Método HPTLC de fase reversa altamente sensible y ecológicamente sostenible para la determinación de hidroquinona en cremas blanqueadoras comerciales

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Mohammed H. Alqarni 1, Prawez Alam 1, Faiyaz Shakeel 2, Ahmed I. Foudah 1 y Sultan Alshehri 2,*

Resumen: hidroquinona(HDQ) es un agente despigmentante natural, que se usa comúnmente en preparaciones para tonificar la piel. La seguridad y el verdor de los métodos analíticos de cuantificación de HDQ no se consideraron en la literatura anterior. Por lo tanto, se estableció un ensayo basado en cromatografía de capa fina de alto rendimiento (RP-HPTLC) de fase reversa altamente sensible y ecológicamente más ecológico para la estimación de HDQ en cuatro pruebas comerciales diferentes.blanqueocremas (CWC). La mezcla binaria de etanol-agua (60:40, v·v−1) se utilizó como sistema de disolvente verde. La estimación de HDQ se realizó a 291 nm. El presente ensayo basado en RP-HPTLC fue lineal en el rango de 20–2400 ng banda−1. El presente método analítico fue altamente sensible en base a los datos de detección y cuantificación. Los demás parámetros de validación, como exactitud, precisión y robustez, también fueron adecuados para la determinación de HDQ. Las cantidades máximas de HDQ se obtuvieron en CWC A (1,23 por ciento w·w−1), seguido de CWC C (0,81 por ciento w·w−1), CWC D (0,43 por ciento w·w−1) y CWC B (0,37 por ciento w· w−1). La puntuación de VERDE analítico (AGREE) para el presente método analítico se estimó en 0,91, lo que indica las excelentes características más ecológicas del presente ensayo de RP-HPTLC. Estos resultados sugieren que el presente método analítico es altamente sensible y ecológicamente sustentable para la cuantificación de HDQ en sus formulaciones comerciales.

Palabras clave:aceptar;hidroquinona; RP-HPTLC ecológicamente sostenible; validación

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1. Introducción

hidroquinona(HDQ) es un compuesto natural, que está presente en varias formulaciones comerciales de tonificación de la piel para el tratamiento del melasma (una enfermedad causada por la acumulación excesiva de melanina en la piel humana) [1,2]. Es un potente agente despigmentante y se utiliza como alternativa a la tirosinasa [3]. Es uno de los agentes más utilizados en el tratamiento de la hiperpigmentación de la piel humana [4,5]. La concentración efectiva de HDQ en formulaciones comerciales para tonificar la piel varía de 1.5 a 2.0 por ciento p·w−1[6]. La alta concentración de HDQ (más del 5 por ciento p·w−1) provoca irritación local y leucoderma en la piel humana [5,6]. Debido a sus controvertidos efectos secundarios, muchos países han prohibido el HDQ comoblanqueoagente en formulaciones tópicas [7]. Sin embargo, varias investigaciones clínicas han sugerido varios efectos protectores deHDQen el manejo de diferentes trastornos hiperpigmentarios de la piel como melasma, pecas, lentigos, etc. [8,9]. Al considerar tanto los beneficios como los riesgos de HDQ, es necesario su análisis cuantitativo en diferentes formulaciones comerciales para tonificar la piel.

Se utilizan diferentes ensayos farmacéuticos para la cuantificación de HDQ ya sea solo o en combinación con otrosblanqueoagentes en cremas blanqueadoras comercializadas (CWC). Se ha documentado una variedad de ensayos basados ​​en espectrometría ultravioleta (UV) para el análisis cuantitativo de HDQ en productos blanqueadores comerciales (CWP) y preparaciones farmacéuticas [10-13]. Se ha documentado una amplia gama de ensayos basados ​​en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la determinación de HDQ junto con sus éteres en una variedad de CWC y CWP [14–23]. También se han establecido varios métodos voltamétricos para la determinación simultánea de HDQ y sus derivados de éter en CWP [24–29]. También se han establecido otros ensayos analíticos, como la electroquímica de inyección de flujo [30], la cromatografía electrocinética micelar [31], la electrocromatografía capilar [32] y los ensayos basados ​​en nanocompuestos [33] para laHDQanálisis junto con sus derivados de éter y otrosblanqueoagentes en CWP. También se han informado algunos nanosensores electroquímicos para el análisis HDQ [34,35]. Nuestro grupo de investigación también aplicó un único método basado en cromatografía de capa fina de alto rendimiento de fase normal (HPTLC) para el análisis cualitativo y cuantitativo de HDQ en CWC [1].

Después de un análisis exhaustivo de los ensayos informados sobre el análisis HDQ, se observó que la seguridad y la sostenibilidad ecológica de los métodos farmacéuticos en la literatura no han sido evaluadas ni consideradas para su evaluación. Además, los ensayos basados ​​en HPTLC de fase reversa verde/ecológicamente sostenible (RP-HPTLC) aún no se han utilizado para la estimación deHDQen sus CWC. Los ensayos basados ​​en HPTLC ecológicos/sostenibles ofrecen muchas ventajas, como la simplicidad, la economía, el bajo costo de operación, el tiempo de análisis corto, el análisis paralelo de múltiples muestras, la claridad de detección y la reducción de la toxicidad ambiental en comparación con HPLC y otros métodos analíticos [36–39]. En consecuencia, se seleccionó para este estudio un método RP-HPTLC para la determinación de HDQ. Se utilizan diferentes enfoques para la evaluación del perfil de verdor de los ensayos farmacéuticos [38–43]. Sin embargo, solo el enfoque métrico analítico VERDE (AGREE) aplica los 12 principios de la química analítica verde (GAC) para la evaluación de la verdor [42].

El enfoque métrico AGREE se aplicó para la evaluación del verdor del método presentRP-HPTLC [42]. Por lo tanto, el presente trabajo se llevó a cabo para desarrollar un método RP-HPTLC altamente sensible y verde/ecológicamente sostenible para la estimación deHDQen cuatro CWC diferentes. El perfil de verdor del presente método RP-HPTLC se obtuvo mediante AGREE: The Analytical Greenness Calculator. El presente ensayo analítico para el análisis de HDQ fue validado de acuerdo con las directrices Q2 (R1) del Consejo Internacional para la Armonización (ICH) [44].

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales

El estándar de referencia de HDQ (pureza: 99 por ciento) se obtuvo de Fluka Chemica (Darmstadt, Alemania). El metanol (MeOH) y el etanol (EtOH) de grado HPLC se obtuvieron de Alfa Aesar (Tewksbury, MA, EE. UU.). Se recolectó agua de grado HPLC (H2O) de un sistema de purificación de agua Milli-Q (E-Merck, Darmstadt, Alemania). Otros disolventes y reactivos utilizados fueron de grado analítico. Se obtuvieron cuatro CWC diferentes de HDQ de un mercado farmacéutico en Al-Kharj, Arabia Saudita, en el mes de junio de 2021. Los CWC deHDQse almacenó en un lugar fresco y oscuro a 22 ◦C antes del inicio de los experimentos. Los CWC se almacenaron durante aproximadamente un mes antes del inicio de los experimentos.

2.2. cromatografía

La cuantificación por densitometría RP-HPTLC de HDQ en su estándar de referencia y cuatro CWC diferentes se realizó utilizando un instrumento HPTLC (CAMAG, Muttenz, Suiza). El análisis cuantitativo de HDQ se llevó a cabo en placas con respaldo de vidrio de 10 × 20 cm2 recubiertas previamente con placas RP 60 F254S de gel de sílice (E-Merck, Darmstadt, Alemania). Las muestras en las placas de TLC se colocaron como bandas de 6 mm. utilizando un aplicador automaticsampler 4 (ATS4) (CAMAG, Ginebra, Suiza). El aplicador de muestras estaba equipado con una jeringa de microlitros CAMAG (Hamilton, Bonaduz, Suiza). La tasa de aplicación para el análisis cuantitativo deHDQse mantuvo constante a 150 nL s−1. Las placas se revelaron en una cámara de revelado automático 2 (CAMAG, Muttenz, Suiza) a una distancia de 80 mm. El sistema de disolvente verde para el análisis HDQ fue EtOHH2O (60:40, v·v−1). La cámara de revelado se saturó previamente con los vapores de la fase móvil durante 30 min a 22 ◦C. El HDQ se detectó a 291 nm. Las dimensiones de la rendija fueron 4 × 0,45 mm2 y la velocidad de exploración fue de 20 mm s-1. Cada experimento se llevó a cabo por triplicado. El software utilizado para el procesamiento de datos fue WinCATs (v. 1.4.3.6336, CAMAG, Muttenz, Suiza).

2.3. Curva de Calibración HDQ y Preparación de Muestras de Control de Calidad

La cantidad especificada de HDQ (10 mg) se dispensó en 100 mL de sistemas de solventes verdes EtOH-H2O (60:40, v·v−1) para lograr la solución madre con la concentración de 100 µg mL−1. Los diferentes volúmenes de soluciones madre se diluyeron aún más usando sistemas de EtOH-H2O (60:40, v·v−1) para lograr concentraciones de HDQ en el rango de 20–2400 ng banda−1. Las soluciones obtenidas deHDQque contenían diferentes concentraciones se colocaron en placas de HPTLC. El área del pico de HPTLC para HDQ se obtuvo para cada solución de HDQ utilizando el presente ensayo farmacéutico. La curva de calibración de HDQ se generó trazando las concentraciones de HDQ frente a su área de HPTLC. Además, tres muestras de control de calidad (QC) diferentes, como muestras de QC bajo (LQC; 20 ng band−1), QC medio (MQC; 600 ng band−1) y QC alto (HQC; 2400 ng band−1) , se obtuvieron por separado para determinar diferentes parámetros de validación para el presente ensayo farmacéutico.

2.4. Procesamiento de muestras para la determinación de HDQ en CWC

El HDQ se extrajo de cuatro CWC diferentes mediante la adopción del procedimiento informado en la literatura [1]. Las cantidades exactamente pesadas (5,0 g) de cuatro CWC diferentes, incluidos A, B, C y D, se transfirieron al embudo de separación por separado. Cada CWC se agitó en el embudo de decantación con MeOH (3 × 70 ml) durante un período de 30 min a 22 ◦C. Los extractos de MeOH de cada CWC se combinaron y evaporaron por separado hasta sequedad bajo presión reducida utilizando un evaporador rotatorio al vacío. Los residuos obtenidos se reconstituyeron con 10 ml de MeOH y se almacenaron en un refrigerador hasta su posterior evaluación. Las muestras obtenidas se sometieron a análisis HDQ utilizando el presente método analítico a 291 nm.

2.5. Parámetros de validación

El presente ensayo RP-HPTLC para análisis HDQ fue validado para diferentes parámetros de validación siguiendo las pautas ICH-Q2 (R1) [44]. losHDQla linealidad se evaluó trazando las concentraciones de HDQ frente a su área máxima medida. La linealidad de HDQ se evaluó en 11 muestras de control de calidad diferentes de 20, 40, 60, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 1200 y 2400 ng de banda−1 para el presente ensayo farmacéutico. Los parámetros de eficiencia del sistema para el presente método analítico se evaluaron en términos del factor de retardo (Rf), el factor de asimetría (As) y el número de platos teóricos por metro (N m−1). El Rf, As y N m-1 se obtuvieron en MCQ (600 ng banda-1), como se informó anteriormente en la literatura [45].

La precisión del presente método RP-HPTLC se determinó como el porcentaje de recuperación. El porcentaje de recuperación se obtuvo en LQC (20 ng banda−1), MQC (600 ng banda−1) y HQC (2400 ng banda−1) para el presente método analítico.

La precisión del presente método analítico se evaluó como precisión intradía/interdía. La precisión intradía se determinó mediante el análisis de HDQ en LQC, MQC y HQC el mismo día para el presente ensayo analítico. La precisión entre días se determinó mediante el análisis de HDQ en LQC, MQC y HQC en tres días diferentes para el ensayo analítico actual [44]. Cada precisión se midió seis veces (n=6).

La robustez se evaluó introduciendo algunos pequeños cambios en los sistemas de disolvente verde para el presente método RP-HPTLC. Para la evaluación de la solidez, el sistema solvente original EtOH H2O (60:40, v·v−1) se cambió a EtOH-H2O (62:38, v·v−1) y EtOHH2O (58:42, v·v−1 ) sistemas solventes, y la respuesta HPTLC específica y los valores Rf fueron registrados e interpretados [44].

La sensibilidad del presente método analítico se evaluó como límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) usando un método de desviación estándar. Se calculó el LOD y LOQ ofHDQ para el presente método analítico, como se informa en la literatura [44,45].

La pureza/especificidad máxima se evaluó comparando los valores Rf y los espectros UV de HDQ en los CWC A, B, C y D con los del HDQ estándar para el presente ensayo farmacéutico.

2.6. Análisis cuantitativo de HDQ en CWC

Las muestras obtenidas de CWC A, B, C y D se colocaron en placas de HPTLC y se anotaron sus respuestas de TLC. El área del pico paraHDQen CWC se registró. Los contenidos de HDQ en CWC se calcularon utilizando la curva de calibración de HDQ para el método analítico actual.

2.7. Evaluación de verdor

Las características de verdor para el presente método analítico se obtuvieron utilizando el enfoque métrico AGREE [42]. Las puntuaciones AGREE (0.0–1.0) del presente método analítico se registraron utilizando AGREE: The Analytical Greenness Calculator (versión0.5, Universidad de Gdansk de Tecnología, Gdansk, Polonia, 2020).

3. Resultados y discusión

3.1. Desarrollo de métodos

Con base en los métodos analíticos de la literatura, se ha encontrado que falta el método RP-HPTLC ecológicamente sostenible capaz/verde para el análisis de HDQ en cosméticos comerciales. Por lo tanto, el presente estudio se llevó a cabo para desarrollar el método rápido, altamente sensible y ecológicamente sostenible. Método RP-HPTLC para análisis HDQ en CWC.

Para el análisis RP-HPTLC de HDQ, diferentes proporciones de EtOH y H2O, incluyendo EtOH-H2O (50:50, v·v−1), EtOH-H2O (60:40, v·v−1), EtOH-H2O (70:30, v·v−1), EtOH H2O (80:20, v·v−1) y EtOH-H2O (90:10, v·v−1), se evaluaron como las combinaciones de disolvente verde para la desarrollo de una banda confiable para análisis HDQ. Las mezclas de disolventes se desarrollaron en condiciones de saturación de la cámara. De los datos registrados, se observó que EtOH-H2O (50:50, v·v−1), EtOH-H2O (70:30, v·v−1), EtOH-H2O (80:20, v·v− 1), y las mezclas de solventes verdes EtOH-H2O (90:10, v·v−1) ofrecieron un cromatograma pobre deHDQcon un valor As inaceptable (As {{0}}.29). Sin embargo, la combinación de solvente verde EtOH-H2O (60:40, v·v−1) había demostrado ofrecer un cromatograma bien resuelto de HDQ atRf=0.83 ± 0.02 con un valor As aceptable (As {{ 12}}.03) (Figura 1). Por lo tanto, el EtOH H2O (60:40, v·v−1) se optimizó como las mezclas de solventes verdes para el análisis HDQ en los CWC. Las bandas espectrales UV para el presente método RP-HPTLC se registraron densitométricamente, y la respuesta máxima de HPTLC se encontró a 291 nm para el presente método RP-HPTLC. Por lo tanto, todo el análisis de HDQ se realizó a 291 nm.

3.2. Parámetros de validación

El presente ensayo farmacéutico para la cuantificación de HDQ se validó en cuanto al rango de linealidad, los parámetros de eficiencia del sistema, la exactitud, la precisión, la solidez, la sensibilidad y la pureza/especificidad del pico siguiendo las recomendaciones de la ICH [44]. Los resultados del análisis de regresión de mínimos cuadrados de la curva de calibración de HDQ para el presente método RP-HPTLC se presentan en la Tabla 1.HDQla curva de calibración fue lineal en el rango de 20-banda de 2400 ng con un coeficiente de determinación de 0,9997 para el presente método analítico. estos datos sugirieron una buena linealidad entre la concentración de HDQ y su respuesta.

Los parámetros de eficiencia del sistema del presente método farmacéutico se estudiaron en MQC (600 ng banda-1), y los resultados se incluyen en la Tabla 2. Los valores de Rf, As y N m-1 para el presente método analítico se pronosticaron como 0.83 ± 0.02, 1.03 ± 0.03 y 4987 ± 2.87, respectivamente. Estos resultados indicaron que el presente método analítico era confiable para el análisis HDQ en los CWC.

Los resultados del análisis de precisión para el presente método analítico se enumeran en la Tabla 3. El porcentaje de recuperación de HDQ para el presente método RP-HPTLC se determinó como 101,80 por ciento, 98,16 por ciento y 99,38 por ciento en LQC, MQC y HQC, respectivamente. . Los altos valores del porcentaje de recuperación indicaron la precisión del presente método RP-HPTLC para el análisis HDQ en los CWC.

La precisión se determinó como el porcentaje del coeficiente de variación (% CV), y los resultados se muestran en la Tabla 4. Los CV porcentuales de HDQ para el presente método analítico se pronosticaron como 0.91, 0. 59 y 0.26 por ciento en LQC, MQC y HQC, respectivamente, para la precisión intradiaria. Los CV porcentuales de HDQ para el presente método RP-HPTLC se predijeron como 0.98, {{10}}.69 y 0.32 por ciento en LQC, MQC y HQC, respectivamente, para el precisión interdiaria. Los valores bajos del porcentaje de CV indicaron la precisión del presente método RP-HPTLC para el análisis HDQ en CWC.

Los resultados del análisis de robustez para el presente método analítico se muestran en la Tabla 5. Los CV porcentuales para el análisis de robustez se pronosticaron como 0.59–0.66 por ciento para el método analítico actual. Los valores de Rf de HDQ se encontraron en el rango de 0.82–0.84 para el método analítico actual. Los cambios estrechos en los valores Rf de HDQ y los CV porcentuales más bajos mostraron la solidez del presente método analítico para la cuantificación de HDQ en CWC.

La sensibilidad para el presente método analítico se registró como "LOD y LOQ", y sus valores físicos se muestran en la Tabla 1. Los "LOD y LOQ" para el método analítico actual se predijeron como 6,91 ± 0,23 y 2 0.73 ± 0.68 ng banda−1, respectivamente, paraHDQcuantificación. Estos valores físicos de "LOD y LOQ" para el presente método analítico indicaron la sensibilidad para el análisis HDQ en CWC.

La pureza/especificidad máxima para el presente método analítico se evaluó comparando los espectros UV superpuestos de HDQ en cuatro CWC diferentes con los de HDQ estándar. Los espectros UV superpuestos de HDQ estándar y HDQ en cuatro CWC diferentes se muestran en la Figura 2. La respuesta cromatográfica más alta para HDQ en HDQ estándar y CWC estudiados se observó a 291 nm para el presente método analítico. Los espectros UV, valores Rf y longitud de onda de HDQ idénticos en HDQ estándar y CWC indicaron la pureza/especificidad máxima para el presente método analítico.

3.3. Análisis de Contenidos HDQ en CWCs

La aplicabilidad del presente ensayo analítico se verificó en la estimación cuantitativa de HDQ en CWC. El cromatograma deHDQde CWC se identificó comparando su punto de TLC en Rf {{0}}.83 ± 0.02 con los de HDQ estándar para el presente método analítico. Los cromatogramas de HDQ en CWC A y B para el presente ensayo analítico se resumen en la Figura 3. Los cromatogramas de HPTLC de HDQ en CWC eran idénticos a los de HDQ puro. También aparecieron algunos picos adicionales en los cromatogramas de los CWC, que podrían estar asociados con diferentes excipientes presentes en los CWC. El método HPTLC ecológicamente sostenible fue selectivo para el análisis HDQ en Rf=0.83 sin interferencia de los otros ingredientes de los CWC. Se encontró que el valor Rf (0.83) de HDQ en CWC era idéntico al de HDQ estándar ({{20}}.83), lo que indica que no hubo interacción entre HDQ y Ingredientes de CWC. Por lo tanto, no hubo influencia de los ingredientes de la formulación sobre la calidad del cromatograma HDQ, el LOD y la eficiencia del presente método HPTLC de análisis HDQ. La presencia de picos adicionales en los cromatogramas de CWC indicó que el presente método RP-HPTLC era confiable para la estimación de HDQ en presencia de ingredientes de formulación. Los contenidos de HDQ de CWC se determinaron a partir de la curva de calibración de HDQ, y los resultados se incluyen en la Tabla 6. La Tabla 6 también resume la cantidad etiquetada de HDQ y sus ingredientes de formulación. Los contenidos de HDQ fueron más altos en CWC A (1.23 por ciento p·w−1) seguido por CWC C (0.81 por ciento p·w−1), CWC D (0.43 por ciento p·w −1) y CWC B (0,37 por ciento p·w−1). Los contenidos registrados de HDQ fueron mucho más bajos que la cantidad declarada (2,00 por ciento p·w−1) de HDQ en los CWC estudiados. Los contenidos de HDQ en dos CWC diferentes (A y B) se registraron como 0,69 % w·w−1 y 0,34 % w·w−1, respectivamente, usando el método HPTLC de fase normal en la literatura [1]. Los contenidos informados de HDQ también fueron mucho más bajos que la cantidad etiquetada (2.00 por ciento p·w−1) de HDQ en la literatura [1]. Varios CWC o CWP se comercializan bajo la afirmación de que son completamente naturales. Sin embargo, es común encontrar algunos productos químicos sintéticos como adulterantes con los mismos efectos que se encuentran en tales CWC o CWP como fraude. La cantidad de HDQ registrada en este trabajo y las registradas en la literatura indicaron que los CWC estudiados tienen una baja cantidad de HDQ y no coincidían con las afirmaciones de la etiqueta [1]. Por lo tanto, se espera que los CWC estudiados contengan algunos químicos sintéticos como adulterantes. En general, el presente ensayo analítico se puede utilizar para el análisis HDQ en preparaciones cosméticas y farmacéuticas.

3.4. Evaluación de verdor

Se utilizan diferentes métodos para la evaluación del verdor de los ensayos farmacéuticos [38–43]. Sin embargo, solo el enfoque AGREE utiliza los 12 principios del GAC para la evaluación del verdor [42]. Por lo tanto, el perfil de verdor del presente método analítico se obtuvo utilizando la calculadora AGREE. La puntuación AGREE predicha utilizando 12 principios diferentes de GAC para el presente ensayo analítico se presenta en la Figura 4. La puntuación AGREE para diferentes principios de GAC se registró de la siguiente manera: Tratamiento de la muestra: 0.61 Posicionamiento del dispositivo analítico: 1.{{ 9}}Pasos para la preparación de muestras: 1.00Grado de automatización: 0.80Derivatización: 1.00Cantidad de residuos: 1.{{17} }Rendimiento del análisis: 1.00Consumo de energía: 1.00Tratamiento de la muestra: 0,51Fuente del reactivo: 1.00Toxicidad de los disolventes: 1.00 Seguridad del operador: 1.00

El puntaje general de AGREE para el presente método analítico se registró como 0.91, lo que indica el excelente método analítico verde paraHDQcuantificación.

4. Conclusión

El método de densitometría RP-HPTLC se desarrolló para el análisis de HDQ en cuatro CWC diferentes de HDQ. El presente ensayo RP-HPTLC fue validado para diferentes parámetros de validación. El presente método analítico fue altamente sensible, rápido y ecológicamente sustentable paraHDQanálisis. La puntuación AGREE para el presente método analítico sugirió un excelente ensayo analítico para la cuantificación de HDQ. El presente REl método P-HPTLC fue adecuado para el análisis HDQ en cuatro CWC diferentes. Estos resultados indicaron que el presente ensayo analítico se puede aplicar para el análisis HDQ en diferentes preparaciones cosméticas y farmacéuticas.