programas de temperatura: 40 ◦C(1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

Los análisis GC-FID se llevaron a cabo en el mismo instrumento. Condiciones de GC: temperatura del inyector: 250 ◦C; modo de inyección: dividido; proporción: 1/20; gas portador: hidrógeno; caudal: 1 ml/min. Programas de temperatura: 40 ◦C (1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

4. Conclusiones

Los propósitos de esta investigación fueron (1) examinar exhaustivamente el hongo in vitrotirosinasainhibidoras de los aceites esenciales de Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis y Verbena officinalis y (2) determinar si su actividad biológica se atribuye únicamente a su contenido de citral o si hay monoterpenos bioactivos adicionales que contribuyen a la actividad biológica investigada mediante el uso de un método de fraccionamiento guiado por bioensayo. Este estudio ha identificado que en los AE de L. cubeba y V. officinalis, el -mirceno contribuye a las actividades inhibitorias de los AE a pesar de su poca cantidad y ha demostrado tener mayor poder inhibidor que el citral. El segundo hallazgo importante fue que ( más ) - hongo citral mejorado con citronelaltirosinasapoder inhibidor, potencialmente a través de una interacción sinérgica, ya que no mostró actividad por sí mismo. Este último hallazgo explica por qué en los AE de M. officinalis que tienen cantidades insignificantes (más) de citronelal, las actividades inhibidoras estaban en línea con su contenido de citral, mientras que lo contrario era cierto para el AE de M. officinalis con una abundancia relativamente alta (más) de citronelal. aunque aún se requieren más estudios para definir con precisión el tipo de interacciones que ocurren entre -mirceno y citral y entre citronelal y citral, y para evaluar las actividades inhibitorias de estos EO y compuestos individuales en humanos.tirosinasa, los resultados de este estudio pueden ayudar a diseñar racionalmente mezclas de AE ​​o AE enriquecidos que mejoren su eficacia biológica y aumenten su potencial como coadyuvantes en el tratamiento de la hiperpigmentación.

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