La pangenómica y la transcriptómica combinadas revelan procesos de virulencia centrales y redundantes en un patógeno vegetal fúngico en rápida evolución

Abstracto

Fondo

El estudio de la variación genómica en patógenos que evolucionan rápidamente permite potencialmente la identificación de genes que respaldan su "biología central", que están presentes, son funcionales y se expresan en todas las cepas o en una "biología flexible", que varía entre cepas. Los genes que apoyan la biología flexible pueden considerarse "accesorios", mientras que el conjunto de genes "central" probablemente sea importante para las características comunes de la biología de una especie patógena, incluida la virulencia en todos los genotipos del huésped. El hongo patógeno del trigo Zymoseptoria tritici representa una de las amenazas que evoluciona más rápidamente a la seguridad alimentaria mundial y fue el foco de este estudio.

Beneficios de cistanche para hombres: fortalece el sistema inmunológico.

Haga clic aquí para ver los productos Cistanche Enhance Immunity

【Pregunte por más】 Correo electrónico:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Resultados

Construimos un pangenoma de 18 aislados de campo europeos, 12 de los cuales también se sometieron a perfiles de transcripción de RNAseq durante la infección. Combinando estos datos, predijimos un conjunto de genes "central" que comprendía 9807 secuencias que estaban (1) presentes en todos los aislados, (2) carecían de polimorfismos inactivadores y (3) expresadas por todos los aislados. También se definió un gran genoma accesorio, que consta del 45% del total de genes. Clasificamos el polimorfismo genético y genómico a escala de genes cromosómicos e individuales. Las proteínas necesarias para funciones esenciales, incluida la virulencia, tenían una variabilidad de secuencia inferior a la media entre los genes centrales. Tanto el genoma central como el accesorio codificaban muchas proteínas efectoras candidatas pequeñas y secretadas que probablemente interactúan con la inmunidad de las plantas. La sobreexpresión transitoria en planta mediada por vectores virales de 88 candidatos no logró identificar ninguno que indujera la necrosis foliar característica de la enfermedad. Sin embargo, la complementación funcional de un mutante de deleción no patógeno que carece de cinco genes centrales demostró que se restableció la virulencia total mediante la reintroducción del gen único que exhibe el menor polimorfismo de secuencia y la mayor expresión.

Conclusiones

Estos datos respaldan el uso combinado de pangenómica y transcriptómica para definir genes que representan las debilidades centrales, y potencialmente explotables, de los patógenos que evolucionan rápidamente.

Palabras clave

Virus del mosaico de la cola de zorra, Septoria tritici, Efector necrotrófico, Genes esenciales, Cromosomas accesorios, Dothideomycetes,Inestabilidad cromosómica, Mycosphaerella spp.

Fondo

El control sostenible de las enfermedades infecciosas que afectan a animales y plantas se ve desafiado por la evolución de los microorganismos causales [1, 2]. Las enfermedades más difíciles de controlar son aquellas causadas por especies que evolucionan más rápidamente, que pueden responder rápidamente a presiones selectivas, incluida la inmunidad natural del huésped, condiciones ambientales adversas y/o medicamentos antiinfecciosos [1, 3]. El potencial de que los patógenos microbianos evolucionen rápidamente está determinado por varias características, entre ellas; (1) ciclos vitales rápidos y (2) mecanismos que promueven la reproducción sexual [4]. Esto último puede dar lugar a grandes niveles de variación genética permanente dentro de las poblaciones de patógenos que pueden mantenerse y amplificarse frente a presiones selectivas externas. Si bien es probable que determinados genes exhiban una variación natural en la secuencia genética, impulsando su evolución, otros no pueden perderse (o inactivarse por mutación) sin afectar la aptitud del patógeno. Para los patógenos de plantas eucariotas y procarióticas, esta diferencia en los niveles de polimorfismos entre genes ha llevado a la realización de "genomas de dos velocidades" [5], que comprenden algunos componentes que evolucionan rápidamente y se cree que responden a impulsores externos (rango de huéspedes y inmunidad, etc.), mientras que el conjunto que evoluciona más lentamente contiene genes con funciones básicas de limpieza y otras funciones esenciales. Las partes accesorias y centrales de los genomas de los patógenos se pueden ensamblar en un "pangenoma" que debería representar casi el conjunto completo de genes presentes en una especie [6]. El tamaño de las porciones centrales y accesorias de los pangenomas varía dentro de las especies de bacterias, hongos y oomicetos [7-13] y puede dar una indicación del potencial de las poblaciones microbianas para evolucionar rápidamente hacia presiones selectivas. Es concebible que cuanto más grande sea el pangenoma accesorio en relación con el núcleo, más capaces serán estas poblaciones de evolucionar rápidamente. El hongo ascomiceto patógeno del trigo, Zymoseptoria tritici, es el agente causal de la mancha por Septoria tritici (STB), una enfermedad de importancia mundial que amenaza la seguridad alimentaria [14]. El patógeno también se ha considerado durante mucho tiempo como un sistema modelo para estudios sobre biología y evolución de poblaciones [15-18]. Esto se debe a que Z. tritici tiene una alta tasa de recombinación sexual que sustenta grandes cantidades de diversidad genética permanente dentro de sus poblaciones y permite una rápida adaptación tanto a escala global como local [17, 19-24]. Como consecuencia, los principales genes del trigo que confieren resistencia a Z. tritici se superan rápidamente [25]. Además, la mayoría de los fungicidas comerciales más utilizados pierden su eficacia con el tiempo [3]. La combinación de estos dos factores plantea una amenaza a la producción mundial de trigo que debe abordarse con urgencia. Z. tritici también ha surgido recientemente como un nuevo modelo para la genómica de patógenos con muchas referencias genómicas de alta calidad ahora disponibles [26], además de pangenomas construidos a partir de una gran cantidad de genomas aislados individuales [27, 28]. Quizás una de las características más interesantes del genoma de Z. tritici es la presencia de 13 cromosomas centrales (1-13) que se encuentran en todos los aislados, pero luego hasta 8 cromosomas accesorios más pequeños (14-21) que muestran la presencia/ausencia y polimorfismo estructural entre aislamientos [26, 29]. Afortunadamente, uno de los aislados de referencia comunitarios, y el primero en ser completamente secuenciado, el aislado de campo holandés IPO323 recolectado en la década de 1980, porta 21 cromosomas, el mayor número observado hasta la fecha. Por lo tanto, IPO323 sirve como un excelente punto de referencia para estudiar la variación en otros aislados y como plataforma para construir pangenomas.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

El ciclo de infección asexual de Z. tritici es típico de muchos patógenos vegetales relacionados que afectan a muchos cultivos alimentarios [30]. Estos hongos, pertenecientes a la familia Mycosphaerellaceae del orden Dothideomycetes, típicamente invaden los tejidos de las plantas a través de los estomas [30, 31]. Sigue entonces un largo período de crecimiento asintomático entre las células vegetales, que dura al menos 8 días, y que termina bruscamente con la formación de lesiones foliares necróticas, situación que en el caso de Z. tritici parece producirse como consecuencia de una "hiperactivación" de las células vegetales. inmunidad [32-34]. La muerte de las células vegetales se asocia posteriormente con la formación de nuevas estructuras de esporulación, picnidios, en las cavidades subestomáticas y la posterior extrusión y propagación de picnidiosporas recién formadas durante períodos de lluvias abundantes. Se ha demostrado que otros hongos Dothideomycetes provocan una hiperactivación de la inmunidad de las plantas mediante la secreción de "efectores" proteicos que se reconocen en plantas sensibles, lo que provoca la muerte celular y tisular (necrosis o muerte celular programada). Estos hongos necrotróficos se benefician de esta respuesta y las proteínas efectoras involucradas ahora se denominan efectores necrotróficos [35, 36]. Si bien existe cierta evidencia preliminar de que Z. tritici también podría desplegar efectores necrotróficos en el cambio al crecimiento sintomático [37], provocando lesiones foliares, esta hipótesis no se ha probado de manera sólida hasta la fecha. Las dos rutas mutuamente no excluyentes para proteger la futura producción de trigo del impacto de STB son (1) aumentar la resistencia natural de las plantas a las enfermedades y (2) identificar nuevos objetivos moleculares que podrían explotarse para el control de enfermedades. Idealmente, esto permitiría el control selectivo del patógeno y al mismo tiempo restringiría al mínimo otros impactos ambientales y ecológicos. La genómica de patógenos y, en particular, la pangenómica ofrecen el potencial de aumentar ambas estrategias. Mientras que las proteínas codificadas por la parte accesoria del pangenoma que evoluciona rápidamente pueden contener muchos genes que interactúan con la inmunidad de la planta (por ejemplo, efectores), el genoma central puede presentar objetivos que mutan con menor facilidad debido a que imparten penalizaciones negativas de aptitud (y virulencia). Por esta razón, los fungicidas agrícolas normalmente se dirigen a procesos centrales, que presumiblemente se consideran menos mutables. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, incluso estos objetivos pueden evolucionar hasta cierto punto para evadir la inhibición química, como se describe para muchas proteínas objetivo de fungicidas actuales [3, 14]. La mayoría de los fungicidas utilizados hasta la fecha se han dirigido a un conjunto bastante reducido de procesos moleculares (por ejemplo, biosíntesis de esteroles, respiración, etc.) [3]. Existen potencialmente muchos otros objetivos que podrían usarse para controlar selectivamente los patógenos fúngicos que deberían surgir de la combinación y el análisis de múltiples conjuntos de datos ómicos. El alto potencial de descubrimiento se ve enfatizado por el hecho de que normalmente hasta el 40% de todos los genes identificados en las secuencias del genoma de los hongos patógenos (y de los hongos en general) aún tienen una función desconocida. Aquellos que están presentes y quizás conservados en el genoma central de hongos patógenos pueden ser de particular relevancia.

Pangenomics of rapidly evolving pathogens could be used to identify core, potentially specific gene sets, which could be exploited in future disease control [11]. The premise is that genes which are not evolving, in an otherwise rapidly evolving species, are most likely to be essential for either life or important for key virulence processes of the pathogen. Pangenomes themselves have, to date, largely been defined by sequencing genomic DNA from multiple members of a species. Whilst this is a critical and indispensable step in ascertaining the full potential of a species' genomics, gene expression support is perhaps overlooked for refinement of core and accessory gene calls, particularly in relation to biological processes such as pathogenicity/virulence. For example, if a core gene, predicted through genomic DNA sequence analysis, is not expressed by a successful pathogenic strain/ isolate during infection, it might be more appropriately considered accessory. Pangenome analyses on fungi and yeasts have recently emerged and have highlighted some major differences in the size of core and accessory gene components. For example, one recent study which analyzed the animal pathogenic yeasts, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, the free-living yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the animal filamentous fungal pathogen Aspergillus fumigatus, predicted each to have >80% de genes anotados como núcleo [10]. Sin embargo, otros análisis sobre hongos flamentosos asociados a plantas han predicho componentes genéticos accesorios más grandes, incluido ~38% para los patógenos Claviceps purpurea [38] y ~44% en Pyrenophora tritici-repentis [39]. Estudios pangenómicos integrales anteriores sobre Z. tritici han utilizado poblaciones globales e históricas que involucran un gran número de aislados, que han sido secuenciados a escalas de genoma completo y fragmentado [27, 28]. Estos estudios identificaron un gran conjunto de genes accesorios (~40% de todos los genes) para esta especie. Además, esto se correlacionó con una presencia/ausencia extensa y polimorfismos estructurales cromosómicos, lo que también implica elementos dinámicos repetitivos (incluidos elementos transponibles). Un análisis más detallado también sugirió que muchos genes accesorios también se expresan menos (en promedio) que los genes centrales. Estos estudios representan el "estándar de oro" para la estructura del pangenoma de la especie Z. tritici y el más completo hasta la fecha para cualquier hongo filamentoso. Sin embargo, para esta y otras especies persiste la pregunta de hasta qué punto se podría utilizar la pangenómica para identificar genes y procesos de virulencia centrales. Y dentro de los conjuntos de genes centrales, ¿los niveles de polimorfismos en toda la población que afectan los cambios de aminoácidos, así como los niveles de expresión genética, traicionan la identidad de los genes clave de virulencia de los patógenos?

En este estudio, hemos combinado la secuenciación del genoma y enfoques transcriptómicos basados ​​en RNAseq para producir un pangenoma a partir de una colección europea reciente de aislados de Z. tritici. Nuestro principal objetivo fue probar si los genes presentes dentro del genoma central que codifican proteínas con bajas tasas de polimorfismo de aminoácidos (es decir, en secuencias codificantes) entre aislados, desempeñan funciones importantes, incluidas funciones importantes en los procesos de infección centrales del trigo. De acuerdo con estudios anteriores [27, 28], demostramos que Z. tritici tiene un genoma accesorio extremadamente grande (~45% de todos los genes) que respalda su estado de rápida evolución. Además, proporcionamos datos biológicos que respaldan claramente la utilidad del uso combinado de ambos métodos ómicos para identificar nuevos genes de virulencia centrales. Por el contrario, las pruebas de sobreexpresión de proteínas funcionales mediadas por virus de alto rendimiento no lograron identificar ningún efector necrotrófico candidato responsable de provocar lesiones patológicas en las hojas de trigo, ya sea del pangenoma central o accesorio.

planta cistanche que aumenta el sistema inmunológico

Resultados

Las pruebas de virulencia en una colección europea de Z. tritici identifican cepas igualmente agresivas de lugares geográficamente no vinculados

Probamos la virulencia de 43 aislados de Z. tritici en 21 cultivares europeos de trigo harinero ampliamente susceptibles para obtener un total de 2709 puntos de datos (incluidas tres repeticiones). La información aislada (código y país de origen) se presenta en el archivo adicional 1: Tabla S1. Cada interacción se evaluó cuantitativamente para los siguientes parámetros: (1) la duración del período de incubación, (2) el tiempo necesario para alcanzar la necrosis completa (cuando ocurrió) y (3) niveles de esporulación asexual (Fig. 1A). Con base en la puntuación de la enfermedad tanto computacional como visual (consulte Métodos y archivo adicional 2: Fig. S1), todos los aislados se agruparon según sus perfiles de virulencia en el panel de cultivares probados (Fig. 1B). El aislado de control positivo IPO323, que sirve como referencia mundial [26] con genoma completamente secuenciado, fue menos agresivo que la mayoría de los aislados probados contra casi todos los cultivares. Este aislado se recolectó en aproximadamente 1984 y se ha mantenido almacenado desde entonces, con repasos ocasionales a través de hojas de trigo; por lo tanto, actualmente no está claro si esta observación podría (al menos en parte) haber surgido del almacenamiento de muestras a lo largo del tiempo. Identificamos siete aislados que no pudieron producir síntomas de enfermedad en ninguno de los cultivares de trigo (Fig. 1B). Como todos estos aislados se originaron en España o Italia, donde se cultiva con mayor frecuencia el trigo tetraploide (durum/pasta) (Triticum durum L.), es probable que estos aislados fueran específicos del trigo duro [40, 41]. Significativamente, los aislamientos con perfiles de virulencia similares no se agruparon en su ubicación de recolección, y los aislamientos que se originaron desde el este de Eslovaquia hasta el oeste de Irlanda se agruparon (Fig. 1B). Esta observación concuerda bien con los altos niveles de variación genética que existen entre los aislados y con estudios previos que han demostrado que esto es tan alto en la escala de una sola lesión de hoja de trigo como en todos los continentes [42]. Muchos de los aislados más agresivos con distintos perfiles de virulencia se seleccionaron posteriormente para la secuenciación genómica (resaltada con "#" en la Fig. 1B) y el análisis de RNAseq (resaltado con "+" en la Fig. 1B).

Fig. 1 Evaluaciones de virulencia de la colección de aislados europeos frente a una variedad de cultivares de trigo hexaploide (pan). Un curso de tiempo típico de progresión de la enfermedad que ilustra los parámetros evaluados en la pantalla, incluido el tiempo necesario para que aparezcan los primeros síntomas visibles y para que aparezca la necrosis foliar completa en el área inoculada. La figura muestra la infección del cultivar de trigo Riband por el aislado IPO323 de Z. tritici. B Perfil de virulencia de los aislados vs el panel de cultivares basado en niveles de necrosis y clorosis foliar. Las mediciones se tomaron mediante evaluaciones visuales y utilizando el software de análisis de imágenes LemnaTec y LemnaGrid con resultados finales comparables. Los aislados se clasificaron y agruparon según los datos de virulencia. Los aislados de Z. tritici resaltados con # fueron secuenciados del genoma para construir un pangenoma. Los aislados resaltados por + también se analizaron mediante transcriptómica de RNAseq. Se determinó que el cultivar de trigo Panorama (resaltado por X) era igual y completamente susceptible a la mayoría de los aislados y se seleccionó como el genotipo huésped para la infección foliar RNAseq. Tenga en cuenta que los datos de baja virulencia para el grupo externo de siete aislados contra todos los cultivares probablemente se deban a que estos aislados se adaptaron para causar enfermedades en el trigo tetraploide (durum o pasta). Todos los datos son representativos de tres hojas infectadas analizadas/con las que se interactuó en dos experimentos biológicos replicados (6 hojas en total). C Análisis SplitsTree de la filogenia molecular de aislados seleccionados para secuenciación genómica. El país de origen de los aislamientos se muestra en la abreviatura (Pl=Polonia; GB=Gran Bretaña; Be=Bélgica; Cz=República Checa; Ge {{8 }} Alemania; Sw=Suecia; Fr=Francia; Sl=Eslovaquia; Ir=Irlanda). El aislado de referencia, IPO323 recolectado ~1984 en los Países Bajos (Ne) también está representado

La secuencia del genoma y el análisis filogenético de diecisiete aislamientos europeos revelan altos niveles de diversidad genética

We used Illumina HiSeq 250 bp paired-end read technology to assemble the gene space of seventeen new isolates (indicated by # in Fig. 1B). BUSCO analysis (core dataset Pezizomycotina) was then performed to assess the completeness of each genome assembly (Table 1). Scores >El 97% en todos los casos indicó un buen ensamblaje del espacio genético (regiones codificantes) para todos los aislados. Unos pocos genes BUSCO seleccionados faltaban en todos los ensamblajes, lo que sugiere que Z. tritici puede no tener ortólogos de estos genes. Para determinar la cantidad de variación genética que afecta a las regiones codificantes previstas, luego realizamos un análisis SNPEf para cada cepa contra un pangenoma construido sobre el genoma completo del aislado de referencia IPO323 (Tabla 2). Este análisis demostró que cada nueva cepa tenía más de 160,000 SNP contra el pangenoma derivado. Entre estos había más de 65, 000 que causaron una pérdida potencial de la función de la proteína (efecto alto, cambio de marco, inicio perdido, codones de parada prematuros) o invocaron un cambio de aminoácido en las proteínas predichas (moderado). Estos datos demostraron la diversidad genética existente entre los aislados de Z. tritici.

Se realizó un análisis de árbol de divisiones en las 17 cepas recién secuenciadas y en IPO323 para determinar si los aislados con patrones de infección de cultivares similares tenían alguna relación filogenética y si esto estaba asociado con el país de origen. La filogenia se determinó mediante una concatenación de seis secuencias codificantes y no codificantes (ver Métodos y archivo adicional 3: Datos S1). El árbol (Fig. 1C) ilustra una vez más que no hubo un vínculo claro entre los perfiles de virulencia y la ubicación de muestreo para los aislados secuenciados, con perfiles de virulencia estrechamente relacionados (en comparación con la Fig. 1B) observados para aislados recolectados de diferentes países europeos que, sin embargo, fueron estrechamente relacionados filogenéticamente.

La construcción y el análisis del pangenoma predicen 9807 genes "centrales" y 8083 "accesorios"

Además de las secuencias del genoma, seleccionamos 12 aislados para el perfil de transcripción basado en RNAseq (indicado por + en la Fig. 1B). Cada aislado se perfiló por triplicado durante el crecimiento axénico en caldo YPD y también en dos etapas independientes de infección foliar; 6 días después de la inoculación (dpi) que representan la fase media sin síntomas y 9 dpi, en la fase de transición del desarrollo temprano de los síntomas. Para los ensayos de infección se utilizó el cultivar de trigo Panorama, universalmente susceptible, y todos los aislados pudieron infectar completamente con una cinética indistinguible. Utilizando estos datos del transcriptoma combinados con los nuevos ensamblajes del genoma y la secuencia de referencia original de IPO323 como armazón, determinamos un pangenoma para los aislados europeos que también incorpora secuencias presentes en otros aislados que no se detectaron en IPO323. Los pasos en la construcción del pangenoma y nuestros criterios para categorizar los genes como "núcleo" o "accesorio" se muestran en la Fig. 2. Es importante destacar que el polimorfismo de secuencia inactivante (efecto alto, pérdida de función-LoF) y la presencia y ausencia, consideraciones También fueron respaldados por evidencia de expresión genética. Por lo tanto, un gen debe estar presente en una forma funcional y expresado por todos los aislados, para ser asignado a la categoría "central". Nuestro enfoque general (Fig. 2) definió un pangenoma total de 17.890 genes, incluidos 2017, que no estaban presentes en IPO323. Los pasos de filtrado posteriores clasificaron a 9807 como residentes en el genoma central, con solo un número ligeramente menor, 8083, en el conjunto de accesorios. Este último representa aproximadamente el 45% del pangenoma total, un ligero aumento con respecto a lo descrito anteriormente [28]. Si bien estos números generalmente concuerdan bien, las estimaciones de genes accesorios son más subjetivas al sesgo debido a los métodos utilizados (Panseq, etc.), y no podemos asumir que análisis futuros adicionales no reduzcan el número de genes accesorios utilizando, por ejemplo, métodos basados ​​en ortología. enfoques. Todos los pangenes se analizaron en busca de características múltiples (predicciones de secreción, asociación de membrana, localización y contenido de cisteína) y funciones predichas (anotaciones BLAST, GO e Interpro). Se proporciona una tabla que proporciona toda la información disponible sobre todos los genes (archivo adicional 4: Tabla S2). La tabla también muestra los niveles medios relativos de expresión génica derivada de RNAseq determinados para todos los genes de los 12 aislados en las tres condiciones analizadas. En conjunto, en comparación con los estudios pangenómicos previos sobre este organismo [27, 28], está claro que Z. tritici tiene uno de los mayores números de componentes genéticos accesorios de hongos estudiados hasta la fecha, lo que probablemente refleja su rápida evolución. naturaleza.

Tabla 1 Análisis BUSCO sobre nuevos genomas.

Tabla 2 Resumen de los impactos del efecto SNP para cada nuevo genoma versus los modelos genéticos de referencia IPO323

Fig. 2 Resumen de los pasos utilizados para generar las llamadas y los números de los genes "centrales" y "accesorios" para el pangenoma europeo de Z. tritici recién construido. Los números representan la cantidad de genes identificados en cada etapa del proceso.

Características estructurales de variación en el pangenoma europeo de Z. tritici.

El objetivo de este estudio fue probar la hipótesis de que la pangenómica podría aprovecharse para identificar nuevos genes importantes, ya sean esenciales para la vida o para la virulencia en organismos patógenos. Nuestra hipótesis es que estos serían genes presentes, funcionales y expresados ​​por cada cepa del patógeno. Además, especulamos que estos genes tendrían niveles más bajos de mutaciones de SNP de efecto alto y moderado que afectan las secuencias codificantes (menos polimórficas) y que pueden agruparse en regiones de cromosomas particulares.

Utilizamos datos de variación de SNP (alto, moderado y modificador; consulte el archivo adicional 4: Tabla S2), así como datos de expresión media para todos los genes, para investigar los niveles promedio de polimorfismo de codificación y expresión cromosómica, utilizando los 21 cromosomas. de IPO323 como andamio. Los SNP modificadores representan cambios de nucleótidos que no provocan un cambio de aminoácido. La Figura 3A demuestra que no existía ningún sesgo particular para la frecuencia de mutación cuando los SNP acumulativos altos, moderados y modificadores se expresaron como una característica de la longitud promedio de la proteína por cromosoma completo. Sin embargo, cuando se omitieron las mutaciones modificadoras, es decir, aquellas que no causan un cambio de aminoácido, quedó claro que los 8 cromosomas más pequeños poseían genes con un mayor número de mutaciones de SNP altas y moderadas (Fig. 3B). Este efecto se enfatizó aún más cuando solo se analizaron los SNP de alto efecto (Fig. 3C). En contraste con los niveles evidentes en los cromosomas centrales 1 a 13 (~20%), hasta el 90% de los genes que residen en los ocho cromosomas más pequeños, 14 a 21, estaban sujetos a mutaciones de alto efecto, probablemente de pérdida de función, en al menos un aislar (Fig. 3C). Los datos de transcripción acumulativos de los 12 nuevos aislados también demostraron una expresión promedio relativamente baja de genes presentes en los cromosomas 14-21 (Fig. 3D), como se había observado previamente para IPO323 [32, 43, 44]. En conjunto, estos datos indican una clara compartimentación genómica, con los ocho cromosomas accesorios más pequeños albergando secuencias que son altamente polimórficas, accesorias y generalmente mal expresadas.

La comparación de todos los genes en el genoma central o accesorio reveló que ~60% de todos los genes en este último se encontraron en al menos una cepa con una mutación de alto efecto (pérdida de función (LoF)) y que el 47% también estaban ausentes en al menos una cepa. al menos una cepa (archivo adicional 4: Tabla S2). De manera similar al análisis de los cromosomas accesorios, los genes accesorios individuales también se expresaron muy mal en general en los aislados analizados (archivo adicional 4: Tabla S2) y tenían un número mucho mayor de secuencias con funciones desconocidas (aproximadamente 80%). Estas observaciones se comparan bien con estudios pangenómicos previos realizados en colecciones globales de Z. tritici recolectadas con décadas de diferencia [27, 28].

También realizamos un análisis de variación de presencia y ausencia (PAV) gen por gen para todos los genes predichos en el aislado de referencia IPO323, para los otros 17 aislados secuenciados. Estos datos de presencia/ausencia se trazaron posicionalmente para cada gen en cada uno de los 21 cromosomas presentes en IPO323. Las Figuras 3E y F muestran datos de cromosomas centrales representativos (1 y 7), mientras que las Figuras 3G y H muestran datos de cromosomas accesorios representativos (13 y 14). Los datos de los cromosomas restantes se muestran en el archivo adicional 2: Fig. S2. Este análisis identificó muchos genes presentes en IPO323 que faltan en varios de los aislados resecuenciados y muestra claramente la diferencia en la presencia/ausencia general de genes entre los cromosomas "centrales" de IPO323 (que se encuentran en cada cepa de Z. tritici). en comparación con los 8 cromosomas "accesorio" más pequeños. Los datos también destacan una región en el cromosoma 7 en particular, entre 1,7 Mb y 2,5 Mb, que muestra una alta frecuencia de ausencia de genes en los nuevos aislados (Fig. 3F). Curiosamente, esta región coincide exactamente con una ubicación del genoma que previamente se había observado que tenía una expresión genética mínima o nula en IPO323, ya sea durante el crecimiento en cultivo o durante cualquier fase de la infección de la planta [32, 43]. Esta región también coincide con una deleción cromosómica, que se observó en un aislamiento yemení en un estudio pangenoma anterior [28]. En conjunto, estos datos refuerzan la noción de que Z. tritici representa un organismo en rápida evolución con altos niveles y diferentes tipos de diversidad genética y genómica dentro de su población.

Las predicciones de localización de proteínas revelan genes en el pangenoma accesorio que pueden funcionar en la adaptación a entornos cambiantes.

Las predicciones de localización de proteínas WolfPsort se ejecutaron en todas las proteínas codificadas por el pangenoma. Luego calculamos el porcentaje relativo de proteínas que se predijo que se localizarían en cada región subcelular como una característica del número total de proteínas para el pangenoma central o accesorio (Fig. 4). Se enriquecieron varias categorías de localización en el genoma central, incluidas "citoplasma", "extracelular" y "membrana plasmática", la última de las cuales contiene muchas funciones de transporte clave (Fig. 4). Por el contrario, las localizaciones "núcleo" y "mitocondrias" se asociaron con un mayor porcentaje de genes en el genoma accesorio (Fig. 4). El genoma accesorio se enriqueció con dominios de unión a zinc particulares que pueden proporcionar flexibilidad de transcripción. El enriquecimiento de esta categoría también se informó en un estudio pangenoma anterior que destaca que nuestra cartera general generó resultados comparables [27, 28]. El enriquecimiento "mitocondrial" es interesante ya que existen pseudogenes y parálogos de proteínas mitocondriales auténticas a las que se dirigen las químicas antifúngicas. Un claro ejemplo en el pangenoma accesorio es un parálogo de una subunidad C de succinato deshidrogenasa (SDHC3) que se ha demostrado que media la resistencia permanente hacia una subclase de fungicidas SDHI (inhibidor de succinato deshidrogenasa) en Z. tritici [45]. Identificamos secuencias completas de este gen solo en tres de los diecisiete aislados secuenciados, y detectamos un alto nivel de expresión génica en solo uno de los 12 estudiados posteriormente por RNAseq (Fig. 5B). Sin embargo, el estudio anterior y nuestro análisis actual enfatizan que, de hecho, existen funciones importantes en el genoma accesorio, pero que probablemente sean más importantes para la adaptación a entornos cambiantes que para el estilo de vida central.

Fig. 3 Características estructurales del pangenoma y polimorfismos de presencia/ausencia en los 21 cromosomas del aislado de referencia IPO323. A Número total de mutaciones acumuladas de SNP que confieren cambios de impacto modificador, moderado (M) y alto (H-pérdida de función-LoF) expresados ​​como una característica de la longitud promedio de la proteína (aa) por cromosoma. B Número total de mutaciones acumuladas de SNP que confieren cambios de impacto moderado y alto expresados ​​como una característica de la longitud promedio de la proteína por cromosoma. C Número total de mutaciones acumuladas de SNP que confieren cambios de alto impacto expresados ​​como una característica de la longitud promedio de la proteína por cromosoma. D Expresión promedio promedio de todos los genes presentes en cada uno de los 21 cromosomas en todos los aislados. E Polimorfismo de presencia y ausencia (PaV) de los genes predichos en el cromosoma central 1 del aislado IPO323 en los 17 aislados recién secuenciados. F PaV para genes en el cromosoma central 7. G PaV para genes en el cromosoma accesorio 15. G – F PaV para genes en el cromosoma accesorio 15. Los datos resaltan una amplia variación regional y marcan una clara distinción entre los niveles de polimorfismos de secuencia general y presencia/ Ausencia evidente en los cromosomas centrales y accesorios.

Fig. 4 Localización prevista de proteínas codificadas por genes centrales y accesorios. Resumen del porcentaje de localizaciones de proteínas previstas determinadas por WolfPsort para las categorías indicadas en relación con las proteínas totales presentes en el pangenoma central y accesorio

Las proteínas efectoras en el genoma accesorio muestran más variabilidad en la expresión entre cepas que las del genoma central

Más del ocho por ciento de los genes del genoma central codificaban supuestas proteínas secretadas, un número superior al del genoma accesorio (~5%). Sin embargo, los genes del genoma accesorio que codifican la proteína secretada tenían con mayor frecuencia una función desconocida y carecían de dominios reconocibles o regiones catalíticas. Estas proteínas de función desconocida representaron aproximadamente el 75% del secretoma accesorio total en comparación con el 42% del secretoma central. Muchos de los efectores candidatos (y en algunos casos validados) presentes en el genoma central se expresaron en patrones similares y en niveles comparables en los doce aislados analizados por RNASeq. Por ejemplo, los tres efectores que contienen el dominio LysM (Lysina), 3LysM, 1LysM y xLysM, se expresaron a niveles muy similares y en patrones idénticos, por cada cepa (Fig. 5C-E). El efector 3LysM sigue siendo el único determinante importante de virulencia secretado de Z. tritici, donde esta proteína sirve para suprimir la inmunidad vegetal activada por quitina durante la infección temprana [46, 47]. Sin embargo, se sabe que los tres efectores LysM trabajan juntos para este fin [48]. Por lo tanto, es digno de mención que hubo muy poca variación en la expresión de estos genes entre los aislados, lo que refuerza las sugerencias de que esta supresión de las defensas es un componente central de la infección. Por el contrario, los efectores candidatos encontrados en el genoma accesorio mostraron variación tanto de presencia como de ausencia y una expresión altamente variable entre los aislados (Fig. 5F-H). Por ejemplo, AvrStb6, el primer efector de avirulencia identificado en Z. tritici, [49, 50] muestra una variación de expresión considerable (Fig. 5F), a pesar de estar presente en todos los aislados. Esta variable de secuencia, una pequeña proteína secretada, es reconocida por cultivares de trigo que contienen alelos funcionales de la quinasa similar a un receptor Stb6 [25, 51]. Este reconocimiento proporciona resistencia a enfermedades contra todos los aislados que albergan un alelo particular de este efector. Hubo una variación significativa de la expresión de AvrStb6 entre los aislados e identificamos un aislado (Zt118) en el que no pudimos detectar ninguna expresión, en ninguna de las tres condiciones analizadas. Por este motivo, en nuestro proceso de predicción, AvrStb6 se clasificó en el genoma accesorio. Muchos otros efectores candidatos de funciones actualmente desconocidas mostraron presencia/ausencia significativa y/o variación de expresión en el genoma accesorio (Fig. 5G y H).

Fig. 5 Variación de la expresión de genes en el pangenoma central y accesorio y establecimiento de un sistema de sobreexpresión viral transitoria implementado para pruebas de efectores necrotróficos. En las figuras se muestra una clave para interpretar los datos. B Presencia/ausencia y variación de la expresión génica para el parálogo de la subunidad C de la succinato deshidrogenasa presente en el genoma accesorio. Perfiles de expresión C – E de los efectores ZtLysM, 3LysM, 1LysM y xLysM, todos presentes en el pangenoma central. F Perfil de expresión del efector de avirulencia AvrStb6. La falta de expresión en el aislado 118 clasifica al efector en el pangenoma accesorio. G y H representan ejemplos de efectores candidatos adicionales en el pangenoma accesorio.

Las pruebas funcionales no proporcionan evidencia de actividad efectora necrotrófica ni en el pangenoma central ni en el accesorio.

Adoptamos un sistema de expresión transitoria de proteínas mediado por vectores virales desarrollado recientemente para el trigo (y otros cultivos de cereales y no cereales), utilizando el virus del mosaico de cola de zorra (FoMV), para realizar una detección de rendimiento medio a alto de candidatos a efectores de Z. tritici. del pangenoma. Nuestro objetivo específico fue probar si alguno tenía la capacidad de inducir necrosis en un pequeño panel de cultivares de trigo, lo que podría implicar su función en la transición a los síntomas de la enfermedad como "efectores necrotróficos" [36, 52]. Para este estudio, realizamos algunas modificaciones al sistema publicado anteriormente [53]. Para impulsar la secreción de proteínas extracelulares en el trigo, utilizamos la secuencia del péptido señal de la proteína 1 relacionada con la patogénesis del trigo (TaPR1), optimizada con codones para Arabidopsis thaliana, que luego se fusionó en marco con cada secuencia efectora fúngica candidata mediante síntesis génica (Fig. 5I). La eficacia del péptido señal TaPR1 para secretar proteínas extracelulares funcionales de Z. tritici se estableció por su capacidad para inducir la necrosis de las hojas en el tabaco cuando se coloca delante de la proteína similar a la necrosis y el etileno de Z. tritici (ZtNLP), que es funcional únicamente. cuando está dirigido a la secreción extracelular (Fig. 5 Jl) [54]. Luego confirmamos que el vector podría sobreexpresar proteínas igualmente bien en una variedad de cultivares de trigo al visualizar la expresión local y sistémica de la proteína verde fluorescente (GFP) en las hojas de diferentes cultivares de trigo (archivo adicional 2: Fig. S3). Finalmente, probamos la capacidad del bien caracterizado efector necrotrófico SnToxA, del patógeno relacionado del trigo Parastagonospora nodorum, para inducir necrosis en hojas de trigo de genotipos que poseen el gen de sensibilidad Tsn1 [55]. Como se anticipó, la sobreexpresión de SnToxA mediada por FoMV, con el péptido señal TaPR1, indujo necrosis solo en el cultivar de trigo que poseía Tsn1 (cv Halberd en la Fig. 5K) y no se observaron síntomas en los cultivares que carecían de este gen de susceptibilidad (cv Riband en la Fig. 5K). ). Estos datos confirmaron que el sistema de sobreexpresión mediado por vectores virales era adecuado para una selección a mayor escala de efectores candidatos de Z. tritici para identificar cualquiera con actividad efectora necrotrófica. Se seleccionaron y examinaron un total de 88 candidatos en cinco cultivares de trigo (archivo adicional 5: Tabla S3). Estos incluían 66 proteínas que residen en el pangenoma central y 22 del accesorio. Los genes seleccionados (archivo adicional 5: Tabla S3) variaron desde genes centrales sin polimorfismos específicos de cepa (monomórficos) y con alta expresión en la planta, hasta aquellos en el genoma accesorio que exhiben presencia/ausencia y/o polimorfismo de expresión sustancial. En todos los experimentos se realizaron controles técnicos paralelos de ToxA vs cv Halberd y cv Riband, y siempre produjeron los resultados esperados. Por el contrario, ninguna de las 88 proteínas sobreexpresadas de Z. tritici analizadas indujo necrosis foliar en ningún cultivar de trigo. En resumen, estos resultados no proporcionaron ninguna evidencia de efectos necrotróficos y, por lo tanto, no respaldan que ninguno de los candidatos probados induzca el cambio al crecimiento necrotrófico durante la infección.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Los genes centrales que codifican proteínas con funciones esenciales para la vida o de virulencia clave demostradas o previstas tienen niveles generales más bajos de polimorfismo de aminoácidos.

Realizamos una búsqueda bibliográfica para identificar todos los genes de Z. tritici que habían sido sujetos a caracterización funcional, ya sea en virulencia o como genes esenciales hasta 2018. Esto generó una lista de 28 secuencias de proteínas (archivo adicional 6: Tabla S4). De manera similar, identificamos una lista de 26 proteínas que también se habían caracterizado funcionalmente pero que se había demostrado que no desempeñaban un papel importante en la virulencia ni eran esenciales (archivo adicional 6: Tabla S4). Luego investigamos los niveles de mutaciones altas y moderadas redundantes acumulativas en estos genes y expresamos sus valores como una característica de cada longitud de proteína y luego determinamos los valores promedio para el conjunto. La Figura 6 destaca que los genes publicados que afectan la virulencia tuvieron una frecuencia menor estadísticamente significativa (p=0.007) de mutación (polimorfismo) que aquellos que han demostrado ser funcionalmente redundantes.

Los estudios destinados a definir genes esenciales para la vida (esenciales) en hongos filamentosos (excluidas las levaduras) son pocos y, hasta la fecha, solo existe un representante en la base de datos de genes esenciales (DEG), el del patógeno humano oportunista Aspergillus fumigatus. [56–58]. Identificamos el ortólogo de Z. tritici de los 28 genes que experimentalmente demostraron ser esenciales para la vida en A. fumigatus y nuevamente calculamos las tasas de mutación relativas de cada uno en relación con la longitud de las secuencias (archivo adicional 7, Tabla S5). Una vez más, encontramos una clara reducción estadísticamente significativa (p=0.0148) en la frecuencia de mutaciones altas y moderadas de SNP en estos genes esenciales candidatos, luego observada para genes que demostraron no ser esenciales ni para la virulencia ni para la vida ( Figura 6). Por el contrario, no hubo diferencias significativas (p=0.2128) entre las tasas de mutación de los genes de virulencia validados experimentalmente y los genes esenciales predichos (Fig. 6). Estos datos en conjunto respaldan el concepto de que los niveles de polimorfismos de aminoácidos en las poblaciones podrían usarse para predecir la importancia relativa de los genes para el estilo de vida central del organismo.

Fig. 6 El análisis de conjuntos de genes centrales de patogenicidad validada experimentalmente y/o genes esenciales para la vida previstos revela tasas de mutación más bajas que las observadas en genes no esenciales. Las tasas de mutación promedio altas y moderadas (H/M) expresadas como una característica de las longitudes de las proteínas (aa) para las listas de genes que codifican proteínas que han sido; 1- se determinó experimentalmente que no desempeña ningún papel (o que desempeña un papel muy secundario) en la virulencia de los hongos; 2-determinado experimentalmente para desempeñar un papel importante en la virulencia y; Se predice que 3- codifica genes putativos esenciales para la vida a través de la ortología de proteínas caracterizadas experimentalmente en Aspergillus fumigatus. El símbolo de asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa entre las tasas de mutación entre los conjuntos de genes indicados. Las listas de genes y los datos de polimorfismos asociados se muestran en el archivo adicional 6: Tabla S4

La utilidad del enfoque predictivo combinado para revelar la debilidad del patógeno está respaldada por estudios de complementación genética en un mutante de deleción de cinco genes "centrales".

Z. tritici es susceptible de realizar exámenes genéticos basados ​​en la integración aleatoria del ADN-T mediante la transformación fúngica mediada por Agrobacterium (AMT). Nuestro trabajo anterior había generado un mutante de ADN T de Z. tritici en particular que no pudo causar una enfermedad completa en las hojas de trigo infectadas (Fig. 7A). Este mutante, llamado 23-21 (la ronda 23 de transformación y la colonia 21 elegida), podría crecer normalmente como tipo salvaje en un medio de agar rico en nutrientes (YPD), pero no logró extender niveles comparables de hifas fúngicas cuando se cultivó en un medio privado de nutrientes, incluido el agar agua (Fig. 7A). Utilizamos la resecuenciación de 23-21 basada en Illumina del genoma completo para revelar la posición de la inserción de ADN-T potencialmente causante. Este análisis reveló una única integración de ADN-T entre las posiciones 899878 y 912699 en el cromosoma 8, lo que provocó una eliminación/interrupción de cinco secuencias codificantes predichas (Fig. 7B). El análisis de SNP e indel no reveló mutaciones adicionales sin etiquetar en la cepa 23-21 en relación con la secuencia del genoma de tipo salvaje de IPO323. La eliminación del 23-21 T-DNA eliminó efectivamente cinco genes, todos los cuales residen en el genoma central, y con las siguientes predicciones funcionales (Interpro); gen 1=Citocromo P450; gen 2=S-adenosil metionina metiltransferasa; gen 3=Zinc (2) Proteína de unión al ADN tipo C6; gen 4=Nucleósido difosfato quinasa (NDK) y gen 5=Glicosil hidrolasa 31 (Fig. 7B). Investigamos los números relativos de mutaciones altas y moderadas en cada proteína como una característica de la longitud de la proteína, lo que reveló que la proteína 4 (NDK) tenía muchas menos mutaciones que afectaban los cambios en la secuencia de aminoácidos que las otras cuatro secuencias analizadas en el conjunto aislado (Fig. 7C y archivo adicional 2: Fig. S4). Luego investigamos la expresión relativa promedio de los cinco genes en todos los aislados analizados. También reveló que el gen 4 (que codifica el NDK) tenía una expresión significativamente mayor que todos los demás candidatos (Fig. 7D y archivo adicional 2: Fig. S5). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la pérdida del gen menos polimórfico y de mayor expresión, el gen 4, el NDK, era responsable de la pérdida de virulencia y del defecto asociado en la extensión de los flamentes hifales. Para probar esto, transformamos cada uno de los cinco genes candidatos individualmente en la cepa mutante 23-21 Z. tritici, cada uno impulsado por su propio promotor endógeno. Se obtuvieron múltiples transformantes de cada uno y se volvió a analizar su virulencia en hojas de trigo y la capacidad de extender hifas filamentosas en agar agua. Esto demostró que la reintroducción del gen NDK solo (gen 4) restableció completamente tanto la virulencia como el crecimiento de hifas a niveles de tipo salvaje (Fig. 7E y archivo adicional 2: Fig. S6). La reintroducción de cada uno de los otros cuatro candidatos no provocó ningún cambio en el fenotipo de la cepa mutante original 23-21 (Fig. 7E). Para garantizar que todos los genes reintroducidos se expresaran en su respectiva cepa complementada, se realizó RT-PCR en cada uno de los transformantes y en el mutante 23-21 original. Esto confirmó la falta anticipada de cada transcripción en el mutante 23-21 y demostró la expresión correcta de cada gen diana en los aislados complementados (Fig. 7F). Por lo tanto, la reintroducción del gen único con los menos polimorfismos a nivel de población de los cinco candidatos y la expresión relativa más alta restauró los fenotipos defectuosos en este patógeno del trigo. Esta observación experimental respalda la utilidad de combinar pangenómica y transcriptómica para predecir genes que son potencialmente importantes para rasgos funcionales clave de la vida.

Fig. 7 Los ensayos de complementación funcional en un mutante de Z. tritici no patógeno con eliminación de cinco genes respaldan el uso combinado de la tasa de mutación derivada del pangenoma y el análisis del nivel de expresión como predictores de importantes genes centrales del estilo de vida. A Características de crecimiento e infección de un mutante de inserción aleatoria de ADN T de Z. tritici "23-21". La cepa crece normalmente en agar rico en nutrientes, pero tiene defectos en el crecimiento filamentoso en agar pobre en nutrientes y está gravemente comprometida en la actividad causante de enfermedades de la hoja de trigo. Las barras de escala representan 1 cm. B La resecuenciación del genoma completo de la cepa 23-21 revela una eliminación mediada por el ADN-T de una región genómica de 13 kb que altera o elimina cinco genes predichos del pangenoma central. C Muestra el promedio de eventos de mutación alta y moderada para cada gen (etiquetado como 1-5) del pangenoma en relación con la longitud de la proteína codificada (aa).

Discusión

La pangenómica y la transcriptómica combinadas pueden utilizarse como armas contra patógenos que evolucionan rápidamente

Pangenomics analyses have been performed on other fungi and yeasts including Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans var. grubii, and Aspergillus fumigatus [10]. All four species are model organisms in eukaryotic genomics and the latter three can also cause human diseases. Recent pangenome analyses on each of these species revealed that > 80% of all genes detected were core and thus found in every strain [10]. Our current study, and those previously [27, 28], clearly highlight that Z. tritici has a larger (>40% del total de genes) genoma accesorio que estas especies. No está claro por qué y cómo Z. tritici y otros hongos potencialmente patógenos de plantas mantienen un componente accesorio tan grande. Por ejemplo, los ocho cromosomas más pequeños identificados en IPO323 no tienen ningún impacto importante claro en la virulencia ni en ningún otro proceso, y solo un estudio sugiere actualmente que los cromosomas 14, 16, 18, 19 y 21 desempeñan un papel sutil en la virulencia en cultivares de trigo seleccionados [59]. Sin embargo, las combinaciones de estos pequeños cromosomas se mantienen en las poblaciones. Se ha sugerido que proporcionan eventos de recombinación que pueden ser la base de la capacidad del hongo para evolucionar rápidamente para adaptarse al estrés ambiental, potencialmente combinado con altas tasas de actividad de elementos transponibles [60-62]. Se puede argumentar un caso similar para el gran genoma accesorio. Esto lo respalda la importancia funcional de dos componentes accesorios del genoma a los que se hace referencia en este estudio, el parálogo de la subunidad C de SDH y AvrStb6, los cuales tienen funciones clave en la interacción con elementos variables del entorno externo (aplicación de fungicidas y cultivares con características similares). genes de resistencia a enfermedades, respectivamente) [25, 45]. Se han descrito otros procesos biológicos que también pueden perderse en aislados individuales de Z. tritici sin defectos claros de aptitud, incluido el control de la melanización (pigmentación) [63]. Nuestro estudio ha destacado que el genoma accesorio de Z. tritici, que evoluciona rápidamente, podría usarse en su contra cuando, en cambio, la atención se centra en lo que no se puede perder o tiene un polimorfismo limitado. Este estudio ha tratado de hacer esto, considerando que los genes centrales no solo están presentes y son funcionales en todos los aislados, sino que también se expresan en todos los aislados. También adoptamos el enfoque de intentar clasificar los conjuntos de genes en el genoma central, en función de los niveles de variabilidad de la secuencia de aminoácidos. Por supuesto, existen algunas advertencias con los métodos que hemos utilizado, particularmente en el sentido de que las mutaciones redundantes (tipo y posición idénticos) no se pueden separar fácilmente de un número similar de mutaciones que pueden ocurrir en posiciones únicas en cada aislado (mutaciones no redundantes). Por lo tanto, nuestro método no es adecuado para clasificar genes en rápida evolución. Sin embargo, el método permite identificar fácilmente genes con poca o ninguna variabilidad basándose en bajas tasas de polimorfismos que afectan los cambios de aminoácidos. El enfoque demostró que los genes esenciales para la vida o los genes de virulencia verificados y predichos experimentalmente albergaban significativamente menos polimorfismo de este tipo entre aislados que aquellos cuyas funciones son prescindibles para estos procesos. Finalmente, ampliamos este enfoque para identificar una nueva función de virulencia de una nucleósido difosfato quinasa (NDK), que exhibió la menor variación de todos los genes en una deleción del gen 5-T-DNA. Con base en estos hallazgos, proponemos que los niveles de polimorfismo en genes centrales identificados en pangenómica podrían usarse para inferir funciones importantes para las proteínas codificadas y así priorizar genes para análisis funcionales para identificar nuevos objetivos para la protección de cultivos y potencialmente la salud animal.

¿Una debilidad emergente en la biología de la infección por Z. tritici y patógenos relacionados?

Este estudio también proporcionó más información específica sobre la biología de la infección de este importante patógeno del trigo. En primer lugar, no se obtuvo evidencia que respalde la presencia de actividades efectoras necrotróficas importantes para 88 proteínas secretadas seleccionadas de los genomas centrales y accesorios. No podemos descartar la posibilidad de que no hayamos seleccionado las proteínas correctas o que múltiples efectores puedan trabajar juntos para provocar la muerte de las células vegetales (también sugerido por perfiles de expresión similares). Si este último fuera el caso, esto diferiría de la clara importancia de los efectores necrotróficos únicos en los hongos relacionados que infectan el trigo, en particular las especies Parastagonospora nodorum y Pyrenophora [35]. También es posible que los niveles de expresión que obtengamos del sistema FoMV transitorio sean más bajos que los requeridos para los efectores cuyo reconocimiento es menos pronunciado que el de SnToxA. Sin embargo, los datos presentados en este documento no respaldan la idea de que la transición al crecimiento sintomático y la muerte de las células vegetales se invoca mediante el reconocimiento de los principales (únicos) efectos necrotróficos de Z. tritici. Por lo tanto, es posible que la producción masiva de estas proteínas al inicio de los síntomas pueda servir para proteger las hifas de los hongos de la aparente hiperactivación de la muerte celular y la respuesta de las plantas. De acuerdo con esto, se ha demostrado que los efectores secretados de este y otros hongos tienen la capacidad de inhibir proteasas, quitinasas y otras enzimas que atacan la pared celular de origen vegetal, que a su vez son inducidas por las plantas durante las respuestas de defensa [46, 48, 64, 65]. ]. Más recientemente, también se ha demostrado que los efectores fúngicos manipulan y remodelan micro y microbiomas [66, 67].

Beneficios de cistanche para hombres: fortalece el sistema inmunológico.

Sin embargo, la identificación de un papel clave en la virulencia del NDK es significativa. A estas proteínas se les han atribuido múltiples funciones en diferentes organismos procarióticos y eucariotas. En los hongos, hay un informe que atribuye un papel a la modulación de la inmunidad de las plantas [68], mientras que, en otra especie (A. fumigatus), se ha demostrado una función esencial para la vida [69]. Sin embargo, la función principal y conservada de estas proteínas es fosforilar nucleósidos difosfatos, generalmente utilizando ATP como sustrato, para generar otros nucleósidos trifosfatos (NTP) necesarios para ayudar a alimentar diversos procesos celulares [70, 71]. Esto es particularmente importante cuando los recursos limitados dificultan la generación de ciertos NTP por otros medios. Por lo tanto, los NDK presentan una actividad de vía de rescate clave para la regeneración de NTP, muy probablemente importante cuando los recursos extracelulares son limitados. Recientemente han surgido funciones importantes para varias otras vías de recuperación, y en particular para las vías biosintéticas, a partir de otros estudios de función genética en Z. tritici. Por ejemplo, la biosíntesis de lisina es esencial para la infección y el crecimiento de hifas en nutrientes pobres [72], al igual que la biosíntesis de purina [73]. Estas funciones son redundantes para el crecimiento en medios completos. Datos previos del transcriptoma sobre la etapa muy temprana de la colonización de la superficie de la hoja han indicado que el hongo se encuentra en un ambiente empobrecido de nutrientes y depende de la utilización de reservas intracelulares [33]. En conjunto con los estudios funcionales previos y el papel clave demostrado por NDK, está claro que Z. tritici es extremadamente vulnerable a la inhibición de vías biosintéticas y de recuperación clave cuando se encuentra en la superficie de la hoja durante la colonización temprana y, potencialmente, hasta la inducción de muerte de las células vegetales entre 7 y 10 días después. Por lo tanto, nuevos productos o estrategias de protección de cultivos podrían dirigirse a la inhibición de estos procesos, lo que puede representar una debilidad en Z. tritici, y potencialmente para una amplia variedad de otros hongos relacionados con modos de infección similares.

Conclusiones

Este estudio proporciona apoyo inicial para el uso combinado de pangenómica y transcriptómica para definir genes que representan las debilidades centrales y potencialmente explotables de los patógenos en rápida evolución. Sin embargo, en principio, los enfoques podrían usarse para la priorización de genes en cualquier sistema biológico donde estén disponibles múltiples genomas y transcriptomas. Anticipamos que estos enfoques podrían avanzar en el descubrimiento de procesos biológicos centrales en muchos sistemas biológicos diversos.

Referencias

1. Fisher MC, Hawkins Nueva Jersey, Sanglard D, Gurr SJ. La aparición mundial de resistencia a los medicamentos antimicóticos supone un desafío para la salud humana y la seguridad alimentaria. Ciencia. 2018;360. https://doi.org/10.1126/science.aap7999.

2. Fisher MC, Henk DA, Briggs CJ, Brownstein JS, Madoff LC, McCraw SL, et al. Amenazas fúngicas emergentes para la salud de los animales, las plantas y los ecosistemas. Naturaleza. 2012;484. https://doi.org/10.1038/nature10947.

3. Lucas JA, Hawkins Nueva Jersey, Fraaije BA. La evolución de la resistencia a los fungicidas. Adv Appl Microbiol. 2015;90. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001.

4. Heitman J. Reproducción sexual y evolución de patógenos microbianos. Curr Biol. 2006;16. https://doi.org/10.1016/j.cub.2006.07.064.

5. Dong S, Raffaele S, Kamoun S. Los genomas de dos velocidades de patógenos filamentosos: vals con plantas. Opinión actual Genet Dev. 2015;35:57–65. https://doi.org/10.1016/J.GDE.2015.09.001.

6. Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz MJ, Donati C, Medini D, Ward NL, et al. Análisis del genoma de múltiples aislados patógenos de Streptococcus agalactiae: implicaciones para el "pangenoma" microbiano. Proc Natl Acad Sci EE.UU. A. 2005;102. https://doi.org/10.1073/pnas.0506758102.

7. Lefébure T, Stanhope MJ. Evolución del núcleo y pangenoma de estreptococos a cocos: selección positiva, recombinación y composición del genoma. Genoma Biol. 2007;8. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-5-r71.

8. Tian CF, Zhou YJ, Zhang YM, Li QQ, Zhang YZ, Li DF, et al. La genómica comparada de los rizobios que nodulan la soja sugiere un reclutamiento extenso de genes específicos del linaje en las adaptaciones. Proc Natl Acad Sci EE.UU. A. 2012;109. https://doi.org/10.1073/pnas.1120436109.

9. Syme RA, Tan KC, Rybak K, Friesen TL, McDonald BA, Oliver RP, et al. Panparastagonospora análisis comparativo del genoma-predicción efectora y evolución del genoma. Genoma Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy192.

10. McCarthy CGP, Fitzpatrick DA. Análisis pangenómicos de especies de hongos modelo. Microbio. Genómica. 2019;5. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000243.

11. Yang X, Li Y, Zang J, Li Y, Bie P, Lu Y, et al. Análisis del pangenoma para identificar los genes centrales y genes esenciales de Brucella spp. Genómica Mol Gen. 2016;291. https://doi.org/10.1007/s00438-015-1154-z.

12. Barber AE, Sae-Ong T, Kang K, Seelbinder B, Li J, Walther G, et al. El análisis del pangenoma de Aspergillus lus fumigatus identifica variantes genéticas asociadas con la infección humana. Microbiol natural. 2021;6. https://doi.org/10.1038/s41564-021-00993-x.

13. Zhang X, Liu B, Zou F, Shen D, Yin Z, Wang R, et al. La resecuenciación del genoma completo revela variación natural y evolución adaptativa de Phytophthora sojae. Microbiol frontal. 2019;10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019. 02792.

14. Torriani SFF, Melichar JPE, Mills C, Pain N, Sierotzki H, Courbot M. Zymoseptoria tritici: una gran amenaza para la producción de trigo, enfoques integrados de control. Biol genético de hongos. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.010.

15. Zhan J, Mundt CC, McDonald BA. Medición de la inmigración y reproducción sexual en poblaciones de campo de Mycosphaerella graminicola. Fitopatología. 1998;88. https://doi.org/10.1094/PHYTO.1998.88.12.1330.

16. Zhan J, Kema GHJ, Waalwijk C, McDonald BA. Distribución de alelos de tipo de apareamiento en el patógeno del trigo Mycosphaerella graminicola en escalas espaciales desde lesiones hasta continentes. Biol genético de hongos. 2002;36. https://doi. org/10.1016/S1087-1845(02)00013-0.

17. Stukenbrock EH, Banke S, Javan-Nikkhah M, McDonald BA. Origen y domesticación del hongo patógeno del trigo Mycosphaerella graminicola mediante especiación simpátrica. Mol Biol Evol. 2007;24. https://doi.org/10. 1016/S1087-1845(02)00013-0.

18. Linde CC, Zhan J, McDonald BA. Estructura poblacional de Mycosphaerella graminicola: de lesiones a continentes. Fitopatología. 2002;92. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.9.946.

19. Croll D, McDonald BA. La base genética de la adaptación local de hongos patógenos en ecosistemas agrícolas. Ecología Mol. 2017;26. https://doi.org/10.1111/mec.13870.

20. Croll D, Lendenmann MH, Stewart E, McDonald BA. El impacto de los puntos críticos de recombinación en la evolución del genoma de un patógeno vegetal fúngico. Genética. 2015;201. https://doi.org/10.1534/genetics.115.180968.

21. Dutta A, Croll D, McDonald BA, Barrett LG. Mantenimiento de la variación en virulencia y reproducción en poblaciones de un patógeno vegetal agrícola. Aplicación Evol. 2021;14. https://doi.org/10.1111/eva.13117.

22. Feurtey A, Stevens DM, Stephan W, Stukenbrock EH, Stajich J. El intercambio de genes interespecíficos introduce una alta variabilidad genética en los patógenos de los cultivos. Genoma Biol Evol. 2019;11. https://doi.org/10.1093/gbe/evz224.

23. Hartmann FE, Sánchez-Vallet A, McDonald BA, Croll D. Un patógeno fúngico del trigo evolucionó hacia la especialización del huésped mediante extensos reordenamientos cromosómicos. ISME J. 2017;11. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.196.

24. Fouché S, Plissonneau C, McDonald BA, Croll D. La meiosis conduce a una variación generalizada del número de copias y una herencia distorsionada del cromosoma accesorio del patógeno del trigo Zymoseptoria tritici. Genoma Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy100.

25. Stephens C, Ölmez F, Blyth H, McDonald M, Bansal A, Burcu Turgay E, et al. Cambios recientes notables en la diversidad genética del gen de avirulencia AvrStb6 en poblaciones globales del patógeno del trigo Zymoseptoria tritici. Patol vegetal Mol. 2021. https://doi.org/10.1111/mpp.13101.

26. Goodwin SB, M'Barek S, Dhillon B, Wittenberg AHJ, Crane CF, Hane JK, et al. El genoma terminado del hongo patógeno del trigo Mycosphaerella graminicola revela estructura de dispensación, plasticidad cromosómica y patogénesis sigilosa. PLoS Genet. 2011;7. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002070.

27. Badet T, Oggenfuss U, Abraham L, McDonald BA, Croll D. A 19-pangenoma global aislado de calidad de referencia para el patógeno fúngico del trigo Zymoseptoria tritici. BMC Biol. 2020;18. https://doi.org/10.1186/s12915-020-0744-3.

28. Plissonneau C, Hartmann FE, Croll D. Los análisis de pangenomas del patógeno del trigo Zymoseptoria tritici revelan la base estructural de un genoma eucariota altamente plástico. BMC Biol. 2018;16. https://doi.org/10.1186/s12915-017-0457-4.

29. Wittenberg AHJ, van der Lee TAJ, M'Barek SB, Ware SB, Goodwin SB, Kilian A, et al. La meiosis impulsa una extraordinaria plasticidad del genoma en el hongo patógeno vegetal haploide Mycosphaerella graminicola. Más uno. 2009;4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005863.

30. Steinberg G. Biología celular de Zymoseptoria tritici: organización de células patógenas e infección del trigo. Biol genético de hongos. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.002.

31. Kema GHJ, Yu DZ, Rijkenberg FHJ, Shaw MW, Baayen RP. Histología de la patogénesis de Mycosphaerella graminicola en trigo. Fitopatología. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-777.

32. Rudd JJ, Kanyuka K, Hassani-Pak K, Derbyshire M, Andongabo A, Devon-Shire J, et al. El perfil de transcriptoma y metabolitos del ciclo de infección de Zymoseptoria tritici en el trigo revela una interacción bifásica con la inmunidad de la planta que involucra contribuciones cromosómicas diferenciales del patógeno y una variación en la definición de estilo de vida hemibiotrófico. Fisiol vegetal. 2015;167. https://doi.org/10.1104/pp.114.255927.

33. Keon J, Antoniw J, Carzaniga R, Deller S, Ward JL, Baker JM, et al. Adaptación transcripcional de Mycosphaerella graminicola a la muerte celular programada (PCD) de su huésped susceptible de trigo. Interacción Mol Planta-Microbio. 2007;20. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-2-0178.

34. Rudd JJ, Keon J, Hammond-Kosack KE. Las proteínas quinasas TaMPK3 y TaMPK6 activadas por mitógenos del trigo se regulan diferencialmente en múltiples niveles durante interacciones de enfermedades compatibles con Mycosphaerella graminicola. Fisiol vegetal. 2008;147. https://doi.org/10.1104/pp.108. 119511.

35. Friesen TL, Faris JD. La caracterización de las interacciones efector-objetivo en patosistemas necrotróficos revela tendencias y variaciones en la manipulación del huésped. Annu Rev Fitopatol. 2021;59. https://doi.org/10.1146/annur ev-phyto-120320-012807.

36. Friesen TL, Faris JD, Solomon PS, Oliver RP. Toxinas específicas del huésped: efectoras de patogenicidad necrotrófica. Microbiol celular. 2008;10. https://doi.org/10. 1111/j.1462-5822.2008.01153.x.

37. Ben M'Barek S, Cordewener JHG, Tabib Ghafary SM, van der Lee TAJ, Liu Z, Mirzadi Gohari A, et al. La FPLC y la espectrometría de masas por cromatografía líquida identifican proteínas candidatas inductoras de necrosis a partir de filtrados de cultivo del hongo patógeno del trigo Zymoseptoria tritici. Biol genético de hongos. 2015;79. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2015.03.015.

38. Wyka S, Mondo S, Liu M, Nalam V, Broders K. Un genoma accesorio grande y altas tasas de recombinación pueden influir en la distribución global y la amplia gama de huéspedes del hongo patógeno vegetal Claviceps purpurea. Más uno. 2022;17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.

39. Moolhuijzen PM, Ver PT, Shi G, Powell HR, Cockram J, Jørgensen LN, et al. Un pangenoma global para el patógeno fúngico del trigo Pyrenophora triticirepentis y predicción de la homología estructural de la proteína efectora. Microbio. Genómica. 2022;8. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.

40. Kema GHJ, Sayoud R, Annone JG, Van Silfhout CH. Variación genética para virulencia y resistencia en el sistema de vías trigo-Mycosphaerella graminicola II. Análisis de interacciones entre aislados de patógenos y cultivares hospedantes. Fitopatología. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-213.

41. Kema GHJ, Annone JG, Sayoud R, Van Silfhout CH, Van Ginkel M, De Bree J. Variación genética para la virulencia y resistencia en el patosistema I. Mycosphaerella graminicola del trigo. Interacciones entre aislados de patógenos y cultivares hospedantes. Fitopatología. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-200.

42. Zhan J, Pettway RE, McDonald BA. La estructura genética global del patógeno del trigo Mycosphaerella graminicola se caracteriza por una alta diversidad nuclear, baja diversidad mitocondrial, recombinación regular y flujo de genes. Biol genético de hongos. 2003;38. https://doi.org/10.1016/S1087- 1845(02)00538-8.

43. Palma-Guerrero J, Torriani SFF, Zala M, Carter D, Courbot M, Rudd JJ, et al. Los análisis transcriptómicos comparativos de cepas de Zymoseptoria tritici muestran transiciones complejas en el estilo de vida y variabilidad intraespecífica en los perfiles de transcripción. Mol. Patol de plantas. 2016;17. https://doi.org/10.1111/mpp.12333.

44. Kellner R, Bhattacharyya A, Poppe S, Hsu TY, Brem RB, Stukenbrock EH. El perfil de expresión del patógeno del trigo Zymoseptoria tritici revela patrones genómicos de transcripción y programas reguladores específicos del huésped. Genoma Biol Evol. 2014;6. https://doi.org/10.1093/gbe/evu101.

45. Steinhauer D, Salat M, Frey R, Mosbach A, Luksch T, Balmer D, et al. Un parálogo prescindible de la subunidad C de la succinato deshidrogenasa media la resistencia permanente hacia una subclase de fungicidas SDHI en Zymoseptoria tritici. Patógeno PLoS. 2019;15. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1007780.

46. ​​Marshall R, Kombrink A, Motteram J, Loza-Reyes E, Lucas J, Hammond Kosack KE, et al. El análisis de dos homólogos efectores LysM expresados ​​en plantas del hongo Mycosphaerella graminicola revela nuevas propiedades funcionales y diversas contribuciones a la virulencia en el trigo. Fisiol vegetal. 2011;156. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.

47. Lee WS, Rudd JJ, Hammond-Kosack KE, Kanyuka K. Mycosphaerella graminicola lista la patogénesis sigilosa mediada por efector subvierte el reconocimiento a través de homólogos de cerk1 y cebip en el trigo. Interacción Mol Planta-Microbio. 2014;27. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.

48. Tian H, MacKenzie CI, Rodríguez-Moreno L, van den Berg GCM, Chen H, Rudd JJ, et al. Tres efectores LysM de Zymoseptoria tritici desarman colectivamente la inmunidad vegetal activada por quitina. Patol vegetal Mol. 2021;22. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.

49. Zhong Z, Marcel TC, Hartmann FE, Ma X, Plissonneau C, Zala M, et al. Una pequeña proteína secretada en Zymoseptoria tritici es responsable de la avirulencia en cultivares de trigo que portan el gen de resistencia Stb6. Nuevo fitol. 2017;214. https://doi.org/10.1111/nph.14434.

50. Kema GHJ, Mirzadi Gohari A, Aouini L, Gibriel HAY, Ware SB, Van Den Bosch F, et al. El estrés y la reproducción sexual afectan la dinámica del efector del patógeno térmico AvrStb6 y la resistencia a la estrobilurina. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/10.1111/nph.14434.

51. Saintenac C, Lee WS, Cambon F, Rudd JJ, King RC, Marande W, et al. La proteína Stb6 similar al receptor quinasa del trigo controla la resistencia gen por gen al patógeno fúngico Zymoseptoria tritici. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/10.1038/s41588-018-0051-x.

52. Tan KC, Oliver RP, Solomon PS, Mofat CS. Efectores necrotróficos proteicos en la virulencia fúngica. Función Planta Biol. 2010;37. https://doi.org/10. 1071/FP10067.

53. Bouton C, King RC, Chen H, Azhakanandam K, Bieri S, Hammond-Kosack KE, et al. Virus del mosaico de la cola de zorra: un vector viral para la expresión de proteínas en cereales. Fisiol vegetal. 2018;177. https://doi.org/10.1104/pp.17.01679.

54. Motteram J, Küfner I, Deller S, Brunner F, Hammond-Kosack KE, Nürnberger T, et al. Caracterización molecular y análisis funcional de MgNLP, la única proteína que contiene el dominio NPP1, del patógeno fúngico de la hoja de trigo mycosphaerella graminicola. Interacción Mol Planta-Microbio. 2009;22. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-7-0790.

55. Faris JD, Zhang Z, Lu H, Lu S, Reddy L, Cloutier S, et al. Un gen único similar a la resistencia a las enfermedades del trigo gobierna la susceptibilidad desencadenada por efectores a patógenos necrotróficos. Proc Natl Acad Sci EE.UU. A. 2010;107. https://doi. org/10.1094/MPMI-22-7-0790.

56. Lu Y, Deng J, Rhodes JC, Lu H, Lu LJ. Predicción de genes esenciales para identificar posibles objetivos farmacológicos en Aspergillus fumigatus. Computación Bioquímica. 2014;50. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2014.01.011.

57. Osmani AH, Oakley BR, Osmani SA. Identificación y análisis de genes esenciales de Aspergillus nidulans mediante la técnica de rescate de heterokaryon. Protocolo Nacional. 2006;1. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.406.

58. Hu W, Sillaots S, Lemieux S, Davison J, Kaufman S, Breton A, et al. Identificación de genes esenciales y priorización de objetivos farmacológicos en Aspergillus fumigatus. Patógeno PLoS. 2007;3. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 0030024.

59. Habig M, Quade J, Stukenbrock EH. El enfoque de la genética directa revela la importancia dependiente del genotipo del huésped de los cromosomas accesorios en el hongo patógeno del trigo Zymoseptoria tritici. MBio. 2017;8. https://doi. org/10.1128/mBio.01919-17.

60. Fouché S, Badet T, Oggenfuss U, Plissonneau C, Francisco CS, Croll D. Dinámica de desrepresión de elementos transponibles impulsada por el estrés y evolución de la virulencia en un patógeno fúngico. Mol Biol Evol. 2020;37. https://doi. org/10.1093/molbev/msz216.

61. Möller M, Habig M, Freitag M, Stukenbrock EH. Extraordinaria inestabilidad del genoma y reordenamientos cromosómicos generalizados durante el crecimiento vegetativo. Genética. 2018;210. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301050.

62. Bertazzoni S, Williams AH, Jones DA, Syme RA, Tan KC, Hane JK. Los accesorios componen el conjunto: cromosomas accesorios y otras regiones de ADN prescindibles en hongos fitopatógenos. Interacción Mol Planta-Microbio. 2018;31. https://doi.org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.

63. Krishnan P, Meile L, Plissonneau C, Ma X, Hartmann FE, Croll D, et al. Las inserciones de elementos transponibles dan forma a la regulación genética y la producción de melanina en un hongo patógeno del trigo. BMC Biol. 2018;16. https://doi. org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.

64. Sánchez-Vallet A, Tian H, Rodríguez-Moreno L, Valkenburg DJ, Saleem Batcha R, Wawra S, et al. Un efector LysM secretado protege las hifas fúngicas mediante la polimerización de homodímeros dependiente de quitina. Patógeno PLoS. 2020;16. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008652.

65. Breen S, Williams SJ, Winterberg B, Kobe B, Solomon PS. Las proteínas PR-1 del trigo son el objetivo de proteínas efectoras de patógenos necrotróficos. Planta J. 2016;88. https://doi.org/10.1111/tpj.13228.

66. Snelders NC, Petti GC, van den Berg GCM, Seidl MF, Thomma BPHJ. Una antigua proteína antimicrobiana cooptada por un patógeno vegetal fúngico para la manipulación del micobioma de las plantas. Proc Natl Acad Sci EE.UU. A. 2021;118. https://doi.org/10.1073/pnas.2110968118.

67. Snelders NC, Rovenich H, Petti GC, Rocafort M, van den Berg GCM, Vorholt JA, et al. Manipulación del microbioma por un patógeno vegetal fúngico transmitido por el suelo utilizando proteínas efectoras. Plantas Nat. 2020. https://doi.org/10. 1038/s41477-020-00799-5.

68. Rocha RO, Wilson RA. La nucleósido difosfato quinasa de Magnaporthe oryzae es necesaria para la homeostasis metabólica y la supresión de la inmunidad innata del huésped mediada por redox. Mol Microbiol. 2020;114. https://doi.org/10.1111/mmi.14580