Imágenes claras y cuantificación del riñón en 3D

edmund.chen@wecistanche.com

Durante décadas, las mediciones deriñónmicroanatomía utilizando 2-secciones dimensionales nos ha proporcionado un conocimiento detallado de riñón morfología en condiciones fisiológicas y patológicas. Sin embargo, el rápido desarrollo de los métodos de limpieza de tejido en los últimos años, en combinación con el desarrollo de nuevas modalidades de imágenes dimensionales 3-han proporcionado nuevos conocimientos sobreriñónestructura y función. Este artículo de revisión describe una variedad de ideas novedosas sobreriñóndesarrollo y enfermedad obtenidos recientemente utilizando estos nuevos enfoques metodológicos. Por ejemplo, en el desarrolloriñónestos enfoques han proporcionado nuevos conocimientos sobre la morfogénesis de la ramificación ureteral, la proliferación y el compromiso de las células progenitoras de nefronas, las interacciones entre las células de la punta ureteral y las células progenitoras de nefronas, y el establecimiento de la segmentación de nefronas. En ratón adulto enteroriñones, la limpieza de tejido combinada con la microscopía de hoja de luz puede generar imágenes y cuantificar el número total de glomérulos, un gran avance en el campo. Enfoques similares han proporcionado nuevos conocimientos sobre la estructura de la vasculatura y la inervación renales, la remodelación tubulointersticial, la pérdida e hipertrofia de podocitos, la formación de quistes, la evolución de las medias lunas celulares y la estructura de la barrera de filtración glomerular. Muchos más avances en la comprensión deriñónSe puede esperar biología y patología a medida que más investigadores desarrollen y adopten técnicas adicionales de limpieza e imagen.

Palabras clave:imágenes en 3D; glomérulo; desarrollo renal; nefropatología; limpieza de tejidos; túbulos; renal

CITANCHE MEJORARÁ LA FUNCIÓN RENAL/RENAL

Número total de nefronas en cada ser humano normalriñónoscila entre aproximadamente 200,000 a más de 2 millones, 1 con un promedio de aproximadamente 1 millón. Estas nefronas, así como los demás componentes delriñónincluidos los conductos colectores, los vasos sanguíneos, el intersticio y las fibras nerviosas se organizan con una precisión microanatómica exquisita. 2 Este patrón preciso sustenta la normalidadFunción del riñóny la salud, que puede verse gravemente alterada cuando la arquitectura del tejido se altera debido a hipertrofia o contracción glomerular o tubular, pérdida de nefronas, anomalías congénitas, rarefacción de los vasos y fibrosis intersticial. Una gama de enfoques de imágenes ha contribuido a nuestra comprensión integral deriñónmicroanatomía durante el desarrollo y en el adulto sano y enfermoriñón. En su mayor parte, esta comprensión proviene del análisis de secciones 2-dimensionales (2D), ya sean secciones físicas microscópicas de luz o electrónicas o secciones ópticas confocales. La cuantificación de esta microanatomía ha dependido principalmente de análisis estereológicos de secciones que han proporcionado estimaciones de números, longitudes, áreas de superficie y volúmenes de glomérulos, túbulos, vasos, intersticios y sus componentes celulares. 3,4 Hasta hace poco, la visualización 3D deriñónLa microestructura se limitó en gran medida a la microscopía confocal, que permite el corte óptico y la reconstrucción 3D hasta una profundidad de 50 a 80 mm. Desafortunadamente, las propiedades refractivas de los componentes de proteínas y lípidos dentro de un tejido dispersan la luz y reducen drásticamente la calidad de la imagen a medida que aumenta la profundidad. En los últimos años, se ha desarrollado una variedad de métodos de limpieza para eliminar el contenido de lípidos y pigmentos de un tejido y hacer coincidir las propiedades refractivas del tejido y los medios de montaje para que el tejido sea transparente. 5 Los métodos de limpieza varían en complejidad desde la incubación de tejido en varias soluciones durante un período de horas hasta procedimientos prolongados que involucran equipos electroquímicos personalizados. Dirigimos a los lectores a revisiones recientes 5,6 para obtener una descripción general detallada de los métodos actuales y los documentos citados en este documento para métodos específicos y casos de uso.

Las estructuras subcelulares y las poblaciones enteras de células se pueden resolver dentro de órganos completos o secciones gruesas limpiadas. Las características de imagen precisas dentro del tejido limpio requieren microscopios especializados y procesamiento de imágenes para capturar y reconstruir datos volumétricos de muestras que pueden variar de cientos de micras a centímetros de tamaño. Los microscopios confocales de barrido puntual y de disco giratorio se han utilizado eficazmente para obtener imágenes de características dentro de áreas despejadas.riñónpero sufren una resolución reducida en el eje Z y una reducción progresiva en la intensidad de la fluorescencia en profundidad debido a un solo eje de iluminación e imagen. Las técnicas de microscopía de lámina de luz son especialmente adecuadas para obtener imágenes de tejidos limpios, ya que permiten la adquisición rápida de grandes volúmenes en 3D y pueden incluir imágenes e iluminación multiángulo. La tomografía de proyección óptica es otro enfoque que incorpora imágenes multiángulo y reconstrucción digital para producir datos en los que los ejes X, Y y Z de cada vóxel tienen la misma resolución. Independientemente del enfoque específico, la limpieza de tejidos y las imágenes de montaje completo brindan una nueva oportunidad para explorar microentornos celulares desconocidos y estructuras de tejidos de orden superior. En esta revisión, destacamos algunas ideas nuevas sobreriñóndesarrollo, adultoriñónestructura y patología que han resultado de la limpieza del tejido seguida de un análisis cuantitativo en 3D.

Nuevos conocimientos sobre el desarrollo renalDécadas de perfiles de expresión génica y estudios de inactivación han llevado a una comprensión detallada de los tipos de células, las redes reguladoras de genes y las vías de señalización que controlan a los mamíferos.riñóndesarrollo. Este conocimiento informó el diagnóstico de enfermedades congénitas y permitió la producción deriñóntipos de células a partir de células madre pluripotentes. 7 Sin embargo, el tamaño, la opacidad y la complejidad del desarrolloriñónpresentó una barrera significativa para medir con precisión la morfogénesis de este órgano y la distribución 3D de células y proteínas dentro de él. La aplicación de la limpieza de tejidos y de imágenes multiescala en elriñónha permitido la visualización y el análisis cuantitativo de la morfogénesis de la ramificación ureteral, las poblaciones de células progenitoras y la dotación de nefronas dentro de los órganos intactos (Figura 1). 8 Estos enfoques sustentan una nueva capacidad para el fenotipado de precisión y abren caminos para analizar los impulsores celulares y moleculares deriñóndesarrollo y enfermedades congénitas.

Imágenes y análisis de la morfogénesis de ramificación en 3D.El establecimiento del árbol ureteral es una característica definitoria deriñóndesarrollo y ha sido ampliamente estudiado usando genética de ratón y aplanadoriñóncultivos de explantes. Sin embargo, comprender cómo los genes individuales contribuyen al crecimiento, la forma y el patrón de esta estructura de conductos epiteliales ramificados in vivo requería la capacidad de obtener imágenes y analizar esta red compleja en una amplia gama de tamaños de muestra. Corto et al. 8 abordó estos problemas utilizando inmunofluorescencia de montaje completo, limpieza a base de solventes (benzoato de bencilo de alcohol bencílico) e imágenes de órganos completos con tomografía de proyección óptica. Empleando este enfoque para capturar instantáneas 3D desde principios hasta mediados deriñóndesarrollo, el equipo desarrolló un software de análisis personalizado para obtener detalles sin precedentes sobre el árbol ureteral, incluido el número de puntas, los ángulos y la longitud de las ramas, los volúmenes de las ramas y el número de generaciones de ramificación de árboles ureterales intactos (Figura 1c y d). 8 Utilizado inicialmente para caracterizar e identificar aspectos novedosos de la ramificación renal, 9,10 los esfuerzos en curso buscan definir los principios y los reguladores clave que gobiernan el patrón de ramificación in vivo. 1

Vinculación de la dinámica de progenitores a la morfogénesis de órganos con imágenes multiescala.Las interacciones moleculares entre las células de la punta ureteral y las células progenitoras de nefronas juegan un papel importante en el establecimiento del complemento de nefronas que facilitanFunción del riñónen la vida adulta. Los progenitores de nefronas no inducidos producen factores que promuevenriñóncrecimiento a través de la ramificación ureteral, mientras que las señales espacialmente restringidas dentro de la punta ureteral mantienen el estado de progenitor de la nefrona e inducen a un subconjunto de estos progenitores a diferenciarse en una nefrona temprana. Estas interacciones impulsan un ciclo de ramificación e inducción de nefronas que cesa alrededor del nacimiento, cuando los progenitores de nefronas restantes se diferencian. Antes de los métodos de limpieza de tejido, nuestra comprensión de la dinámica deriñónla morfogénesis y la abundancia relativa de poblaciones de células progenitoras a lo largo del tiempo se vieron gravemente limitadas. Esto cambió con el desarrollo de enfoques de imágenes multiescala que utilizan protocolos de inmunofluorescencia extendidos, limpieza de tejidos y enfoques de imágenes para cuantificarriñóndesarrollo a nivel celular (confocal) y de órgano completo (tomografía de proyección óptica, lámina de luz). 9,10 Se hizo evidente que las tasas deriñónel crecimiento varía dramáticamente con tasas inicialmente rápidas de ramificación y proliferación que disminuyen en fases que se correlacionan con reducciones en el número de células progenitoras dentro del nicho nefrogénico. 10 Imágenes confocales tridimensionales de fetos humanos completos despejadosriñones(semana 11) o muestras de lariñóncorteza (semanas 11-23) afirman que esta disminución en el tamaño del nicho se conserva en todas las especies. 12 Un análisis comparativo adicional del nicho nefrogénico humano y de ratón en tejido aclarado condujo a un nuevo modelo de reclutamiento basado en el tiempo de formación de nefronas, en el que las células progenitoras se agregan progresivamente a una nefrona temprana y adoptan una identidad de segmento de acuerdo con el orden en que llegan . 13 En otro estudio centrado en el compromiso de los progenitores de nefronas, se usó un método de limpieza de tejido basado en hidrogel (passive Clear Lipid-exchanged Acryl-amide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/In situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel [CLARITY] 14 ) para su capacidad de retener la fluorescencia de un reportero tdTomato endógeno. El análisis del etiquetado tdTomato dentro del tejido aclarado mostró que las células dentro de la nefrona de compromiso temprano pueden volver a un estado progenitor, donde los resultados anteriores sugirieron que el compromiso era unidireccional. 15 Por lo tanto, la limpieza de tejidos ha mejorado nuestra comprensión de los procesos de desarrollo dinámico a través de escalas y especies.

Fenotipado de precisión. Los avances en la limpieza de tejidos y el análisis cuantitativo han permitido una nueva capacidad para el fenotipado de precisión. Se han identificado cambios estadísticamente sólidos en la ramificación y el número de nefronas en modelos de ratón con fenotipos sutiles como Ret þ/? y Six2 þ/? ratones (Figura 2), que previamente fueron clasificados como "normales". 10,16 Imágenes confocales de alta resolución de Wnt11 ?/?riñonesidentificó un nuevo fenotipo celular en el que los progenitores de nefronas aparecen desorganizados debido a la incapacidad de formar uniones celulares estables con la punta ureteral y diferenciarse prematuramente. 17 Estos métodos también se han utilizado para cuantificar cómo influyen los nuevos reguladores del estado de las células progenitoras de nefronas, como la ADN metiltransferasa 1, los microARN Lin28 y Let7, y TSC1.riñóndesarrollo y número de nefronas. 18–20 Es probable que el fenotipado de precisión se convierta en una herramienta importante en nuestro esfuerzo por comprender el efecto aditivo de los factores genéticos y ambientales que contribuyen al bajo número de nefronas y la predisposición a la enfermedad crónica.enfermedad del riñon.

Modelado matemático deriñónmorfogénesis. Los datos que se producen a partir de los datos en desarrollo despejadosriñónestán alimentando una ola de modelos matemáticos basados ​​en imágenes que intentan discernir cómo la forma macroscópica y la función de un tejido surgen de las interacciones moleculares entre las poblaciones de células progenitoras. 11,21–23 La aplicación adicional de imágenes de órganos completos en tejido aclarado será fundamental para comprender los impulsores moleculares y celulares del patrón de tejido 3D y puede ser la clave para mejorar la estructura y la precisión de los modelos de células madre delriñón.

Morfología y patología 3D del riñón adultoLa intrincada morfología del adulto.riñónlimita el uso de herramientas morfológicas 2D, ya que pueden transmitir percepciones incompletas o engañosas de la estructura 3D. Aquí, discutimos algunos de los avances metodológicos importantes en los últimos años que ahora permiten un análisis 3D robusto de estructuras en el adulto.riñón, que van desde intactoriñoneshasta los componentes de la barrera de filtración glomerular (Figura 3). 2

LA CITANCHE MEJORARÁ LA INSUFICIENCIA RENAL/RENAL

Número y tamaño de nefrona.El humanoriñónmuestra un alto nivel de variabilidad intra e intersujeto en el número y volumen de nefronas, que se ha descrito en estudios de autopsia de sujetos sinenfermedades renales1,30,31 y se ha relacionado con trastornos del desarrollo. Durante décadas, la herramienta estándar de oro para cuantificar el número de nefronas en muestras experimentales y humanas ha sido el método disector/fraccionador, un método estereológico basado en el diseño. 3,4 Si bien este enfoque es exacto y preciso, también es práctico, lleva mucho tiempo y requiere una capacitación significativa. Por esta razón, se han propuesto enfoques alternativos para diseñar métodos eficientes que puedan proporcionar criterios de valoración de alta calidad: 32 por ejemplo, combinaciones de métodos de limpieza óptica, incluidos los hidrófobos (anteriormente conocidos como basados ​​en solventes), hidrófilos o basados ​​en hidrogel, con microscopía de luz (p. ej., confocal, multifotónica o de lámina de luz).

Hasta donde sabemos, el primer informe que combinó el aclaramiento óptico y la microscopía de hoja de luz para el análisis del número y tamaño de las nefronas fue publicado por Klingberg et al. 24 en un documento histórico que presentó múltiples avances importantes. Primero, este informe introdujo el cinamato de etilo, un solvente no peligroso que podría reemplazar a los químicos tóxicos como el alcohol bencílico y el benzoato de bencilo, que hasta entonces se usaba regularmente en los protocolos de limpieza hidrofóbica. En segundo lugar, los investigadores realizaron el recuento de nefronas en ratones intactos.riñones yon un modelo agresivo y progresivo de inmunomediaciónenfermedad del riñon, identificando la pérdida de nefronas durante el curso de la enfermedad. Además, se introdujeron pasos significativos hacia la automatización computarizada de algoritmos de segmentación de imágenes, lo que proporcionó un camino hacia mejoras significativas en la eficiencia. Recientemente, Østergaard et al. 25 presentaron un método similar de limpieza hidrofóbica combinado con microscopía de hoja de luz y segmentación de imágenes automatizada que proporciona tanto el número total de nefronas como el volumen glomerular único en un modelo de ratón con nefropatía diabética. Además, este estudio mostró un elegante etiquetado funcional de los túbulos proximales a través de la inyección de albúmina in vivo para visualizar la unión tubular glomerular y un protocolo simple para la histopatología correlativa en las mismas muestras depuradas ópticamente. Este informe muestra la flexibilidad de estos protocolos, que se están convirtiendo en canales de varias capas para la elaboración de perfiles completos de tejidos.

Vasculatura e inervación renal.Seguimiento de las vías de la ramificación de la vasculatura o de las fibras nerviosas en el adultoriñónes casi imposible en la histología convencional 2D, ya que el tamaño del órgano y la complejidad de la distribución estructural requieren un corte en serie extenso y experto. Recientemente, Huang et al. 33 informaron sobre un tinte fluorescente infrarrojo cercano catiónico (MHI148-PEI) para etiquetar específicamente los vasos sanguíneos, que se puede combinar con un protocolo de limpieza modificado y acelerado basado en cinamato de etilo para acortar el tiempo de procesamiento del tejido. Este enfoque abre nuevas vías para la investigación vascular en elriñón,especialmente cuando se requieren imágenes de alta resolución en 3D. Del mismo modo, Hasegawa et al. 26 utilizaron Cócteles de imágenes cerebrales/corporales sin obstrucciones y análisis computacional (CUBIC) junto con un sistema de microscopía de lámina de luz hecho a la medida para identificar la distribución de la inervación simpática en el riñón intacto del ratón. Los nervios simpáticos se distribuyeron principalmente alrededor de las arterias. Después de 10 días de lesión por isquemia o reperfusión, la densidad de la inervación simpática disminuyó significativamente, lo que se correlaciona con niveles reducidos de norepinefrina entejido renal. Estos cambios persistieron parcialmente 28 días después de la lesión inicial, lo que sugiere que se pueden encontrar alteraciones simpáticas continuas durante la progresión de la enfermedad crónica.enfermedad del riñon.

Remodelación tubulointersticial.El sistema tubular renal es particularmente difícil de analizar en 3D. La morfología intrincada y compleja plantea múltiples desafíos para los métodos convencionales basados ​​en cortes en serie y microscopía de luz estándar. Sin embargo, la limpieza óptica permite el análisis de túbulos intactos y su microambiente circundante. Saritas et al. 34 realizaron una combinación de aclaramiento óptico hidrófobo y basado en hidrogel seguido de microscopía óptica avanzada y análisis 3D semiautomático para caracterizar la remodelación tubular distal debido a la privación de potasio en la dieta. Los investigadores cuantificaron la hiperplasia tubular y detectaron un aumento en la proliferación de células dentro del tubulointersticio. Este estudio utilizó la versatilidad tanto del aclaramiento óptico como del

Figura 3| Morfometría tridimensional (3D) en el riñón adulto. ( a ) Recuento de nefronas en riñones completos mediante marcaje con CD31 de células endoteliales. El panel muestra una reconstrucción 3D (izquierda), una sección óptica en una vista bidimensional (2D) (centro) y áreas especiales que muestran glomérulos individuales en una comparación entre microscopía de hoja de luz (LSFM) y confocal y 2- microscopía de fotones (2P). Adaptado con permiso de la Sociedad Estadounidense de Nefrología, de Journal of the American Society of Nephrology, Evaluación completamente automatizada del número total de glomerulares y el tamaño del penacho capilar en riñones nefróticos mediante microscopía de hoja de luz, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, et al. ., volumen 28, número 2, 2017; permiso otorgado a través de Copyright Clearance Center, Inc. 24 (b) Tamaño de los glomérulos con registro espacial: la codificación por colores representa el tamaño glomerular, donde el rojo es el objeto más grande y el rosa el más pequeño. Adaptado con autorización de la Sociedad Estadounidense de Nefrología, de Kidney360, Automated Image Analyses of Glomerular Hypertrophy in a Mouse Model of Diabetic Nephropathy, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et al., volumen 6, número 6 , 2020; permiso transmitido a través de Copyright Clearance Center, Inc. 25 (c) Seguimiento de la vasculatura y la inervación, con una reconstrucción en 3D de un riñón intacto con inmunoetiquetado de los nervios simpáticos (verde), vasculatura (magenta) y fusionados (izquierda). Adaptado de Kidney International, volumen 96, número 1, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T, et al., Análisis tridimensional completo (CUBIC-riñón) visualiza nervios simpáticos renales anormales después de lesión por isquemia/reperfusión, páginas 129–138, Copyright ª 2019, con permiso de la Sociedad Internacional de Nefrología. 26 (d) Morfometría de podocitos en glomérulos individuales usando inmunomarcaje para el marcador específico de podocitos p57 (verde) y el marcador de ADN 4 0,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los paneles muestran (izquierda) una reconstrucción 3D y (derecha) las superficies renderizadas. Adaptado con permiso de la Sociedad Estadounidense de Nefrología, de Journal of the American Society of Nephrology, Validation of a Three-Dimensional Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., volumen 27, número 10, 2016; permiso transmitido a través de Copyright Clearance Center, Inc. 27 (e) Dinámica celular usando el rastreo de linaje, mostrando podocitos (extremo izquierdo), células epiteliales parietales (PEC) formando medias lunas celulares en 3D (centro-izquierda), una vista 2D de PEC invadiendo el lado glomerular con lesión vascular (centro-derecha) y una visualización 2D de la salida tubular (extremo derecho). Adaptado de Kidney International, volumen 96, número 2, Puelles VG, Fleck D, Ortz L, et al., Nuevo análisis en 3D mediante limpieza óptica de tejidos documenta la evolución de la glomerulonefritis rápidamente progresiva murina, páginas 505–516, Copyright ª 2019, International Society of Nephrology, bajo licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Visualización del diafragma de hendidura con aumentos crecientes de izquierda a derecha. Adaptado de Kidney International, volumen 99, número 4, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M, et al., Un protocolo rápido y simple de limpieza e inflamación para imágenes 3D in situ del riñón a través de escalas, páginas 1010–1020 , Copyright ª 2021, Sociedad Internacional de Nefrología, bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 Para optimizar la visualización de esta imagen, consulte la versión en línea de este artículo enwww.riñón-internacional.org.

microscopía óptica para realizar análisis tubulares en riñones intactos utilizando microscopía de lámina de luz e incrustación de hidrogel, así como la cuantificación unicelular en cortes de riñón mediante microscopía confocal y de aclaramiento hidrofóbico, ya que cada combinación se adaptaba mejor a la pregunta de investigación específica. Tahaei et al. utilizaron combinaciones de limpieza óptica y microscopía de luz avanzada. 35 quienes caracterizaron el dimorfismo sexual en la longitud del túbulo contorneado distal, lo que puede determinar su capacidad de adaptación al estrés fisiológico, y Schuh et al. 36 quienes revelaron diferencias axiales en la captación de ligandos del túbulo proximal y la función endolisosomal, destacando que el segmento S1 está altamente especializado para reabsorber proteínas a través de endocitosis mediada por receptores. En un estudio reciente, Blanc et al. 2 analizaron un modelo de formación de quistes, mostrando que los quistes se desarrollaron solo en segmentos específicos de nefrona, lo que determinó su forma y se ubicaron contiguos a los túbulos normales no dilatados. En general, ahora tenemos múltiples ejemplos de aplicación directa de compensación óptica para el análisis sistemático del compartimento tubulointersticial.

Pérdida e hipertrofia de podocitos.El glomérulo proporciona un ejemplo único para el análisis de unidades funcionales intactas dentro de un órgano. En particular, el estudio del agotamiento de los podocitos se ha beneficiado directamente de estos avances tecnológicos, ya que las metodologías basadas en el diseño estándar de oro requieren una inversión significativa de tiempo y recursos. 37 La primera herramienta para el análisis morfométrico de podocitos en 3D de glomérulos de ratón intactos combinado inmunomarcaje deriñónrebanadas utilizando un protocolo modificado de inmunofluorescencia indirecta, aclaramiento óptico hidrofóbico y microscopía confocal, lo que facilitó la cuantificación del número total de podocitos en glomérulos individuales completos de volumen conocido. Creemos que este enfoque es ideal para el estudio de procesos que afectan un subconjunto específico de estructuras (p. ej., pérdida de podocitos que conduce a glomeruloesclerosis focal y segmentaria). 27 La misma técnica se aplicó posteriormente para caracterizar el papel de la hipertrofia de podocitos como una respuesta compensatoria después de la pérdida de podocitos, un mecanismo que está mediado por la vía de señalización del objetivo de rapamicina en mamíferos. 38 Si bien estos 2 estudios se centraron en el análisis de los podocitos glomerulares, esta tubería basada en el inmunomarcaje convencional se puede utilizar para caracterizar los cambios morfológicos de cualquier tipo de célula a alta resolución espacial.

La evolución de las medias lunas celulares.Otra herramienta importante que necesitaba integrarse con éxito en la caja de herramientas para 3Driñónla morfometría es el rastreo del linaje genético. La mayoría de los métodos de limpieza óptica tienden a inducir un cierto grado de extinción de la fluorescencia (que varía de leve a grave). 6 Recientemente presentamos un protocolo que combina el rastreo del linaje, la limpieza óptica y la microscopía multifotónica para el análisis integral de la pérdida de podocitos y la activación de las células epiteliales parietales. 28 En este estudio, la pérdida de podocitos se identificó como una característica de la nefritis semilunar experimental utilizando el marcaje metabólico de podocitos con proteína fluorescente verde mejorada. La evolución de las medias lunas celulares se visualizó y cuantificó en función de la proliferación y migración de las células epiteliales parietales, que también se caracterizaron por una proteína fluorescente verde mejorada y se rastrearon durante el transcurso de un modelo experimental de nefritis en media luna. El análisis de los glomérulos intactos permitió la identificación de la pérdida focal de podocitos y la formación de lesiones, que progresaron a oclusiones tubulares por células epiteliales parietales, lo que condujo a la formación de glomérulos atubulares. Este estudio allana el camino para futuros estudios de interacciones inmuno-epiteliales complejas dentro de intactosriñones

CITANCHE MEJORARÁ LA DIÁLISIS RENAL/RENAL

Barrera de filtración glomerular.Una herramienta diagnóstica importante para la evaluación rutinaria de enfermedades glomerulares es el análisis ultraestructural de biopsias renales por microscopía electrónica. Una alternativa a la microscopía electrónica se puede encontrar en el campo de la microscopía de expansión, que por definición tiene como objetivo aumentar la resolución óptica aumentando las dimensiones del tejido. A lo largo de los años, Unnersjo-Jess et al. 39,40 han proporcionado múltiples protocolos para la visualización de estructuras a nanoescala en elriñón.Recientemente, estos investigadores informaron sobre un procedimiento rápido y simple para la visualización en 3D deriñónmorfología, combinando conceptos de limpieza óptica y expansión de tejido para resolver estructuras a nanoescala usando microscopía confocal convencional. 29 Este protocolo se aplicó para visualizar y cuantificar múltiples características patológicas en humanos y ratones.riñónbiopsias que incluyen borramiento del proceso del pie, alteraciones de la membrana basal glomerular, longitud del diafragma de hendidura, depósitos de IgG y características patológicas clásicas (p. ej., glomeruloesclerosis, fibrosis tubulointersticial y atrofia tubular). En resumen, este método permite la visualización y cuantificación multiescala de la patología renal mediante un método sencillo y herramientas de análisis de imágenes accesibles. La escalabilidad y la implementación de este enfoque en la práctica clínica probablemente estarán determinadas por la necesidad de equipos de microscopía óptica avanzados y el desarrollo de herramientas de análisis de imágenes automatizadas.

Conclusión

El espectro actual de métodos de limpieza de tejidos incluye técnicas simples que se pueden implementar en la mayoría de los laboratorios para mejorar las imágenes 3D en los microscopios comúnmente disponibles. A medida que las oportunidades que brindan estos nuevos enfoques se vuelven evidentes, anticipamos una mayor aceptación de los sistemas de microscopía especializados para obtener imágenes de tejido limpio de manera efectiva a alta resolución y el desarrollo de flujos de trabajo clínicos y de investigación personalizados para abordar preguntas específicas. El campo de la neurociencia ha servido como campo de pruebas para métodos y aplicaciones de obtención de imágenes de tejidos limpios. En este contexto, se han desarrollado análisis de imágenes automatizados, enfoques novedosos para estudiar la conectividad celular y proyectos de atlas de expresión de genes y proteínas en todo el tejido. Es probable que enfoques similares produzcan nuevos conocimientos sobre la anatomía celular y la interdependencia de las poblaciones celulares en el desarrollo y el adulto.riñón.

Las limitaciones prácticas de estos avances incluyen el costo del hardware de imágenes y las dificultades para manejar, almacenar y analizar grandes conjuntos de datos. Otras limitaciones surgen de la falta de reproducibilidad de la tinción con tejidos afectados de forma variable por las condiciones de fijación y el etiquetado de anticuerpos. Como resultado, existe la necesidad de evaluar críticamente nuevos análisis 3D y compararlos con los métodos establecidos. A pesar de los impresionantes avances en la evaluaciónriñóndesarrollo y adultoriñónla estructura y la enfermedad destacadas en esta revisión, creemos que lo mejor de la limpieza de tejidos y las imágenes en 3D aún está por llegar y es probable que sea un área emocionante de crecimiento parariñóninvestigación durante las próximas décadas.