Celomocitos de la lombriz de tierra Oligochaeta Lumbricus Terrestris (Linnaeus, 1758) como clave evolutiva de defensa: un estudio morfológico

Abstracto

Los metazoos tienen varios mecanismos de defensa interna para su supervivencia. El sistema de defensa interno evolucionó junto con los organismos. Annelidae tiene celomocitos circulantes que realizan funciones comparables a las células inmunitarias fagocíticas de los vertebrados. Varios estudios han demostrado que estas células están involucradas en procesos de fagocitosis, opsonización y reconocimiento de patógenos. Al igual que los macrófagos de vertebrados, estas células circulantes que impregnan los órganos de la cavidad celómica capturan o encapsulan patógenos, especies reactivas de oxígeno (ROS) y óxido nítrico (NO). Además, producen una gama de proteínas bioactivas involucradas en la respuesta inmune y realizan funciones de desintoxicación a través de su sistema lisosomal.

Los celomocitos también pueden participar en reacciones líticas contra células diana y la liberación de péptidos antimicrobianos. Nuestro estudio identifica inmunohistoquímicamente celomocitos de Lumbricus terrestris dispersos en la capa epidérmica y conectiva inferior, tanto en la capa longitudinal como en la muscular lisa, inmunorreactivos para TLR2, CD14 y -Tubulina por primera vez. TLR2 y CD14 no están completamente colocados entre sí, lo que sugiere que estos celomocitos pueden pertenecer a dos familias distintas. La expresión de estas moléculas inmunes en los celomocitos de Annelidae confirma su papel crucial en el sistema de defensa interno de estos protostomas de Oligochaeta, lo que sugiere una conservación filogenética de estos receptores. Estos datos podrían proporcionar más información sobre la comprensión del sistema de defensa interno de Annelida y los complejos mecanismos del sistema inmunitario en los vertebrados.

Los celomocitos están estrechamente relacionados con la inmunidad. Los celomocitos son células relacionadas con el sistema inmunitario. Pueden secretar una variedad de factores inmunológicos, como citocinas, interleucinas, antígenos y anticuerpos, para regular y mejorar la capacidad inmunológica del cuerpo.

Los celomocitos desempeñan una variedad de funciones inmunitarias, incluida la regulación de las respuestas inmunitarias celulares como células presentadoras de antígenos, la eliminación directa de patógenos y células anormales y la participación en la regulación de la inflamación y las respuestas inmunitarias. Además, algunos estudios han demostrado que los celomocitos también pueden mejorar la inmunidad frente a patógenos potenciales mediante la acumulación de células de memoria inmunitarias, lo que mejora la inmunidad del organismo.

Por lo tanto, mantener la función normal y la cantidad de celomocitos es crucial para la inmunidad del cuerpo. Al mismo tiempo, al regular y mejorar la función inmunológica de los celomocitos, también se puede mejorar la inmunidad del cuerpo para prevenir y tratar mejor diversas enfermedades. A partir de esto, podemos ver la importancia de la inmunidad. Cistanche puede mejorar la inmunidad. Cistanche es rico en una variedad de sustancias antioxidantes, como vitamina C, vitamina C, carotenoides, etc. Estos ingredientes pueden eliminar los radicales libres, reducir el estrés oxidativo y mejorar la inmunidad. resistencia del sistema.

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Palabras clave

Anélido, Celomocitos, Lombriz, Evolución, Inmunidad.

Introducción

Los mecanismos de defensa internos permiten la supervivencia del huésped en el metazoo. Estos mecanismos se vuelven cada vez más complejos a medida que los organismos evolucionan. A diferencia de los deuterostomas de vertebrados, los protostomas carecen de inmunidad adaptativa y basan su defensa en la inmunidad innata [56]. La primera línea de defensa contra bacterias y microorganismos en vertebrados es la rápida activación de células y moléculas inmunitarias innatas. Recientemente, los invertebrados se han convertido en candidatos para el análisis de inmunidad innata para revelar estrategias y complejidades de la respuesta inmune adaptativa de vertebrados. Los invertebrados han desarrollado una variedad de mecanismos inmunológicos activos que incluyen la producción de péptidos antimicrobianos, coagulación, fagocitosis y reacciones de encapsulación [20, 24]. Estos mecanismos dependen de los "receptores de reconocimiento de patrones" (PRR), moléculas inmunitarias innatas que pueden discriminar los componentes de membrana "propios" de los "no propios".

El reconocimiento de "patrones moleculares asociados a patógenos" (PAMP) regula el inicio de vías de señalización esenciales, hasta la activación de genes que codifican mediadores inflamatorios, péptidos antimicrobianos y reguladores de la fagocitosis [32]. Los anélidos oligoquetos (lombrices de tierra) se han convertido en un modelo para la inmunología comparativa y, al igual que las sanguijuelas, se utilizan para el biomonitoreo ambiental terrestre y acuático (B.-T. [48, 52, 53, 72]. , y mecanismos de defensa efectivos contra microorganismos ambientales peligrosos.La primera línea de defensa mecánico-biológica, que separa el cuerpo de los anélidos del ambiente externo es el tegumento, compuesto por una epidermis y capas musculares.Tiene una cutícula con una fina capa de mucopolisacáridos y proteínas, que actúan como barrera antimicrobiana [20].

En las lombrices de tierra, los sistemas inmunes celular y humoral trabajan juntos por primera vez en la evolución de los metazoos. Se cree que el líquido de la cavidad celómica es responsable de las actividades inmunológicas humorales. La cavidad celómica de las lombrices de tierra está llena de fluidos que contienen celomocitos libres y errantes y sus agregados pigmentados, llamados cuerpos marrones, producto de la encapsulación de bacterias invasoras y residuos de partículas. El fluido celómico de las lombrices de tierra lleva a cabo varios procesos biológicos, incluidos hemolíticos, proteolíticos, citotóxicos y antibacterianos [19, 24, 29]. El celoma se comunica directamente con el ambiente externo a través de los poros dorsales y los túbulos nefridiales acoplados, que excretan los metabolitos. Estos poros también intervienen en la eliminación de bacterias y celomocitos agotados. En condiciones de estrés, el fluido celómico y las células suspendidas pueden ser rápidamente expulsados ​​por el aumento de la presión intracolónica [24].

Los celomocitos de las lombrices de tierra son un elemento esencial de la inmunidad celular innata. Estas células se parecen a los leucocitos de vertebrados tanto en morfología como en función [33]. Los celomocitos realizan una amplia gama de tareas, incluida la citotoxicidad celular, la encapsulación y la fagocitosis. Se pueden dividir en dos subpoblaciones principales: melanocitos y amebocitos (hialinos y granulares) [33]. Los amebocitos hialinos y granulares están involucrados en la fagocitosis y la encapsulación, expresando varios PRR [23, 60]. Estas células circulantes que migran a los tejidos desde la cavidad celómica son muy similares a los macrófagos de vertebrados, que engullen o encapsulan patógenos, especies reactivas de oxígeno (ROS) y óxido nítrico (NO) [39]. Los eleocitos producen una amplia gama de proteínas bioactivas que participan en la respuesta inmune humoral y también desintoxican el cuerpo a través de su sistema lisosomal [24]. Los celomocitos pueden participar en reacciones líticas contra células diana y en la liberación de péptidos antimicrobianos. Entre los mecanismos inmunes, los experimentos de trasplante han demostrado la existencia de autorreconocimiento en las lombrices de tierra [28].

Los celomocitos anélidos forman rápidamente mecanismos inmunitarios contra bacterias, parásitos y levaduras a través de reacciones celulares [59]. Esta respuesta rápida está mediada por moléculas antibacterianas solubles, como la lisozima, la lisenina y la lubricina [22, 42, 68]. Se descubrieron moléculas inmunológicas altamente conservadas, como indicadores de la superficie celular, en celomocitos utilizando análisis citométricos. En particular, los celomocitos reaccionaron con anticuerpos específicos de mamíferos, mostrando una positividad superficial a los anticuerpos anti-CD11a, CD45RA, CD45RO, CDw49b, CD54, b2-M y Ty-1 [30, 34].

Nuestro estudio tiene como objetivo evaluar inmunohistoquímicamente la presencia de TLR2, CD14 y -tubulina por primera vez en celomocitos de Lumbricus terrestris (Linnaeus, 1758), una lombriz de tierra cilíndrica, multisegmentada y ancha perteneciente a la familia Lumbricidae (Annelida, Oligochaeta) , hermafrodita, de 8 a 10 cm de largo [55]. Mejorar el conocimiento del sistema de defensa interno de los invertebrados puede ayudar a comprender la inmunidad más sofisticada de los vertebrados y, en consecuencia, la evolución de la respuesta inmune [63].

Materiales y métodos

Preparación de muestras y tejidos

Las muestras de Lombricus terrestris proceden de nuestro laboratorio histotheca. Previamente, se tomaron a campo abierto no contaminado y se aclimataron durante dos semanas en suelo fresco, según lo informado por Licata et al. [51], y luego se prepararon utilizando los métodos estándar para microscopía óptica. Las muestras se sumergieron en inmuno (paraformaldehído al 4 por ciento) (05-W01030705, BioOptica Milano SpA, Milán, Italia) durante dos horas. Luego, se trataron con una escala deshidratante de etanol (de 30 a 100 por ciento de etanol), y luego se prepararon para su inclusión en parafina usando xileno.

Una vez incluidos, se colocaron en cada portaobjetos dos secciones delgadas de 3-5 μm cortadas con un micrótomo rotatorio.

Histología

Se usaron tinciones morfológicas e histoquímicas para procesar los portaobjetos [4, 6]. Luego, los cortes se rehidrataron utilizando soluciones progresivas de alcohol (de 100 a 30 por ciento de etanol), a agua destilada después de ser desparafinados en xileno [17], G. [75], posteriormente, se tiñeron con tricrómico de Mallory y AB/PAS [3] . Después de la tinción, los portaobjetos se montaron con Eukitt (BioOptica Milano SpA, Milán, Italia, Europa). Los datos sobre las cepas utilizadas en este estudio se incluyen en la Tabla 1.

inmunofluorescencia

Las secciones desparafinadas se trataron con una solución al 5 por ciento de borohidruro de sodio para eliminar la autofluorescencia, luego se utilizó una solución al 2,5 por ciento de albúmina de suero bovino (BSA) y luego las rebanadas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios contra TLR2, CD14 y tubulina [40]. ]. Después de eso, se realizó la incubación de anticuerpos secundarios. Para evitar la decoloración, los cortes se montaron utilizando el medio de montaje acuoso Fluoromount™ (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania, Europa). Los experimentos se realizaron sin los anticuerpos primarios como control negativo (datos no mostrados). Para confirmar que los anticuerpos primarios eran inmunopositivos, se emplearon tejidos de piel de rata como control positivo (datos no mostrados) [5, 47, 74].

Las secciones se analizaron bajo un microscopio de barrido láser confocal Zeiss LSM DUO con un módulo META (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Alemania, Europa) con láseres de helio-neón (543 nm) y argón (458 nm) de diferentes longitudes de onda [7] . Para mejorar las imágenes se utilizó Zen 2011 (software LSM 700 Zeiss, Oberkochen, Alemania, Europa). Usando Adobe Photoshop CC versión 2019 (Adobe Systems, San José, CA, EE. UU.), las imágenes digitales se fusionaron en una figura compuesta. A continuación, se evaluaron las curvas de intensidad de fluorescencia utilizando la función "Perfil de visualización" de Zen 2011 [58]. Los detalles sobre los anticuerpos se resumen en la Tabla 2.

Análisis cuantitativo

Los datos fueron recolectados para el análisis cuantitativo a través del examen de diez secciones y veinte campos por muestra. La positividad celular y el número se evaluaron utilizando el software ImageJ 1.53e. El número de celomocitos positivos para TLR2, CD14 y tubulina se contó utilizando SigmaPlot versión 14.0 (Systat Software, San Jose, CA, EE. UU.). Los datos normalmente distribuidos se analizaron usando ANOVA unidireccional y una prueba t de Student. Se informan los valores medios y las desviaciones estándar (DE) del número de celomocitos inmunorreactivos: ** p Menor o igual a 0.01, * p Menor o igual a 0,05.

Resultados

La lombriz de tierra Lumbricus terrestris tiene un epitelio monoestratificado y una cutícula fibrosa de cobertura que constituye la epidermis. Los tejidos conectivo y muscular que componen la mayor parte de la pared del cuerpo se encuentran debajo de la epidermis. El epitelio epidérmico mantiene la cutícula colágena diferenciada del resto del organismo y es responsable de la producción de este colágeno cuticular. La cutícula, la epidermis, el músculo longitudinal y el músculo circular son todos visibles por inspección histológica de la sección transversal de la pared del cuerpo de las lombrices de tierra. La epidermis está morfológicamente bien definida; es una sola capa epitelial o pseudoestratificada; consiste en células de sostén, basales, glandulares y sensoriales (Fig. 1). El análisis de inmunofluorescencia, en la observación del microscopio confocal, muestra celomocitos positivos para TLR2 (Figs. 2, 3), CD14 (Fig. 2) y -Tubulin (Fig. 3), dispersos en la capa epidérmica y conectiva debajo, ambos en la longitudinal y en la capa de músculo liso. TLR2 y CD14 no están completamente colocados entre sí, lo que sugiere que estos celomocitos pueden pertenecer a dos familias distintas (Fig. 2). Además, las células glandulares mucosas eran tubulina positivas en la epidermis (Fig. 3). Al analizar la función de "perfil de visualización" del microscopio confocal, confirmamos los picos de fluorescencia de la colocalización entre los anticuerpos probados.

El análisis cuantitativo reveló un número similar de celomocitos positivos para los anticuerpos individuales analizados, como se muestra en la Tabla 3.

Discusión

Las respuestas del huésped contra los patógenos invasores son mecanismos fisiológicos que pertenecen a todos los organismos vivos. Desde la aparición de las primeras células eucariotas, varios procesos de defensa han evolucionado para garantizar la integridad celular, la homeostasis y la supervivencia del huésped [25]. Los invertebrados han desarrollado una variedad de respuestas de defensa que reconocen y eliminan con eficacia materiales extraños, microbios o parásitos. Mientras que los cordados tienen inmunidad adaptativa, los lofotrocozoos como las lombrices de tierra dependen principalmente de las células inmunitarias innatas, como los fagocitos (amebocitos, celomocitos), que involucran PRR conservados filogenéticamente para mediar en la respuesta inmunitaria [41]. Los receptores carroñeros, los TLR y los receptores tipo Nod (NLR) son representantes destacados en los invertebrados. Después de la unión del receptor al ligando, la transducción de señales inicia una compleja cascada de reacciones celulares que conducen a la producción de una o más moléculas efectoras involucradas en la respuesta inmune [61]. La proteína citolítica celómica (CCF), la proteína de unión a lipopolisacáridos (EaLBI/BPI) y el receptor Toll-like EaTLR son los tres tipos de PRR que se han identificado en las lombrices de tierra hasta ahora [65, 66]. CCF ha sido identificado y caracterizado como una molécula inmune del fluido celómico y celomocitos de Eisenia foetida (Savigny, 1826). El CCF, al unirse a los antígenos microbianos, puede desencadenar la cascada de profenoloxidasa, un importante mecanismo inmunitario de los invertebrados que también ejerce propiedades opsonizantes, promoviendo así la fagocitosis [18, 35].

Los TLR son receptores de reconocimiento de membrana conservados evolutivamente [9, 15] que reconocen antígenos extraños mediante PAMP [2] y contribuyen a la modulación de la respuesta inmunitaria [8, 9, 11, 36]. Bodo et al. [24] demostraron la presencia de TLR en celomocitos de un oligoqueto anélido Eisenia andrei (Bouché, 1972) [24]. Skanta et al. (2013) aislaron TLR de lombrices de tierra (EaTLR) de E. andrei. La alta diversidad intraespecies de este receptor indica la presencia de varios genes TLR dentro del genoma de E. andrei. Un TLR del poliqueto anélido Capitella teleta (Blake, Grassle y Eckelbarger, 2009), EaTLR y los TLR de moluscos y equinodermos comparten muchas similitudes, según la investigación filogenética [66]. Prochazkova et al. destacó EaTLR y el grupo de cisteínas múltiples (MCC) EaTLR expresados ​​en los tejidos corporales de las lombrices de tierra. El primero es particularmente abundante en el sistema digestivo, mientras que el segundo puede actuar en el desarrollo embrionario y la respuesta frente a parásitos [61]. Además, su presencia en los celomocitos puede sobreexpresarse debido a la acumulación bacteriana [66]. Los celomocitos de Lumbricus terrestris fueron capaces de reconocer monocitos in vitro como no propios, lo que confirma su capacidad de reconocimiento inmunitario [62]. Los estudios de transcriptómica confirman la presencia de 18 TLR en el poliqueto anélido Arenicola marina (Linnaeus, 1758) [67].

Hemos demostrado previamente la presencia de TLR2 en varios vertebrados [4, 11, 12, 16, 46, 54] y urocordados [14, 45].

A raíz de estos datos, nuestro estudio caracterizó inmunohistoquímicamente TLR2 en celomocitos de Lumbricus terrestris por primera vez. Colocalizamos TLR2/CD14 y TLR2/-Tubulin, confirmando dos tipos de células de celomocitos, según lo informado por Engelmann [33]. No todos los celomocitos se colocalizaron para los anticuerpos probados, lo que sugiere una probable diversificación funcional y estructural de estas células. Aunque no hay evidencia experimental, la presencia de celomocitos colocalizados TLR2/CD14 puede sugerir que estas células podrían ser amebocitos involucrados en la fagocitosis, mientras que los celomocitos que expresan solo TLR pueden ser células melanocitos involucradas en la respuesta inmune pero sin realizar funciones fagocíticas [1, 37]. , 38], SJ [49, 50], p., [57, 71]. A pesar de que Bodó et al. lo que sugiere la ausencia de TLR en los melanocitos de E. andrei utilizando qPCR [23], se detectan melanocitos TLR2-positivos en L. terrestris, lo que sugiere una diferencia entre las especies de lombrices de tierra, como ya se planteó como hipótesis sobre una base genómica nuclear [64].

Un estudio de Eguielor et al. [31] en la sanguijuela Glossiphonia complanata (Linnaeus, 1758) identificaron morfológica e histoquímicamente tres tipos de células principales (células similares a macrófagos, células similares a NK, granulocitos tipo I y II) utilizando diferentes marcadores antihumanos en ratones específicos para macrófagos CD14 y CD61 [44] y células NK CD56 y CD57 [43]. Esta reactividad cruzada con los anticuerpos generados contra los antígenos CD de mamíferos concuerda con los datos de la literatura sobre correlaciones filogenéticas entre anélidos y vertebrados [21, 30] y podría ser un ejemplo de la conservación evolutiva de estas moléculas inmunes.

Se han localizado anticuerpos de ratón anti-CD24 humano, anti-factor de necrosis tumoral (TNF), anti-CD45RA y anti-CD45RO en las superficies de los celomocitos de la lombriz de tierra Eisenia foetida [30, 34], lo que sugiere que estas moléculas son altamente conservado durante la filogénesis. Estos estudios son consistentes con investigaciones previas que demuestran que los antígenos de superficie de los celomocitos tienen reactividad cruzada con anticuerpos contra CD14, CD11b y CD11c producidos en mamíferos Temiste petricola (Amor, 1964), caracterizando fagocitos positivos a anticuerpos anti-CD14, CD11b y CD11c [21 ]. Con estos datos, nuestros resultados mostraron células fagocíticas inmunoreactivas a CD14 en Lumbricus terrestris.

Además, demostramos la inmunopositividad de los celomocitos a -tubulina, colocalizados con TLR2, mostrando un vínculo entre el citoesqueleto, los microtúbulos y la respuesta inmune innata mediada por TLR2. La colocalización de TLR2 y -Tubulin confirma la participación de tubulina en el transporte de TLR en la superficie de la membrana. Un estudio de Heli Uronen-Hansson et al. [70] mostró una amplia expresión tubulovesicular de TLR2 y TLR4 en monocitos internos y externos, así como en células dendríticas. Dado que estos receptores se colocalizan con -tubulina y se unen directamente al complejo de Golgi, los microtúbulos pueden servir como conducto para la transferencia de vesículas TLR [70]. La tubulina también está presente en la epidermis, ayudando a mantener su integridad [27], e interviniendo en la cicatrización de heridas [73], asistiendo así al sistema inmunitario innato, como también informan los estudios sobre Nematoda Caenorhabditis elegans (Maupass, 1900) [27, 69].

La colocalización, confirmada por la función "display profile" del microscopio confocal, corrobora los resultados obtenidos, destacando el pico de fluorescencia correspondiente a la unión de los anticuerpos a los correspondientes antígenos.

En conclusión, nuestro estudio identifica por microscopía confocal celomocitos inmunorreactivos a TLR2, CD14 y -tubulina por primera vez en el anélido Oligochaeta Lumbricus terrestris. Estos datos no solo validan la importante conservación evolutiva de estas moléculas, sino que también profundizan en el conocimiento del sistema interno de defensa de los invertebrados, en particular de los anélidos, y pueden proporcionar indicaciones útiles para futuros estudios, mejorando el estudio de los complejos mecanismos inmunes innatos de vertebrados superiores.

Declaración de la junta de revisión institucional

Se renunció a la revisión y aprobación éticas para este estudio porque no se aplicaron procedimientos experimentales a las muestras.

Contribuciones de los autores

Conceptualización, Alessio Alesci; análisis formal, Alessio Alesci y Angelo Fumia; investigación, Alessio Alesci, Gioele Capillo, Angelo Fumia, Marco Albano, Emmanuele Messina, Nunziacarla Spanò, Simona Pergolizzi y Eugenia Rita Lauriano; curaduría de datos, Alessio Alesci, Gioele Capillo, Angelo Fumia, Marco Albano, Emmanuele Messina, Nunziacarla Spanò, Simona Pergolizzi y Eugenia Rita Lauriano.; redacción—preparación del borrador original, Alessio Alesci; redacción—revisión y edición, Alessio Alesci, Gioele Capillo, Nunziacarla Spanò, Simona Pergolizzi y Eugenia Rita Lauriano; visualización, Alessio Alesci y Angelo Fumia; supervisión, Eugenia Rita Lautiano. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos

Esta investigación no recibió financiación externa.

Disponibilidad de datos y materiales.

Los datos presentados en este estudio están disponibles en el artículo.

Declaraciones

Aprobación ética y consentimiento para participar

No aplica.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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