La expresión Clr-f regula la homeostasis inmune y metabólica del riñón Ⅱ

Lesiones tubulares y glomerulares del riñón en ratones con deficiencia de Clr-f.

El examen inicial declr-f−/− las secciones de riñón revelaron varias alteraciones en la corteza renal. Para evaluarlesiones histopatológicas, Secciones de riñón teñidas con PASde cuatro 12-semanas WT yclr-fLos ratones −/− se evaluaron de forma ciega (Fig.2A). Se observó una presencia variable de lesiones tubulares proximales y distales enclr-f−/− riñones que incluyeron engorde de células epiteliales tubulares, desplazamiento nuclear y pérdida de los bordes en cepillo (Fig.2A; paneles superiores). En casos raros, se encontró necrosis tubular en forma de acumulación de restos necróticos luminales y pérdida epitelial completa en algunas de las áreas examinadas. Elclr-f−/− riñones también exhibidospatologías glomerulares(Higo.2A; paneles inferiores), con áreas de engrosamiento focal de los tufos glomerulares, proliferación mínima de fibroblastos periglomerulares asociada con fibrosis intersticial leve y lesiones más graves con mesangiolisis, aneurismas capilares que progresaron hasta una alteración pronunciada de los glomérulos y una presencia constante de restos celulares necrotizantes en los espacios de Bowman. . La puntuación de patología glomerular reveló un número significativo delesiones glomerularesen ratones con deficiencia de Clr-f en comparación con sus compañeros de camada WT (Fig.2B). La microscopía electrónica reveló daño severo de los podocitos, borramiento de la apófisis del pie de los podocitos y engrosamiento significativo de labasamento glomerularmembrana (GBM) (Fig.2C,D).

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Para evaluar si había depósitos de inmunoglobulinas en el riñón, que se asocian característicamente con las patologías observadas, teñimos secciones de la corteza renal de los riñones WT y Clr-f-/- para detectar la presencia de anticuerpos IgA, IgM e IgG mediante IF (Fig. 2E ). Los riñones Clr-f-/- muestran una tinción IF dominante clara de depósitos glomerulares de IgA acompañada de depósitos pronunciados de IgM y una presencia menor pero constante de depósitos de IgG. Asimismo, detectamos patrones similares de depósitos tubulointersticiales de IgA, IgM e IgG en riñones Clr-f-/-. La proteína del complemento C3 también se detectó ampliamente en los riñones Clr-f-/- pero no en los riñones WT (Fig. 2F).

Clr‑f es necesario para el funcionamiento adecuado de los riñones.

Para evaluar el impacto de las patologías Clr-f-/- en la función renal, analizamos la composición de la sangre y la orina de compañeros de camada Clr-f-/- y WT machos de 12- semanas de edad. Encontramos un aumento modesto, aunque estadísticamente significativo, en la relación proteína-creatinina (UP/CR) en orina en ratones Clr f -/- en comparación con ratones WT, con un aumento de creatinina sérica, pero niveles de proteína en orina similares en comparación con WT. ratones, así como una excreción fraccionada similar de sodio (FENa) (Fig. 2G). Dada la expresión tubular de Clr-f, evaluamos si la presión arterial del ratón Clr-f-/- en ratones Clr-f-/- de 12-semanas y de 24-semanas se vio afectada. Los ratones Clr-f-/- exhibieron una disminución marginal pero no estadísticamente significativa en la presión arterial en comparación con los compañeros de camada WT (Fig. 2H). Estos resultados muestran que la filtración renal normal se altera en ausencia de Clr-f, pero Clr-f no muestra funciones significativas en la homeostasis de los electrolitos renales o la regulación de la presión arterial.

El transcriptoma renal Clr-f-/- muestra una desregulación en el metabolismo.

Investigar los procesos transcripcionales subyacentes responsables de Clr-f-/-patofenotipos renales, realizamos una secuenciación de ARN en riñones de ratones WT y Clr-f-/- de 7-, 13- y 24- semanas de edad. Los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en ratones Clr-f-/- en comparación con ratones WT se investigaron mediante análisis de enriquecimiento funcional y análisis de patotipo transcripcional (Fig. 3A). Mapeamos redes de interacción de procesos biológicos enriquecidos a partir del análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) de DEG identificados en cada edad (Fig. 3B). Nuestro análisis mostró un enriquecimiento de genes relacionados con el ciclo celular regulados positivamente en los riñones de ratones Clr-f-/- de 7-semanas de edad. A las 13 semanas, los procesos metabólicos, el transporte, la muerte celular y las respuestas a sustancias tóxicas se enriquecieron a partir de DEG con mayor expresión en riñones Clr-f-/-, mientras que el ensamblaje de cilios no móviles, la transcripción y el procesamiento del ADN se enriquecieron a partir de DEG con disminución de la expresión. Los riñones de ratones Clr-f-/- de 24-semanas de edad también mostraron un enriquecimiento de los procesos metabólicos y el transporte entre DEG con mayor expresión, así como procesos que regulanla circulación sanguínea, mientras que los procesos de regulación de la señalización de la muerte celular, la inmunidad y el factor de crecimiento transformante beta (TGF) se enriquecieron a partir de DEG con expresión disminuida.

Para capturar los procesos asociados con la edad que subyacen a los defectos renales Clr-f-/-, analizamos genes que pertenecen a cuatro patrones dinámicos de expresión diferencial: DEG que aumentan con la edad, disminuyen con la edad o aumentan o disminuyen transitoriamente a las 13 semanas de edad. El análisis de enriquecimiento funcional de procesos biológicos, funciones moleculares y vías definidas entre estos grupos reveló que los DEG con expresión creciente entre las 7 y 24 semanas de edad en riñones Clr-f-/- estaban sobrerrepresentados en las vías metabólicas de lípidos, mientras que los DEG relacionados con células- La adhesión al sustrato disminuyó en la expresión de las 7 a las 24 semanas de edad (Fig. 3C). Los DEG con un aumento transitorio en la expresión a las 13 semanas de edad se asociaron principalmente con la respiración mitocondrial, mientras que los DEG con una disminución transitoria en la expresión se asignaron a las vías del ciclo celular. Dentro de estas cuatro categorías de expresión dinámica había tres subgrupos que representan patrones de expresión diferencial en los que la magnitud del cambio en la expresión entre las 7 y 13 semanas fue similar, mayor o menor que el grado de cambio entre las 13 y 24 semanas de edad. , respectivamente (Fig. 3C). Los procesos biológicos enriquecidos y las funciones moleculares de cada subgrupo de genes fueron en gran medida distintos en los cuatro principales patrones de expresión dinámica identificados, pero reflejaron procesos celulares superpuestos o relacionados dentro de cada grupo. En general, el perfil transcripcional de los riñones Clr-f-/- revela una desregulación dinámica y evolutiva del metabolismo, la función y la homeostasis celular.

Los ratones Clr-f-/- acumulan grasa.

El aumento identificado asociado a la edad en los DEG relacionados con el metabolismo de los lípidos nos llevó a sondear los datos de expresión de ratones WT y Clr-f-/- en busca de genes conocidos asociados a lípidos. La mayoría de estas transcripciones de genes se elevaron en ratones Clr-f-/- (Fig. 4A) y se alinearon con aumentos en los depósitos adiposos abdominales y perirrenales en ratones Clr-f-/- a las 24 semanas de edad (Fig. 4B). Aunque los ratones Clr-f-/- y WT exhibieron pesos corporales similares (Fig. 4C), el peso del tejido adiposo abdominal en los ratones Clr-f-/- fue significativamente mayor, lo que indica que el tejido adiposo representó una mayor proporción de Clr-f. −/− peso corporal del ratón (Fig. 4D). También detectamos acumulación ectópica de lípidos dentro de los riñones de ratones Clr-f -/-, como lo demuestra el aumento de la tinción con ORO de los riñones de ratón Clr f -/- (Fig. 4E). Como la grasa perirrenal y la presencia de grasa intersticial en el riñón están asociadas con factores de riesgo metabólico de ERC21, planteamos la hipótesis de si Clr-f protege contraetiologías de la diabetesotrastornos metabólicos relacionadosasociado conERC.

Los riñones de ratón Clr-f-/- tienen similitudes y diferencias en el perfil transcripcional con la enfermedad renal humana.

La acumulación ectópica de lípidos en el riñón se asocia con inflamación, fibrosis, disfunción mitocondrial y muerte celular22,23. Para evaluar si los riñones Clr-f-/- se parecen a las enfermedades renales definidas, comparamos el perfil transcripcional de los riñones Clr-f-/- con los perfiles de expresión publicados de tejido renal y/o sangre dedonantes humanos con ERC, nefropatía diabética(DN), nefritis lúpica (LN) oNefropatía por IgA(NIgA) (Fig. 5A). Perfiles transcripcionales renales Clr-f-/- agrupados con sangre de pacientes con NIgA y tejido glomerular de pacientes con DN (Fig. 5B). La comparación de los perfiles de expresión de pacientes de Clr-f-/- e IgAN mediante análisis de enriquecimiento funcional mostró aumentos paralelos en la expresión génica relacionada con las respuestas celulares de óxido reactivo, muerte celular, proteólisis y metabolismo de amidas, así como disminuciones compartidas en la expresión génica asociada con la membrana. procesos de tráfico, organización del citoesqueleto, señalización PI3K-AKT, ciclo celular y metabolismo de ADN/ARN (Fig. 5C). Por el contrario, los conjuntos de expresión renal Clr-f-/- diferían de la IgAN, con una mayor expresión de genes pertenecientes a las vías de señalización AGE-RAGE, ErbB, TNF/MAPK y Rap1, y procesos de reabsorción de agua regulados por vasopresina y actividad lisosómica. y la disminución de la expresión de genes pertenecía a la unión adherente, el ensamblaje del cilio no móvil, el ciclo celular, el metabolismo del ADN y la señalización de TGF. Estos hallazgos sugieren que, de manera similar a la NIgA, los procesos celulares de control del crecimiento, homeostasis y reparación también están desregulados en los riñones Clr-f-/-, mientras que el metabolismo alterado, la señalización del estrés yestructura epitelialy la función son exclusivas de los riñones Clr-f-/-.

Los riñones deficientes en Clr-f presentan inflamación e infiltración de células inmunitarias.

Dadas las funciones inmunomoduladoras conocidas de las proteínas Clr, examinamos la contribución de las células inmunitarias aPatología renal Clr-f-/-. Analizamos la composición de células inmunitarias de riñones completos de ratones WT y Clr-f-/- de 12-semanas de edad mediante citometría de flujo. Nuestro análisis reveló un aumento significativo en el número de neutrófilos, células T y células B, pero no hubo diferencias en el número de células NK renales, ILC o macrófagos (Fig. 6A). En el análisis de la distribución periglomerular de las células inmunes dentro de la corteza renal de los riñones WT y Clr-f-/- mediante IF, observamos acumulaciones glomerulares de células CD45+ (Fig. 6B). El etiquetado de CD11c, F4/80, NKp46 y CD3, marcadores indicativos de CD, macrófagos, NK/ILC y células T respectivamente, reveló una acumulación intraglomerular de células CD11c+ (Fig. 6C) y acumulaciones periglomerulares de F4/{{ 16}}, células NKp46+ y CD3+ en riñones Clr-f-/- (Fig. 6D). La cuantificación visual de las poblaciones de células inmunitarias detectadas en los glomérulos confirmó un aumento significativo en la presencia de cada una de estas poblaciones de células inmunitarias en los riñones de ratones Clr-f-/- en comparación con los ratones WT (Fig. 6E). El infiltrado inmunológico en la enfermedad renal autoinmune se ve potenciado por la secreción tubular de IL-12, lo que provoca una lesión por parte de las células secretoras de IFN24-26. Por lo tanto, examinamos los riñones WT y Clr-f-/- para detectar la presencia de estas citoquinas y observamos la tinción tanto de IL-12 como de IFN en células del tubulointersticio renal Clr-f-/- (Fig. 6F, GRAMO).

Dado que se postula que Clr-f es una señal de salud celular para las células que expresan NKR-P1G, planteamos la hipótesis de que la infiltración inmune renal en ratones Clr-f-/- se debe en parte a una mayor presencia de linfocitos que expresan NKR-P1G. en el riñón. El análisis de la expresión de NKR-P1G en células TCR + T renales y NK1.1+ células NK en ratones WT y Clr f -/- mediante citometría de flujo no mostró diferencias en la intensidad de fluorescencia media de la tinción con NKR-P1G en NK renal. células, pero un aumento en la tinción con NKR-P1G de células T renales en ratones Clr-f-/- (Fig. 6H)

Figura 5. Comparación entre perfiles transcripcionales de ratones Clr-f-/- y ERC humanas. (A) Tabla de conjuntos de datos del perfil de expresión génica de 15 trastornos renales humanos frente a ratones Clr-f-/- de 13-semanas de edad. La fuente de referencia para las fuentes del conjunto de datos del perfil de expresión humana se indica en la columna Estudio. (B) Matriz de similitud que muestra agrupación jerárquica de perfiles de expresión génica diferencial en el panel (A). La línea discontinua roja dentro del dendrograma indica el nivel de separación del grupo de matrices. (C) Comparación de 4531 DEG (Log2 FC; Padj.<0.05) of 13-week-old Clr-f−/− mice (group 0) and IgAN patients. Gene set enrichment from 4 DEG clusters: (I) upregulated in both Clr-f−/− mice and IgAN patients, (II) upregulated in Clr-f−/− mice and downregulated IgAN patients, (III) downregulated in Clr-f−/− mice, and upregulated IgAN patients, and (IV) downregulated in both Clr-f−/− mice and IgAN patients. Heat maps were constructed using Morpheus (https://sofware.broadinstitute. org/morpheus).

La deficiencia de Clr-f produce autoinmunidad y patogénesis independientes de T y B. Para aclarar la contribución inmune a la patología renal de los ratones Clr-f-/-, examinamos ratones Clr-f-/- que también tenían deficiencia de células T y B, utilizando la cepa de ratón deficiente en Rag1-. (Rag1-/-Clr-f-/-). Como los ratones Rag1-/-Clr-f-/- carecen de anticuerpos, podríamos evaluar la patogénesis asociada a Clr-f en ausencia de depósito de inmunoglobulinas. El análisis de los riñones Rag1-/-Clr-f-/- reveló lesiones glomerulares indicativas de glomerulopatía proliferativa leve y áreas de fibrosis glomerular (Fig. 7A). La puntuación de patología glomerular mostró un número significativamente mayor de glomérulos con lesiones en Rag1-/-Clr-f-/- en comparación con los ratones Rag1-/- (Fig. 7B). La puntuación de las secciones de riñón Rag1-/-Clr-f-/- identificó aumentos en la proliferación endocapilar, medias lunas, glomeruloesclerosis o esclerosis focal y segmentaria, y fibrosis intersticial y atrofia tubular, con un aumento significativo en la presencia de celularidad mesangial (Fig. 7C). .

Para evaluar la contribución de las células T y B a la acumulación de lípidos observada en ratones Clr-f-/-, medimos el peso corporal total y el peso adiposo abdominal en Rag1-/-Clr-f-/- en relación con los ratones Rag1-/-. El peso corporal de Rag1-/-Clr-f-/- fue significativamente menor que el de los controles Rag1-/- (Fig. 7D), mientras que el peso de los lípidos abdominales aumentó significativamente (Fig. 7E), aunque en menor medida que el observado en Ratones Clr-f-/- en comparación con ratones WT (174 mg de grasa ganada versus 274 mg en promedio).

Finalmente, para investigar los contribuyentes inmunitarios a estos defectos renales, examinamos los riñones Rag1-/-Clr-f-/- para detectar la presencia de IL-12 e IFN y células inmunes infiltrantes renales. El análisis IF de los riñones Rag1-/-Clr-f-/- reveló una mayor presencia de IL-12 e IFN (Fig. 7F,G). También observamos una extensa acumulación periglomerular de células CD45+ en los riñones Rag1-/-Clr-f-/- (Fig. 7H), que consistía en CD11c+, F4/80+ y Nkp46+ celdas. Estos hallazgos sugieren que los mecanismos independientes de las células T y B son los principales mediadores de la patología renal en ratones con deficiencia de Clr-f.

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