Actividad decolorante de melanina de enzimas antioxidantes, glutatión peroxidasa, tiol peroxidasa y catalasa

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Gyeong-chan Jeon¹· Chinhan Kim²· Reino Unido Min Cho²· Ee Taek Hwang³· Hyung Seo Hwang⁴· Jiho Min¹

Resumen

La melanina es el factor más importante para determinar el color de la piel. Se están realizando muchos esfuerzos de investigación para descomponer los compuestos de melanina ya producidos en la piel para la belleza. Esta investigación investigó los efectos sobre la reducción del color de la melanina de las tres enzimas antioxidantes, glutatión peroxidasa (GPX), tiol peroxidasa (TPX) y catalasa, en la fracción lisosomal. La solución de melanina se trató con enzimas y peróxido de hidrógeno, luego se hizo reaccionar durante 48 h. GPX y TPX decoloraron la melanina, y entre ellos, GPX fue más eficiente, pero Catalase no fue efectivo. GPX también inhibió la producción de melanina en células de melanoma B16F10. GPX, que está presente en casi todos los microorganismos, juega un papel importante en el mecanismo de defensa celular por especies reactivas de oxígeno. Además, no fue citotóxico pero fue significativamente efectivo en la decoloración del color de la melanina. Por tanto, en el campo biológico y microbiológico, su posibilidad de utilización en cosmética blanqueadora de la piel es alta.

Palabras clave Melanina · Glutatión peroxidasa (GPX) · Tiol peroxidasa (TPX) · Catalasa · B16F10 · Lisosoma

Cistanche es un ingrediente para blanquear la piel.

Introducción

Una cara limpia es uno de los elementos esenciales de la belleza para la gente moderna, especialmente los asiáticos están entusiasmados con la piel blanca. El compuesto de melanina es el factor más importante para determinar el color de la piel. Se distingue de la eumelanina, que tiene un color negro o marrón, y de la feomelanina, que da como resultado un tono de rosa a rojo [1]. El compuesto de melanina se sintetiza por oxidación de tirosina en las células de melanocitos, que se encuentran en la capa basal de la epidermis; y el papel principal de este pigmento en la piel es proteger la dermis bloqueando la dañina radiación ultravioleta [2, 3]. Sin embargo, si hay demasiados compuestos de melanina en la piel, ésta se vuelve oscura y sucia, y puede causar hiperpigmentación, como melasma [4].

Ha habido muchos estudios relacionados con los cosméticos para el cuidado de la piel que resuelven estos problemas, pero la mayoría de los cosméticos para blanquear la piel desarrollados actualmente tienen la función de inhibir la síntesis de melanina a través de varios mecanismos, como bloquear la oxidación de la tirosina o los rayos UV que pueden promover síntesis de melanina [5]. Estos productos tardan mucho en ser efectivos y no lo son para síntomas específicos, como la hiperpigmentación [6]. En la actualidad, un método típico de eliminación de melanina que ya se ha realizado es el tratamiento con láser [7]. Si se desarrollan materiales que puedan resolver estos problemas sin tales procedimientos, tendrán una gran utilidad en el campo biológico y cosmético.

En investigaciones anteriores, intentamos encontrar una forma de decolorar los compuestos de melanina ya producidos. Ha habido informes de investigación sobre la correlación de lisosomas y melanina. Es muy probable que los queratinocitos diferenciados degraden particularmente los melanosomas extrínsecos de acuerdo con el tipo de funciones básicas de autofagia que controlan la cantidad de orgánulos celulares, o eliminan los orgánulos defectuosos, como el peroxisoma [8]. La vía autofágica, desde el citoplasma hasta los lisosomas, desempeña un papel importante en la degradación de los melanosomas en los epidermalqueratinocitos humanos [9]. Estos datos proporcionan evidencia de que las enzimas lisosomales específicas contribuyen a la degradación de la melanina. Anteriormente, encontramos la actividad de la enzima de reducción del color de la melanina en la fracción lisosomal, un complejo que contiene hidrolizados para descomponer el material de desecho y los desechos celulares en los peroxisomas y los lisosomas [10, 11]. Este artículo estudió los efectos de las tres enzimas seleccionadas, glutatión peroxidasa, tiol peroxidasa, catalasa, en la fracción lisosomal para reducir el color de la melanina. Estas peroxidasas actúan para defenderse del daño celular causado por especies reactivas de oxígeno (ROS), y están presentes en todos los eucariotas [12].

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) se forman como un subproducto natural del metabolismo normal del oxígeno en las células y pueden aumentar con el estrés ambiental. Las ROS altamente generadas pueden dañar las células. Los efectos nocivos de las ROS en la célula son los siguientes [12, 13]: daño del ADN o ARN, oxidación de ácidos grasos poliinsaturados en lípidos, oxidación de aminoácidos en proteínas y desactivación oxidativa de enzimas específicas por oxidación de cofactores. Las células neutralizan las ROS por un sistema de antioxidación para prevenir dicho daño tisular. En este sistema, el anión superóxido producido por el metabolismo es muy devastador; aunque la superóxido dismutasa (SOD) lo convierte en peróxido de hidrógeno, el peróxido de hidrógeno sigue siendo reactivo. El peróxido de hidrógeno se transforma en H2O por catalasa y se consume en la producción de glutatión disulfuro (GSSG) a partir de glutatión por catálisis de GPX. TPX funciona de manera similar a GPX [13].

Este estudio investigó el efecto decolorante de la melanina de tres enzimas antioxidantes, GPX, TPX y catalasa. Como resultado, GPX y TPX fueron efectivos para reducir el color de la melanina. Entre ellos, GPX no tenía citotoxicidad a la concentración óptima de actividad decolorante de melanina e inhibió efectivamente la síntesis de melanina. Por lo tanto, proporciona evidencia de que GPX juega un papel importante en el mecanismo de decoloración de la fracción lisosomal por melanina, no solo en la actividad antioxidante, y ofrece el potencial de un nuevo agente cosmético blanqueador como una sola enzima.

Materiales y métodos

Ensayo de actividad de peroxidasas y peroxidasa

La concentración de las tres peroxidasas (glutatión peroxidasa, tiol peroxidasa y catalasa) se determinó mediante un kit de ensayo (kit de ensayo de peroxidasa, D2PD-100, QuantiChromTM) adquirido de Bioassay Systems. La glutatión peroxidasa 2 (GPX2, NBP1-78,824, Novus) y la tiolperoxidasa (TPX,NBP1-78,805, Novus) se adquirieron de Novus y Catalase (9001-05-2, Sigma-Aldrich ) se adquirió de Sigma-Aldrich.

Este kit de ensayo utiliza H2O2 y un colorante donador de electrones que forma resorufina durante la peroxidasa. El ensayo se realizó a temperatura ambiente (RT) y la intensidad del color se midió a 570 nm. Las peroxidasas se hicieron reaccionar con el colorante donador de electrones con peróxido de hidrógeno al 0,6 por ciento durante 10 min a temperatura ambiente. Después de la reacción, se añadió el reactivo de parada y se midió la absorbancia de la muestra mediante espectrofotometría de microplaca. La actividad se calculó de la siguiente manera:

Actividad de peroxidasa=RSEMUESTRA −RBLANK × [Resorufina](𝜇M) × Reacción Vol(𝜇L)RRESORUFIN −RH2 O t(min) Muestra Vol(𝜇L)

(U/B). Una unidad (U) de enzima catalizará la formación de 1 μmol de resorufina por minuto en las condiciones del ensayo. Aquí RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN y RH2O son la absorbancia de la muestra, el blanco de muestra, la resorufina y el agua, respectivamente; y n es el factor de dilución de la muestra. La[Resorufina] para este ensayo es 50 μM. El volumen de reacción es de 100 μl y el volumen de muestra en este estudio es de 10 μl.

Decoloración de melanina por glutatión peroxidasa (GPX), tiol peroxidasa (TPX) y catalasa

La solución de melanina contiene {{0}}.1 mM PBS (solución salina tamponada con fosfato, pH: 7,0) y polvo de melanina (Synthetic, Sigma) que se preparó por oxidación de tirosina con peróxido de hidrógeno. Los contenidos de melanina se midieron por absorbancia a 450 nm. Para determinar la concentración de melanina, se preparó una curva estándar a partir de un estándar auténtico de melanina sintética (R2=0.999, datos no mostrados).

Para verificar la decoloración de la melanina, 100 ppm de solución de melanina que contenía (50 a 1000) μU/L de peroxidasas (GPX, TPX, catalasa) con peróxido de hidrógeno 1 mM se hizo reaccionar a temperatura ambiente y se midió todos los días. El valor de decoloración de melanina se determinó restando la concentración de melanina después de la reacción, del valor inicial.

Cistanche inhibe la síntesis de melanina.

Cultivo de células

Las células de melanoma de ratón B16F10 (KCLB 80008) se adquirieron del Korean Cell Line Bank (KCLB, Seúl, Corea). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía 4500 mg/l de glucosa, l-glutamina 4 mM, piruvato de sodio 1 mM, al que se añadió suero fetal bovino (FBS) al 10 %, HEPES 20 mM, penicilina al 1 %. y las células se incubaron en condiciones de humedad que contenían 5 por ciento de CO2 a 37 grados. El medio se cambió cada 2 días (d) y las células se recolectaron utilizando una solución de tripsina/EDTA.

Ensayo de viabilidad celular (ensayo MTT)

El efecto tóxico de la glutatión peroxidasa en la célula de melanoma B16F10 se confirmó mediante el ensayo MTT, un método general utilizado para determinar el efecto de una muestra sobre la viabilidad de la célula adherente. Este ensayo utiliza bromuro de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) que puede reducirse a formazán mediante la acción mitocondrial. enzima en células viables. Las 3 × 103 células se sembraron por pocillo en una 96-placa de pocillos y se incubaron durante 24 h. Luego se agregó una muestra a cada pocillo y se incubó durante 72 h. Después de eso, el medio se cambió a uno que contenía 0,5 mg/mL de MTT y se incubó durante 2 h. A continuación, se eliminó el reactivo colorante MTT y el formazán generado se disolvió con DMSO durante 30 min. Finalmente, las concentraciones de formazán se midieron a 570 nm usando espectrofotometría de microplaca. La viabilidad celular se calculó de la siguiente manera: viabilidad celular (porcentaje)=(Amuestra - Ablanco)/(Acontrol - Ablanco)*100.

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Ensayo de contenido de melanina

Las 3 × 105 células B16F10 se sembraron por pocillo en una placa de 6-pocillos y se incubaron durante 24 h para que se adhirieran. El medio de cada pozo se intercambió con uno que contenía varias concentraciones de enzima y 10 nM -MSH, luego se incubó durante 72 h. Después de eso, todos los pocillos se lavaron con tampón DPBS y se recolectaron usando una solución de tripsina/EDTA al 0,5 por ciento. Los sedimentos de células obtenidos mediante centrifugación se lisaron con 200 μl de NaOH 1 N que contenía DMSO al 10 por ciento durante 1 hora a 80 grados. Finalmente, el contenido de melanina lisada se midió mediante la absorbancia a 450 nm. La eficiencia de inhibición de la producción de melanina de la enzima se determinó por comparación con el control positivo utilizando 100 mg/mL de arbutina.

Resultados

Actividad de peroxidasa de glutatión peroxidasa (GPX), tiol peroxidasa (TPX) y catalasa

Este estudio es una investigación de extensión de la aplicación del tratamiento de fracción lisosomal para decolorar compuestos de melanina in vitro e in vivo. En estudios previos, encontramos que la fracción lisosomal aislada de células Hela, S. cerevisiae, huevo de gallina tiene el efecto de reducir el color de la melanina y ella eficiencia de la decoloración de la melanina se asoció con la actividad de la peroxidasa de la fracción lisosomal no unida a la membrana microsomal, incluidos los lisosomas y los peroxisomas. Para confirmar el efecto de reducción del color de la melanina de las peroxidasas, se seleccionaron tres peroxidasas, glutatión peroxidasa (GPX), tiol peroxidasa (TPX) y catalasa. Estas enzimas juegan un papel importante en la reducción del estrés oxidativo causado por especies reactivas de oxígeno en las células [14].

La actividad de estas enzimas se determinó mediante un kit de ensayo (kit de ensayo de peroxidasa, D2PD-100, QuantiChrom™). Este método se basó en la oxidación del colorante donador de electrones que forma un color rosa durante la reacción de la peroxidasa [15]. La actividad de la peroxidasa se expresó usando las siguientes unidades: 1 Unidad=1 U=la formación de 1 µmol de resorufina por min bajo las condiciones del ensayo. La Tabla 1 resume la actividad y concentración de las tres peroxidasas, GPX, TPX y Catalasa.

Actividad de decoloración de melanina de glutatión peroxidasa (GPX), tiol peroxidasa (TPX) y catalasa

Para confirmar el efecto de decoloración de melanina de las peroxidasas, se trató una solución de melanina de 100 ppm con peróxido de hidrógeno 1 mM y una concentración de (50 a 1000) µU/L de cada peroxidasa. Las muestras se hicieron reaccionar durante 2 días a temperatura ambiente y luego se compararon con la concentración inicial. La Figura 1 muestra la disminución de melanina después de 48 h. La Figura 1 muestra la evidencia de que TPX y GPX tienen actividad de decoloración de melanina. La catalasa no tuvo efecto en la reducción del color de la melanina (Fig. 1a). El TPX fue eficaz en la decoloración de los compuestos de melanina, y la eficacia fue mayor cuando se trató a una concentración de 1 µU/mL (Fig. 1b). La GPX también tuvo una actividad de reducción del color de la melanina, que fue mejor a una concentración de 0,2 µU/mL y disminuyó gradualmente a concentraciones más altas (Fig. 1c). Este valor representa una mejora del 175 por ciento en la reducción del color de la melanina, en comparación con el control tratado solo con peróxido de hidrógeno. El GPX fue más eficiente en términos de concentración y actividad peroxidasa, en comparación con el TPX. El tratamiento de 0.2 µU/mL GPX y peróxido de hidrógeno 1 mM parasolución de melanina decolorada 13 por ciento de 100 ppm de melanina durante 4 días (Fig.2). Sin embargo, ni GPX ni TPX mostraron ningún efecto de reducción de color en ausencia de peróxido de hidrógeno (datos no mostrados).

Tabla 1 Datos específicos de las enzimas, Glutatión Peroxidasa 2, Tiol Peroxidasa y Catalasa

Efecto de la glutatión peroxidasa (GPX) y H2O2 en la viabilidad celular B16F10

El efecto de GPX sobre la viabilidad de las células de melanoma B16F10 se confirmó mediante el ensayo MTT, antes de la prueba de inhibición de la síntesis de melanina. Para encontrar la concentración adecuada de peróxido de hidrógeno a tratar, se evaluó la citotoxicidad mediante tratamiento con peróxido de hidrógeno durante 72 h a diferentes concentraciones. Bajo la concentración de 0.1 mM, el H2O2 no tuvo toxicidad celular para las células durante 72 h, mientras que a una concentración superior a 1 mM, se observó una gran toxicidad. (Figura 3a). A continuación, se evaluó el efecto de GPX sobre la supervivencia celular en presencia de peróxido de hidrógeno 0, 1 mM, que no era citotóxico. La GPX no tuvo citotoxicidad para las células B16F10 por debajo de la concentración de 0,5 μU/mL, que fue eficaz en los estudios de decoloración de la melanina (Fig. 3b).

Figura 1La reducción relativa del color de la melanina en comparación con el tratamiento solo con peróxido de hidrógeno.

Efecto de la glutatión peroxidasa (GPX) y H2O2 sobre la síntesis de melanina en células de melanoma B16F10

Investigamos el efecto de GPX, que fue más efectivo en la decoloración de melanina, en la síntesis de melanina en melanocitos. La figura 4 muestra el contenido de melanina en células de melanoma B16F10tratadas con cada muestra durante 72 h. El tratamiento con 0.05 μU/mL de GPX y H2O2 0.1 mM indujo la mayor inhibición de la melanogénesis en un 43 por ciento en comparación con el control (solo tratamiento con -MSH). Esto fue un 153 % más alto que el control positivo (tratamiento con arbutina y -MSH), y un 22 % más alto que el de peróxido de hidrógeno sin enzima, mientras que el tratamiento con GPX no mostró una reducción drástica de la melanina en ausencia de peróxido de hidrógeno, lo que también respalda esta opinión. (datos no mostrados). Como resultado, la GPX inhibió la producción de compuestos de melanina, pero la síntesis de melanina en las células se vio más afectada por el peróxido de hidrógeno que por la GPX.

Discusión

En este estudio, nuestros investigadores encontraron la concentración óptima y el efecto de GPX, TPX y catalasa, enzimas antioxidantes que reducen el estrés oxidativo en las células, sobre la decoloración de los compuestos de melanina. Como resultado de experimentos extracelulares utilizando compuestos de melanina sintetizados, GPX y TPX tienen un efecto decolorante de melanina, pero Catalase no. Hay informes de que las enzimas que degradan la lignina en algunos hongos, como una lacasa, la lignina peroxidasa, pueden descomponer la melanina en presencia de peróxido de hidrógeno [16–18]. A través de este estudio, se confirmó que las enzimas antioxidantes, que se encuentran en todos los eucariotas y No son enzimas que degradan la lignina, tienen actividad decolorante de la melanina. Aunque GPX y TPX también podrían reducir el color de la melanina en presencia de peróxido de hidrógeno, estas enzimas tienen la posibilidad de actuar como un componente principal del mecanismo de decoloración de la melanina de la fracción lisosomal.

GPX, que fue más eficaz para reducir el color de la melanina in vitro, se trató con células de melanoma B16F10 para determinar su efecto sobre la síntesis de melanina. En células de melanoma B16F10, GPX no fue citotóxica a concentraciones efectivas en la decoloración de compuestos de melanina, y la concentración de peróxido de hidrógeno tratada en conjunto fue de 0,1 mM, sin toxicidad. El tratamiento con peróxido de hidrógeno inhibió en gran medida la síntesis de melanina, y al trabajar con GPX, la eficiencia fue mejor, mientras que no hubo dependencia de la concentración del fármaco. Dado que el peróxido de hidrógeno es rápidamente consumido por las enzimas, se puede interpretar que cuanto mayor sea la concentración de enzima a tratar, menor será la inhibición de la síntesis de melanina por el peróxido de hidrógeno. El hecho de que el tratamiento con GPX no mostrara una reducción drástica de la melanina en ausencia de peróxido de hidrógeno también apoya esta opinión (no se muestran los datos). Como resultado, la GPX inhibió la producción de compuestos de melanina, pero la síntesis de melanina en las células se vio más afectada por el peróxido de hidrógeno que por la GPX. Estos resultados sugieren que las enzimas antioxidantes inducen la degradación de melanina en los mecanismos de autofagia que digieren los melanosomas.

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Conclusión

Nuestro estudio muestra que la glutatión peroxidasa (GPX) y la tiol peroxidasa (TPX) contribuyen a la decoloración de la melanina y que la GPX inhibe eficazmente la síntesis de melanina. Los resultados apoyan la hipótesis de que las enzimas antioxidantes inducen la degradación de la melanina en los mecanismos de autofagia que digieren los melanosomas. Para llegar a una conclusión definitiva, puede ser necesario estudiar el mecanismo de la digestión de los melanosomas en las células de la piel, los queratinocitos y los melanocitos.